Idea Transcript
A. PENDAHULUAN Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) adalah metode yang digunakan untuk memisahkan DNA yang berukuran besar. Metode ini pertama kali diperkenalkan pada tahun 1984 oleh Schwartz dan Cantor. Metode PFGE ini berbeda dengan elektroforesis agarosa konvensional karena orientasi dari medan elektrik memiliki periode dengan teratur. Keberagaman medan listrik inilah yang menyebabkan DNA yang berukuran besar dapat terpisah. Prinsip dari PFGE ini adalah dengan adanya pergantian voltase di setiap elektroda tersebut, maka DNA yang berukuran besar dapat terpisah dimana fragmen DNA yang berukuran kecil akan berjalan terlebih dahulu karena memiliki waktu orientasi yang lebih sedikit dibandingkan dengan fragmen DNA yang berukuran besar yang membutuhkan waktu orientasi yang lebih lama. Teknik PFGE ini dapat digunakan untuk menganalisis kekerabatan di antara galur bakteri yang berbeda namun masih dalam satu spesies, dan menjadi metode yang sangat efektif dalam mengestimasi ukuran genom serta mengkonstruksi peta restriksi dari suatu spesies. Memanipulasi DNA dan analisis sangat mendasar dalam bidang biologi molekuler. Memang, memisahkan campuran kompleks DNA menjadi fragmen-fragmen ukuran yang berbeda oleh elektroforesis adalah teknik yang teknik yang dianggap baik pada 1970-an. Biasanya, DNA diisolasi utuh dan kemudian diberikan enzim restriksi
1
untuk menghasilkan potongan-potongan kecil yang cukup untuk menyelesaikan melalui elektroforesis dalam agarosa atau akrilamida. Meskipun prosedur ini masih membentuk inti dari pemisahan DNA dan analisis di laboratorium saat ini telah mengalami perubahan.
Pada tahun 1984, Schwartz dan Cantor memperkenalkan cara baru untuk memisahkan DNA yakni dengan cara PFGE. Secara khusus, PFGE dapat menganalisis DNA yang sangat besar untuk pertama kalinya, menaikkan batas ukuran pemisahan DNA
pada
agarose
30-50
kb
ke
lebih
dari
10
Mb
(10.000
kb).
Hal ini dipublikasikan dan diinformasikan sebagail instrumentasi baru dan lebih baik daripada metode yang lain.
2
B. Aplikasi Aplikasi PFGE sangat luas dan beragam, diantaranya kloning DNA tanaman tingkat tinggi dengan menggunakan kromosom ragi buatan,
vektor kloning P1,
mengidentifikasi fragmen restriksi polimorfisme panjang, pembangunan peta fisik; mendeteksi kerusakan kromosom in vivo dan degradasi, dan menentukan jumlah dan ukuran kromosom
ragi, jamur, dan parasit seperti Leishmania, Plasmodium, dan
Trypanosoma.
C. Teori Meskipun teori elektroforesis medan berdenyut adalah menjadi bahan perdebatan, pemeriksaan kualitatif dapat dibuat mengenai pergerakan DNA dalam gel agarosa selama PFGE. Selama PFGE kontinyu, DNA di atas 30-50 kb bermigrasi dengan mobilitas yang sama tanpa melihat ukurannya. Ini terlihat dalam gel sebagai pita difusi tunggal yang besar. Namun, jika DNA dipaksa untuk mengubah arah selama elektroforesis, ukuran fragmen yang berbeda dalam pita ini menyebar mulai terpisah satu sama lain. Setiap reorientasi dari medan listrik relatif terhadap gel, DNA berukuran lebih kecil akan mulai bergerak ke arah baru lebih cepat daripada DNA yang lebih besar. Dengan demikian, DNA yang lebih besar tertinggal, terpisah dengan DNA yang lebih kecil. Saat ini, ada tiga model yang dicoba untuk menggambarkan perilaku DNA setelah PFGE, yang dikaji oleh Chu 1990, yaitu instrumentasi model reptation bias (BRM), model rantai, dan model tas (Chu, 1990, 1991 ).
3
D. Instrumentasi Meskipun banyak jenis instrumentasi PFGE yang tersedia, namun hanya dikategorikan menjadi dua saja. Peralatan yang paling sederhana adalah dirancang untuk elektroforesis gel inversi medan (FIGE) (Carle, et al, 1986.). FIGE bekerja dengan berkala membalik polaritas elektroda selama elektroforesis. Karena DNA subjek FIGE ke reorientasi 180o, DNA menghabiskan waktu tertentu bergerak mundur. Hanya medan listrik switching modul diperlukan; kotak gel standar vertikal atau horizontal yang memiliki kontrol suhu bisa digunakan untuk menjalankan gel.
Meskipun lebih kompleks dalam pendekatan, nol elektroforesis lapangan terpadu (ZIFE) (Turmel, et al, 1990.) Juga jatuh ke dalam kategori pertama. Dibandingkan dengan FIGE sederhana, ZIFE sangat lambat. Namun, ZIFE mampu menyelesaikan DNA lebih besar dan memberikan porsi yang bermanfaat lebih besar dari gel. Kategori lain berisi instrumen yang reorientasi DNA pada sudut miring yang lebih kecil, umumnya antara 96 dan 120ø. Hal ini menyebabkan DNA untuk selalu bergerak maju dalam pola zigzag ke gel. Untuk berbagai ukuran yang sama dalam kondisi yang optimal, pemisahan ini lebih cepat, menyelesaikan berbagai ukuran yang lebih luas, dan memberikan manfaat yang lebih besar dari gel dibandingkan dengan FIGE. Gambar 1: Elektrode konfigurasi digunakan PFGE. Contour-menjepit medan listrik homogen (CHEF) (Chu, et al, 1986, 1990.);
4
Bidang bolak melintang elektroforesis (TAFE) dan relatif ST / RIDEtm (Stratagene);. dan gel elektroforesis berputar (RGE) merupakan contoh teknik reorientasi sudut melintang yang umum diugunakan. Dalam elaborasi lebih lanjut dari prosedur di atas, Lai dan rekan-rekannya mengembangkan elektroforesis mandiri dikendalikan Programmable (PACE) unit yang memungkinkan kontrol penuh atas sudut reorientasi, tegangan, dan waktu switch.
Berbeda dengan FIGE, sistem ini membutuhkan kotak gel khusus dengan elektroda spesifik dan geometri gel, dan kontrol elektronik
untuk switching dan
pemrogram mennjalankan elektroforesis. Idealnya, DNA harus terpisah di jalur lurus untuk menyederhanakan perbandingan jalur-ke-jalur. Sistem ini menggunakan medan listrik homogen yang tidak menghasilkan jalur lurus, membuat interpretasi gel sulit (Schwartz dan Cantor, 1984). Pendekatan yang sederhana untuk jalur lurus FIGE, yang menggunakan elektroda sejajar dengan medan listrik yang homogen. Meskipun sangat berguna untuk memisahkan DNA yang relatif kecil, 4 - 1.000 kb (gbr. 2), reorientasi sudut 180o FIGE 5
tentang hasil dalam berbagai pemisahan yang paling berguna di bawah 2.000 kb. Selanjutnya, seperti teknik PFGE lain, FIGE telah inversi mobilitas di mana DNA yang lebih
besar
ke
inverse
DNA
yang
lebih
kecil
selama
elektroforesis.
Gambar 2. Peningkatan pemisahan kisaran 20-50 kb dengan elektroforesis gel inversi medan (FIGE). Jalankan kondisi: 230 V, 7,9 V / cm, 16 jam, 50 msec.. pulsa, maju: pulsa rasio reverse = 2,5:1, 1 GTG% agarose, TBE 0.5x, 10 Ca) 1 tangga kb, 0,512 kb; b) Lambda / Hind III, 0,5-23 kb, dan c) Berat molekuler, 8,3-48,5 kb. Ramping, dimana panjang pulsa reorientasi terus meningkat selama pemisahan, akan meminimalkan inversi. Kemampuan ini termasuk dalam instrumentasi yang paling akurat. Peningkatan kedua rentang pemisahan dan resolusi DNA besar membutuhkan reorientasi sudut kecil, umumnya 96-140ø, dengan 120ø paling umum. sudut kecil (misalnya, 100ø) meningkatkan mobilitas DNA umumnya kecil pengaruhnya terhadap resolusi. Batas bawah adalah sekitar 96ø. Di bawah ini, pemisahan yang dapat dilihat
6
TAFE dan ST / RIDEtm menggunakan geometri yang rumit antara elektroda dan vertikal ditempatkan gel untuk mendapatkan jalur lurus. CHEF dan RGE mempertahankan medan listrik homogen dalam kombinasi dengan gel horisontal. CHEF perubahan arah medan listrik elektronik ke reorientasi DNA dengan mengubah polaritas array elektroda. Dengan RGE medan listrik adalah tetap, untuk memindahkan DNA ke arah yang baru, gel cukup berputar.
Rotating Elektroforesis Gel (RGE) RGE adalah salah satu alat
terbaru dari peralatan PFGE
yang
menggabungkan variabel sudut dengan medan listrik homogen (Gambar 3 dan 4) Elektroda ditempatkan di sepanjang sisi yang berlawanan dari ruang buffer dengan polaritas mereka tetap. Secara singkat, gel di tempatkan pada piring berjalan melingkar dan kemudian ditempatkan di ruang buffer. gel ini digabungkan ke drive magnetik di bawah ruang buffer untuk menghilangkan kemungkinan kebocoran yang disebabkan hubungan langsung. Untuk memaksa DNA bermigrasi ke arah baru, drive magnetik hanya memutar gel ke sudut baru. Karena sudut reorientasi DNA ditentukan oleh 7
kopling mekanik secara langsung, RGE menawarkan banyak kelebihan termasuk biaya kecil. Tegangan, sudut, dan waktu pulsa bervariasi dengan program yang tersimpan dalam memori unit.
E. Preparasi Sampel Seiring dengan kemampuan untuk memisahkan DNA besar, diperlukan persiapan sampel baru dan prosedur penanganan. DNA besar (misal, kromosom ragi) adalah mudah dipotong dan sulit dipipet karena viskositasnya tinggi. Solusinya adalah pertama-tama menanamkan bakteri atau ragi dalam plugs agarose dan kemudian menambahkan
plugs dengan enzim untuk memprose
dinding sel dan protein,
sehingga membuat DNA terbuka tidak rusak di agarose tersebut. Plugs kemudian dipotong sesuai ukuran, diperlakukan dengan enzim restriksi jika perlu, dimuat dalam sampel dengan baik, dan disegel ke tempatnya dengan agarose.
F. Parameter Pemisahan Beberapa parameter yang berpengaruh selama PFGE berlangsung . Ini akan dibahas secara singkat di bawah ini yang terkait dengan instrumen lapangan melintang seperti RGE. Jumlah minimum informasi yang dibutuhkan untuk mengulang pemisahan harus mencakup deskripsi singkat tentang instrumentasi lapangan berdenyut yang digunakan; tegangan diterapkan dan kekuatan yang mempengaruhi medan (misalnya, 180 V pada 5,3 / cm V), panjang pulsa (misalnya, 87 detik); sudut reorientasi (misalnya, 120ø), penyangga (0.5x TBE); jenis dan konsentrasi agarosa (SeaKem Emas, 1,1%); ruang buffer suhu (misalnya, 10o), jenis standar (Clontech S. cerevisiae) dan, jika mungkin, jumlah DNA yang dimuat. Meskipun data yang tercantum di atas perlu selalu 8
mereproduksipemisahan..
Gambar 3. Rotating elektroforesis gel (RGE) pemisahan cerevisiae kromosom cercevisiae (2452190 kb). Jalankan kondisi: 180 V, 5,1 V / cm, 34 jam, 120 sudut, 60-120 detik.. pulsa jalan, 0.5x TBE, 1,2 GTG% agarose, 10 C. Dua sisi yang digunakan gel yang sama untuk menganalisis 32 sampel dari 72 sampel.
9
G. Pemisahan Area Kebanyakan sistem PFGE memisahkan DNA di daerah yang relatif kecil, membatasi resolusi sampel yang kompleks. RGE adalah pengecualian untuk ini, dengan jarak pemisahan sampai 20 cm dan ukuran gel maksimum 18 x 20 cm.
H. Kekuatan Medan Kekuatan medan memiliki efek mendalam pada bidang perpisahan berdenyut dan merupakan titik temu antara waktu pemisahan dan resolusi pada tingkat tertentu. Empat sampai enam volt / cm umumnya digunakan untuk menyelesaikan DNA sampai 2000 kb (misal, kromosom S. cerevisiae) dalam jangka waktu yang normal (misalnya, 1-2 hari). Namun, kekuatan medan
dapat menangkap DNA yang lebih
besar dalam agarosa, dan DNA> 3000 kb memerlukan 2 V / cm akan tetapi kurang sempurna pemisahannya.
I. Waktu Bunyi Perubahan waktu bunyi terjadi terutama pada berbagai ukuran pemisahan. Bunyi kali
lama menyebabkan pemisahan DNA yang lebih besar. Sebagai contoh,
sebesar 5,4 / cm V, 1,6 Mb dan 2,2 Mb dari kromosom S. cerevisiae terpisah sebagai
10
pita tunggal dengan lama bunyi 90 detik. Meningkatkan panjang bunyi menjadi 120 detik dan sudah menyelesaikan dua pita.
J. Buffer Dua buffer biasanya digunakan untuk PFGE - TAE dan TBE (1x TAE adalah 40 mM Tris asetat, 1 mM EDTA, pH 8,0; TBE 1x adalah 89 mM Tris, 89 mM asam borat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Keduanya digunakan pada ion yang relatif rendah untuk mencegah pemanasan dan buffer
0,25 dan 0.5x untuk menunjukkan
pengenceran relatif terhadap standar konsentrasi. Keuntungan penambahan larutan buffer rendah terhadap ion rendah adalah peningkatan mobilitas DNA. Misalnya, ketika menggunakan RGE untuk membandingkan buffer dan agaroses, menemukan bahwa penurunan baik TAE dan TBE menjadi 0,25 x memberikan mobilitas maksimum (4050% lebih cepat dari 1x). 0.25x bawah, mobilitas DNA turun.
L. Agarosa Jenis pemisahan agarosa juga mempengaruhi DNA, dengan mobilitas tercepat dan resolusi terbaik dicapai dalam gel yang terbuat dari electroendosmosis rendah (EEO) agarosa. Meskipun nilai elektroforesis agarosa paling standar cocok untuk PFGE, agarosa dengan EEO minimal akan memberikan pemisahan lebih cepat. EEO rendah Beberapa "nilai field berdenyut" yang tersedia, termasuk FastLane dan Gold
(FMC
Bioproducts),dan
11
Megarose
(Clontech).
Gambar 4. Rotating elektroforesis gel (RGE) pemisahan 3000 hingga 6000 kb DNA kromosom pombe Schizosaccharomyces. Jalankan kondisi: 50 V, 1,4 V / cm, 100 jam, 100 sudut, menjalankan beberapa concatamated: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5x TBE, 0,8% megarose (Clontech), 10 C. Konsentrasi agarosa mempengaruhi baik resolusi dan mobilitas DNA (Birren, et al, 1989;. Dan White, 1992). konsentrasi yang lebih tinggi agarosa hasil lebih tajam, tetapi lebih lambat band bergerak. Dan konsentrasi biasa digunakan (0,8-1,2%) merupakan tradeoff antara kecepatan dan resolusi. persentase Tinggi agarosa EEO rendah dapat meningkatkan resolusi tanpa mengorbankan kecepatan pemisahan (White, 1992).
M. Suhu Mobilitas DNA juga tergantung pada suhu pemisahan, suhu harus konstan selama berjalan. Walaupun mobilitas tinggi meningkatkan suhu DNA, ia melakukannya dengan mengorbankan resolusi
N. Kesimpulan
12
Sejak diperkenalkan lebih dari 8 tahun yang lalu, PFGE telah berkembang menjadi cara dan sangat bermanfaat
bagi ahli biologi molekuler. Hal ini tercermin
dalam ketersediaan metode secara manual. Bagaimana Masa Depan? Kemungkinan termasuk menggunakan bahan pemisahan baru atau yang ditingkatkan, dan melampaui batas ukuran saat @ 10 Mb. Laporan anekdotal menunjukkan pemisahan dalam kisaran
20
Mb
menyederhanakan
atau
mungkin pekerjaan
lebih
besar
rumit
yang,
tentang
yang
selanjutnya
pemetaan
akan
genom.
DAFTAR PUSTAKA
Anand, R., and Southern, E. M. (1990). Pulsed field gel electrophoresis. In Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach. (D. Rickwood and B.D. Hames, eds.), pp. 101- 123. IRL Press at Oxford University Press, New York. Birren, B., and Lai, E. (1993). Pulsed field electrophoresis: A practical guide. Academic Press, San Diego. Birren, B., and Lai, E., eds. (1990). "Methods: A Companion to Methods of Enzymology." Pulsed-Field Electrophoresis. Vol. 1, Number 2. Academic Press, San Diego. Birren, B., Hood, L., and Lai, E. (1989). "Pulsed field gel electrophoresis: Studies of DNA migration made with the programmable, autonomously-controlled electrode electrophoresis system." Electrophoresis 10, pp. 302-309. Birren, B.W., Lai, E., Clark, S.M., Hood, L., and Simon, M.I. (1988). "Optimized conditions for pulsed field gel electrophoretic separations of DNA." Nucleic Acids Research 16, pp. 7563-7582.
13
Butler, R., Ogilvie, D.J., Elvin, P., Riley, J.H., Finniear, R.S., Slynn, G., Morten, J.E.N., Markham, A.F., and Anand, R. (1992). Walking, cloning, and mapping with yeast artificial chromosomes: a contig encompassing D21S13 and D21S16. Carle, G.F., Frank, M., and Olson, M.V. (1986). "Electrophoretic separation of large DNA molecules by periodic inversion of the electric field." Science 232, pp. 65-68. Chu, G., Vollrath, D., and Davis, R.W. (1986). "Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields." Science 234, 1582-1585. Chu, G. (1991). "Bag model for DNA migration during pulsed-field electrophoresis." PNAS 88, 11071-11075. Chu, G. (1990). Pulsed-field electrophoresis: theory and practice. In Methods: A Companion to Methods of Enzymology. Pulsed-Field Electrophoresis (B. Birren and E. Lai, eds.), Vol. 1, No. 2, pp. 129-142. Academic Press, San Diego. Clark, S.M., Lai, E., Birren, B.W., and Hood, L. (1988). "A novel instrument for separating large DNA molecules with pulsed homogenous electric fields." Science 241, 1203-1205. Ecker, J. (1990). PFGE and YAC analysis of the Arabidopsis genome. In Methods: A Companion to Methods of Enzymology. PulsedField Electrophoresis (B. Birren and E. Lai, eds.), Vol. 1, No. 2, pp. 186-194. Academic Press, San Diego. Elia, M.C., DeLuca, J.G., and Bradley, M.O. (1991). "Significance and measurement of DNA double strand breaks in mammalian cells." Pharmacology & Therapeutics 51, pp. 291-327. Gardiner, K., Laas, W., and Patterson, D.S. (1986). "Fractionation of large mammalian DNA restriction fragments using vertical pulsed-field gradient gel electrophoresis." Somatic Cell Molec. Genet. 12, pp. 185-195. Gemmill, R.M. (1991). Pulsed field gel electrophoresis. In Advances of Electrophoresis (A. Chrambach, M.J. Dunn, and B.J. Radola, eds.), Vol. 4, pp. 1-48. VCH, Weinheim, Germany. Serwer, P. and Dunn, F. J. (1990). "Rotating gels: why, how, and what." In Methods: A Companion to Methods of Enzymology. PulsedField Electrophoresis (B. Birren and E. Lai, eds.), Vol. 1, No. 2, pp. 143-150. Academic Press, San Diego. Schwartz, D.C., and Cantor, C.R. (1984). "Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis." Cell 37, pp. 67-75.
14
Southern, E.M., Anand, R., Brown, W.R.A., and Fletcher, D.S. (1987). "A model for the separation of large DNA molecules by crossed field gel electrophoresis." Nucleic Acids Res. 15, 5925- 5943. Turmel, C., Brassard, E., Forsyth, R., Hood, K., Slater, G.W., and Noolandi, J. (1990). High-resolution zero integrated field electrophoresis of DNA. In "Electrophoresis of Large DNA Molecules:Theory and Applications" (E. Lai and B. Birren, eds), Current Communication in Cell & Molecular Biology Vol. 1, pp. 101-131. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Van Daelen, R.A.J., and Zabel, P. (1991). Preparation of high molecular weight plant DNA and analysis by pulsed-field gel electrophoresis. In Plant Molecular Biology Manual (S.B. Gelvin, R.A. Schilperoort, and D.P.S. Verma, eds.), pp. A15/1-25. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. White, H.W. (1992). "Rapid separation of DNA molecules by agarose gel electrophoresis: use of a new agarose matrix and a survey of running buffer effects." Biotechniques 12, pp. 574-579.
MATA KULIAH : BIOLOGI MOLEKULER LANJUTAN DOSEN : PROF. dr. MUH. NASRUM MASSI, Ph.D.
PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE)
OLEH JANGGA P0200310024
15
PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2011
16
17
Pulsed Field Electrophoresis for Separation of Large DNA Published in Probe Volume 2(3): Fall 1992
Barbara Joppa, Research Technician Samantha Li, Research Technician Scott Cole, Research Technician Sean Gallagher, Director HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA Manipulating and analyzing DNA are fundamentals in the field of molecular biology. Indeed, separating complex mixtures of DNA into different sized fragments by electrophoresis was a well established technique by the early 1970's. Typically, DNA was isolated intact and then treated with restriction enzymes to generate pieces small enough to resolve by electrophoresis in agarose or acrylamide. Although this procedure
18
still forms the core of DNA separation and analysis in today's laboratories, the rules of the separation have changed. In 1984, Schwartz and Cantor described pulsed field gel electrophoresis (PFGE), introducing a new way to separate DNA. In particular, PFGE resolved extremely large DNA for the first time, raising the upper size limit of DNA separation in agarose from 30-50 kb to well over 10 Mb (10,000 kb). After this initial report, a succession of papers described new and improved instrumentation and methods. As a result, routine procedures and several commercial pulsed field units are currently available. Now, instead of cloning a large number of small fragments of DNA, PFGE permits cloning and analysis of a smaller number of very large pieces of a genome. Applications Applications of PFGE are numerous and diverse (Gemmill, 1991; Birren and Lai, 1990, 1993; and Van Daelen and Zabel, 1991). These include cloning large plant DNA using yeast artificial chromosomes (YAC's) (Ecker, 1990; see also Probe, Vol. 1, No. 1/2; and Butler, et al., 1992) and P1 cloning vectors (see Probe, Vol. 1, No. 3/4); identifying restriction fragment length polymorphisms (RFLP's) and construction of physical maps; detecting in vivo chromosome breakage and degradation (Elia, et al., 1991); and determining the number and size of chromosomes ("electrophoretic karyotype") from yeasts, fungi, and parasites such as Leishmania, Plasmodium, and Trypanosoma. Theory Although the theory of pulsed field electrophoresis is a matter of debate, qualitative statements can be made about the movement of DNA in agarose gels during PFGE. During continuous field electrophoresis, DNA above 30-50 kb migrates with the same mobility regardless of size. This is seen in a gel as a single large diffuse band. If, however, the DNA is forced to change direction during electrophoresis, different sized fragments within this diffuse band begin to separate from each other. With each reorientation of the electric field relative to the gel, smaller sized DNA will begin moving in the new direction more quickly than the larger DNA. Thus, the larger DNA lags behind, providing a separation from the smaller DNA. Currently, there are three models that attempt to describe the behavior of DNA during PFGE (reviewed by Chu, 1990), the biased reptation model (BRM), the chain model, and, most recently, the bag model (Chu, 1990, 1991). Instrumentation Although many types of PFGE instrumentation are available (fig. 1), they generally fall into two categories. The simplest equipment is designed for field inversion gel electrophoresis (FIGE) (Carle, et al., 1986). FIGE works by periodically inverting the polarity of the electrodes during 19
electrophoresis. Because FIGE subjects DNA to a 180ø reorientation, the DNA spends a certain amount of time moving backwards. Only an electrical field switching module is needed; any standard vertical or horizontal gel box that has temperature control can be used to run the gel. Although more complex in its approach, zero integrated field electrophoresis (ZIFE) (Turmel, et. al, 1990) also falls into this first category. Compared with simple FIGE, ZIFE is very slow. However, ZIFE is capable of resolving larger DNA and giving a larger useful portion of the gel. The other category contains instruments that reorient the DNA at smaller oblique angle, generally between 96 and 120ø. This causes DNA to always move forward in a zigzag pattern down the gel. For a similar size range under optimal conditions, these separations are faster, resolve a wider size range, and give a larger useful portion of the gel compared to FIGE. Figure 1:Electrode configuration of commonly used pulsed field gel electrophpresis units. Contour-clamped homogeneous electric field (CHEF) (Chu, et al., 1986, 1990);
20
transverse alternating field electrophoresis (TAFE) (Gardiner, et al., 1986) and its relative ST/RIDEtm (Stratagene); and rotating gel electrophoresis (RGE) (Southern, et al., 1987; Anand and Southern, 1990; Gemmill, 1991; and Serwer and Dunn, 1990) are all examples of commonly used transverse angle reorientation techniques for which instrumentation is available. In a further elaboration of the above procedures, Lai and coworkers developed the programmable autonomously controlled electrophoresis (PACE) unit which allows complete control over reorientation angle, voltage, and switch time (Clark, et al., 1988; and Birren, et al., 1989). In contrast with FIGE, these systems require both a special gel box with a specific electrode and gel geometry, and the associated electronic control for switching and programming the electrophoresis run. Ideally, the DNA should separate in straight lanes to simplify lane-to-lane comparisons. The original pulsed-field systems used inhomogeneous electric fields that did not produce straight lanes, making interpretation of gels difficult (Schwartz and Cantor, 1984). Again, the simplest approach to straight lanes is FIGE, which uses parallel electrodes to assure a homogeneous electric field. Although extremely useful for separating relatively small DNA, 4- 1,000 kb (fig. 2), FIGE's reorientation angle of 180ø results in a separation range most useful under 2,000 kb. Furthermore, like other PFGE techniques, FIGE has mobility inversions in which larger DNA can move ahead of smaller DNA during electrophoresis. Figure 2. Increased separation of the 20-50 kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE). Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16 hrs., 50 msec. pulse, forward:reverse pulse ratio = 2.5:1, 1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10 C.a) 1 kb ladder, 0.5-12 kb; b) Lambda/Hind III, 0.5-23 kb; and c) High molecular weight markers, 8.3-48.5 kb. Ramping, where the reorientation pulse length is constantly increased during separation, will minimize inversions. This capability is included in most commercial instrumentation. Increasing both the separation range and the resolution of large DNA requires smaller reorientation angles, generally 96-140ø, with 120ø most common. Smaller angles (e.g., 100ø) increase the mobility of the DNA generally without seriously affecting resolution. The lower limit is approximately 96ø. Below this, separation is seriously compromised.
21
TAFE and ST/RIDEtm use a complicated geometry between the electrodes and a vertically placed gel to get straight lanes. CHEF and RGE maintain a homogeneous electric field in combination with a horizontal gel. CHEF changes the direction of the electric field electronically to reorient the DNA by changing the polarity of an electrode array. With RGE the electric field is fixed; to move the DNA in a new direction, the gel simply rotates.
Rotating Gel Electrophoresis RGE is one of the most recent commercial introductions of pulsed field equipment and combines variable angles with a homogeneous electric field (figs. 3 and 4) (Southern, et al., 1987; Anand and Southern, 1990; Serwer and Dunn, 1990; and Gemmill, 1991). The electrodes are positioned along opposite sides of the buffer chamber with their polarity fixed. Briefly, the gel is cast on a circular running plate and then placed in the buffer chamber. The gel is coupled to a magnetic drive beneath the buffer chamber to eliminate the possibility of leakage that a direct connection might cause. To force the migrating DNA to a new direction, the magnetic drive simply rotates the gel to the new angle. Because the reorientation angle of the DNA is determined by a straightforward 22
mechanical coupling, RGE offers a lot of flexibility at a reduced cost. Voltage, angle, and pulse times are varied with the program stored into memory of the unit. Sample Preparation Along with the ability to separate large DNA came the need for new sample preparation and handling procedures. Large DNA (e.g., yeast chromosomes) is easily sheared and also difficult to pipet due to its high viscosity. The solution to this problem is to first embed the bacteria or yeast in agarose plugs and then treat the plugs with enzymes to digest away the cell wall and proteins, thus leaving the naked DNA undamaged in the agarose. The plugs then are cut to size, treated with restriction enzymes if necessary, loaded in the sample well, and sealed into place with agarose. Separation Parameters Several parameters act in concert during PFGE (Southern, et al., 1987; Anand and Southern, 1990; Birren, 1989; and Gemmill, 1991). These will be discussed briefly below as they relate to transverse field instruments such as RGE. The minimum amount of information needed to repeat a separation should include a short description of the pulsed field instrumentation used; applied voltage and field strength (e.g., 180 V at 5.3 V/cm); pulse length (e.g., 87 seconds); reorientation angle (e.g., 120ø); the buffer (0.5X TBE); the agarose type and concentration (SeaKem Gold, 1.1%); the buffer chamber temperature (e.g., 10ø); the type of standards (Clontech S. cerevisiae); and, if possible, the amount of DNA loaded. Although the data listed above is necessary to faithfully reproduce a separation, the information supplied in publications is rarely this complete. Figure 3. Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load
23
32 samples, a possible
maximum of 72 are
Separation Area Most PFGE systems separate DNA over a relatively small area, limiting the resolution of complex samples. RGE is an exception to this, with a useful separation distance up to 20 cm and a maximum gel size of 18 x 20 cm. Field Strength The field strength has a profound effect on pulsed field separations and is a compromise between separation time and resolution of a particular size class. Four to six volts/cm is generally required for resolving DNA up to 2000 kb (e.g., S. cerevisiae chromosomes) in a reasonable period of time (e.g., 1-2 days). However, these field strengths trap and immobilize even bigger DNA in the agarose matrix, and DNA > 3000 kb requires 2 V/cm or less for separation. Pulse Time Pulse time primarily changes the size range of separation. Longer pulse times lead to separation of larger DNA. For example, at 5.4 V/cm, the 1.6 Mb and 2.2 Mb chromosomes from S. cerevisiae separate as a single band with 90-second pulse length. Increasing the pulse length to 120 seconds resolves these into two bands (Gemmill, 1991).
24
Reorientation Angle Any angle between 96 and 165ø produces roughly equivalent separation (Birren, et al., 1988; and Gemmill, 1991). The smaller the angle, however, the faster the DNA mobility. And for separating extremely large DNA, 96 to 105ø is almost a requirement to get a good separation in the shortest possible time. Buffers Two buffers are commonly employed for PFGE--TAE and TBE (1x TAE is 40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0; 1x TBE is 89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0). Both are used at a relatively low ionic strength to prevent heating and carry the designations of either 0.25 and 0.5x to indicate the dilution relative to the standard concentration. An added benefit to low ionic strength buffers is an increase in DNA mobility. For example, while using RGE to compare various buffers and agaroses, White (1992) found that lowering both TAE and TBE to 0.25 x gave the maximum mobility (40-50% faster than 1x). Below 0.25x, the DNA mobility dropped off. Agarose The type of agarose also affects DNA separation, with the fastest mobilities and best resolution achieved in gels made of low electroendosmosis (EEO) agarose (Birren, et al., 1989; and White, 1992). Although most standard electrophoresis grades of agarose are suitable for PFGE (e.g., SeaKem GTG), agarose with minimal EEO will provide a faster separation. Several low EEO "pulsed field grades" are available, including FastLane and Gold (FMC BioProducts), and Megarose (Clontech). Figure 4. Rotating gel electrophoresis (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA Schizosaccharomyces pombe chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose (Clontech), 10 C. The concentration of agarose affects both the resolution and mobility of the DNA (Birren, et al., 1989; and White, 1992). Higher concentrations of agarose yield sharper, but slower moving bands. And the typical concentrations used (0.8-1.2%) represent a tradeoff between speed and resolution. High percentages of low EEO agarose may improve resolution without sacrificing the speed of separation (White, 1992).
25
Temperature Because DNA mobility also depends on the separation temperature, the temperature must be constant both during and between runs. Although higher temperatures increase DNA mobility, it does so at the expense of resolution (Birren, et al., 1989; and Gemmill, 1991). Conclusion Since its introduction over 8 years ago, PFGE has evolved into a routine, pragmatic technique for molecular biologists. This is reflected in the present availability of methods chapters and manuals (e.g., Birren and Lai, 1990, 1993; Anand and Southern, 1990; Van Daelen and Zabel, 1991). What does the future hold? Possibilities include using a new or improved separation material, and going beyond the current size limit of @ 10 Mb. Anecdotal reports suggest separations in the range of 20 Mb or larger are possible, which would further simplify the complex task of genome mapping.
26
For more information on Hoefer's HulaGeltm rotating gel electrophoresis unit, contact Technical Services at Hoefer Scientific Instruments at (415) 282-2307 or 800-227-4750. References Anand, R., and Southern, E. M. (1990). Pulsed field gel electrophoresis. In Gel Electrophoresis of Nucleic Acids: A Practical Approach. (D. Rickwood and B.D. Hames, eds.), pp. 101- 123. IRL Press at Oxford University Press, New York. Birren, B., and Lai, E. (1993). Pulsed field electrophoresis: A practical guide. Academic Press, San Diego. Birren, B., and Lai, E., eds. (1990). "Methods: A Companion to Methods of Enzymology." Pulsed-Field Electrophoresis. Vol. 1, Number 2. Academic Press, San Diego. Birren, B., Hood, L., and Lai, E. (1989). "Pulsed field gel electrophoresis: Studies of DNA migration made with the programmable, autonomously-controlled electrode electrophoresis system." Electrophoresis 10, pp. 302-309. Birren, B.W., Lai, E., Clark, S.M., Hood, L., and Simon, M.I. (1988). "Optimized conditions for pulsed field gel electrophoretic separations of DNA." Nucleic Acids Research 16, pp. 7563-7582. Butler, R., Ogilvie, D.J., Elvin, P., Riley, J.H., Finniear, R.S., Slynn, G., Morten, J.E.N., Markham, A.F., and Anand, R. (1992). Walking, cloning, and mapping with yeast artificial chromosomes: a contig encompassing D21S13 and D21S16. Carle, G.F., Frank, M., and Olson, M.V. (1986). "Electrophoretic separation of large DNA molecules by periodic inversion of the electric field." Science 232, pp. 65-68. Chu, G., Vollrath, D., and Davis, R.W. (1986). "Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields." Science 234, 1582-1585. Chu, G. (1991). "Bag model for DNA migration during pulsed-field electrophoresis." PNAS 88, 11071-11075. Chu, G. (1990). Pulsed-field electrophoresis: theory and practice. In Methods: A Companion to Methods of Enzymology. Pulsed-Field Electrophoresis (B. Birren and E. Lai, eds.), Vol. 1, No. 2, pp. 129-142. Academic Press, San Diego. Clark, S.M., Lai, E., Birren, B.W., and Hood, L. (1988). "A novel instrument for separating large DNA molecules with pulsed homogenous electric fields." Science 241, 1203-1205.
27
Ecker, J. (1990). PFGE and YAC analysis of the Arabidopsis genome. In Methods: A Companion to Methods of Enzymology. PulsedField Electrophoresis (B. Birren and E. Lai, eds.), Vol. 1, No. 2, pp. 186-194. Academic Press, San Diego. Elia, M.C., DeLuca, J.G., and Bradley, M.O. (1991). "Significance and measurement of DNA double strand breaks in mammalian cells." Pharmacology & Therapeutics 51, pp. 291-327. Gardiner, K., Laas, W., and Patterson, D.S. (1986). "Fractionation of large mammalian DNA restriction fragments using vertical pulsed-field gradient gel electrophoresis." Somatic Cell Molec. Genet. 12, pp. 185-195. Gemmill, R.M. (1991). Pulsed field gel electrophoresis. In Advances of Electrophoresis (A. Chrambach, M.J. Dunn, and B.J. Radola, eds.), Vol. 4, pp. 1-48. VCH, Weinheim, Germany. Serwer, P. and Dunn, F. J. (1990). "Rotating gels: why, how, and what." In Methods: A Companion to Methods of Enzymology. PulsedField Electrophoresis (B. Birren and E. Lai, eds.), Vol. 1, No. 2, pp. 143-150. Academic Press, San Diego. Schwartz, D.C., and Cantor, C.R. (1984). "Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis." Cell 37, pp. 67-75. Southern, E.M., Anand, R., Brown, W.R.A., and Fletcher, D.S. (1987). "A model for the separation of large DNA molecules by crossed field gel electrophoresis." Nucleic Acids Res. 15, 5925- 5943. Turmel, C., Brassard, E., Forsyth, R., Hood, K., Slater, G.W., and Noolandi, J. (1990). High-resolution zero integrated field electrophoresis of DNA. In "Electrophoresis of Large DNA Molecules:Theory and Applications" (E. Lai and B. Birren, eds), Current Communication in Cell & Molecular Biology Vol. 1, pp. 101-131. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Van Daelen, R.A.J., and Zabel, P. (1991). Preparation of high molecular weight plant DNA and analysis by pulsed-field gel electrophoresis. In Plant Molecular Biology Manual (S.B. Gelvin, R.A. Schilperoort, and D.P.S. Verma, eds.), pp. A15/1-25. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands. White, H.W. (1992). "Rapid separation of DNA molecules by agarose gel electrophoresis: use of a new agarose matrix and a survey of running buffer effects." Biotechniques 12, pp. 574-579.
28
Berdenyut Lapangan Elektroforesis untuk Pemisahan DNA Besar Published in Probe Volume 2 (3): Fall 1992 ________________________________________ Barbara Yope, Teknisi Penelitian Samantha Li, Teknisi Penelitian Scott Cole, Teknisi Penelitian Sean Gallagher, Direktur Laboratorium HSI, Hoefer Instrumen Ilmiah San Francisco, CA Memanipulasi DNA dan analisa adalah fundamental dalam bidang biologi molekuler. Memang, memisahkan campuran kompleks DNA menjadi fragmen-fragmen ukuran yang berbeda oleh elektroforesis adalah teknik yang mapan pada 1970-an. Biasanya, DNA diisolasi utuh dan kemudian diobati dengan enzim restriksi untuk menghasilkan potongan-potongan kecil yang cukup untuk menyelesaikan melalui elektroforesis dalam agarosa atau akrilamida. Meskipun prosedur ini masih membentuk inti dari pemisahan DNA dan analisis di laboratorium hari ini, aturan pemisahan telah berubah. Pada tahun 1984, Schwartz dan Cantor dijelaskan berdenyut lapangan elektroforesis gel (PFGE), memperkenalkan cara baru untuk DNA terpisah. Secara khusus, PFGE diselesaikan DNA yang sangat besar untuk pertama kalinya, menaikkan batas ukuran atas pemisahan DNA pada agarose 30-50 kb ke lebih dari 10 Mb (10.000 kb). Setelah laporan awal, suksesi kertas dijelaskan instrumentasi baru dan lebih baik dan metode. Akibatnya, prosedur rutin dan beberapa unit lapangan berdenyut komersial saat ini tersedia. Sekarang, bukannya kloning sejumlah besar fragmen kecil dari DNA, PFGE izin kloning dan analisis dari sejumlah kecil potongan yang sangat besar genom. Aplikasi Aplikasi PFGE sangat banyak dan beragam (Gemmill, 1991; Birren dan Lai, 1990, 1993; dan Van Daelen dan Zabel, 1991). Ini termasuk kloning DNA tanaman besar dengan menggunakan kromosom ragi buatan (YAC's) (Ecker, 1990, lihat juga Probe, Vol 1, No 1 / 2,.. Dan Butler, et al, 1992) dan vektor kloning P1 (lihat Probe, Vol . 1, No 3 / 4); mengidentifikasi polimorfisme panjang fragmen restriksi (RFLP) dan pembangunan peta fisik; mendeteksi kerusakan kromosom di vivo dan degradasi (Elia, et al, 1991);. dan menentukan jumlah dan ukuran kromosom ( "elektroforetik kariotipe") dari ragi, jamur, dan parasit seperti Leishmania, Plasmodium, dan Trypanosoma. Teori Meskipun teori elektroforesis medan berdenyut adalah menjadi bahan perdebatan, pernyataan kualitatif dapat dibuat tentang pergerakan DNA dalam gel agarosa selama PFGE. Selama lapangan elektroforesis kontinyu, DNA di atas 30-50 kb bermigrasi dengan mobilitas yang sama tanpa memandang ukurannya. Ini terlihat dalam gel sebagai band diffuse tunggal yang besar. Namun, jika DNA dipaksa untuk mengubah arah selama elektroforesis, ukuran fragmen yang berbeda dalam band ini menyebar mulai terpisah dari satu sama lain. Dengan setiap reorientasi dari medan listrik relatif terhadap gel, DNA berukuran lebih kecil akan mulai bergerak ke arah baru lebih cepat daripada DNA yang lebih besar. Dengan demikian, DNA 29
yang lebih besar tertinggal, memberikan pemisahan dari DNA yang lebih kecil. Saat ini, ada tiga model yang mencoba untuk menggambarkan perilaku DNA selama PFGE (dikaji oleh Chu, 1990), model reptation bias (BRM), model rantai, dan, terakhir, model tas (Chu, 1990, 1991 ). Instrumentasi Meskipun banyak jenis instrumentasi PFGE tersedia (gbr. 1), mereka umumnya jatuh ke dalam dua kategori. Peralatan yang paling sederhana adalah dirancang untuk elektroforesis gel inversi medan (FIGE) (Carle, et al, 1986.). FIGE bekerja dengan berkala membalik polaritas elektroda selama elektroforesis. Karena DNA subjek FIGE ke reorientasi 180o, DNA menghabiskan waktu tertentu bergerak mundur. Hanya medan listrik switching modul diperlukan; sembarang kotak gel standar vertikal atau horizontal yang memiliki kontrol suhu bisa digunakan untuk menjalankan gel. Meskipun lebih kompleks dalam pendekatan, nol elektroforesis lapangan terpadu (ZIFE) (Turmel, et al, 1990.) Juga jatuh ke dalam kategori pertama. Dibandingkan dengan FIGE sederhana, ZIFE sangat lambat. Namun, ZIFE mampu menyelesaikan DNA lebih besar dan memberikan porsi yang bermanfaat lebih besar dari gel. Kategori lain berisi instrumen yang reorientasi DNA pada sudut miring yang lebih kecil, umumnya antara 96 dan 120ø. Hal ini menyebabkan DNA untuk selalu bergerak maju dalam pola zigzag ke gel. Untuk berbagai ukuran yang sama dalam kondisi yang optimal, pemisahan ini lebih cepat, menyelesaikan berbagai ukuran yang lebih luas, dan memberikan sebagian manfaat yang lebih besar dari gel dibandingkan dengan FIGE. Gambar 1: elektrode konfigurasi umum digunakan unit gel lapangan electrophpresis berdenyut. Contour-menjepit medan listrik homogen (CHEF) (Chu, et al, 1986, 1990.);
gambarrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
melintang lapangan elektroforesis bolak (TAFE) (Gardiner, et al, 1986.) dan relatif ST / RIDEtm (Stratagene);. dan berputar elektroforesis gel (RGE) (Selatan, et al, 1987; Anand dan Selatan, 1990; Gemmill, 1991; dan Serwer dan Dunn, 1990) merupakan contoh yang umum digunakan teknik reorientasi sudut melintang yang instrumentasi tersedia. Dalam elaborasi lebih lanjut dari prosedur di atas, Lai dan rekan kerja mengembangkan elektroforesis mandiri dikendalikan Programmable (PACE) unit yang memungkinkan kontrol penuh atas sudut reorientasi, tegangan, dan waktu switch (Clark, et al, 1988;. Dan Birren, et al. , 1989). Berbeda dengan FIGE, sistem ini membutuhkan baik kotak gel khusus dengan elektroda spesifik dan geometri gel, dan kontrol elektronik terkait untuk switching dan pemrograman jalankan elektroforesis. Idealnya, DNA harus terpisah di jalur lurus untuk menyederhanakan perbandingan jalur-ke-jalur. The berdenyut-field asli sistem yang digunakan medan listrik homogen yang tidak menghasilkan jalur lurus, membuat interpretasi gel sulit (Schwartz dan Cantor, 1984). Sekali lagi, pendekatan 30
yang sederhana untuk jalur lurus FIGE, yang menggunakan elektroda sejajar dengan menjamin medan listrik homogen. Meskipun sangat berguna untuk memisahkan DNA yang relatif kecil, 4 - 1.000 kb (gbr. 2), reorientasi sudut 180o FIGE tentang hasil dalam berbagai pemisahan yang paling berguna di bawah 2.000 kb. Selanjutnya, seperti teknik PFGE lain, FIGE telah inversi mobilitas di mana DNA yang lebih besar dapat bergerak maju DNA yang lebih kecil selama elektroforesis. Gambar 2. Peningkatan pemisahan kisaran 20-50 kb dengan elektroforesis gel inversi medan (FIGE). Jalankan kondisi: 230 V, 7,9 V / cm, 16 jam, 50 msec.. pulsa, maju: pulsa rasio reverse = 2,5:1, 1 GTG% agarose, TBE 0.5x, 10 Ca) 1 tangga kb, 0,5-12 kb; b) Lambda / Hind III, 0,5-23 kb, dan c) Tinggi molekuler berat spidol, 8,3-48,5 kb. Ramping, dimana panjang pulsa reorientasi terus meningkat selama pemisahan, akan meminimalkan inversi. Kemampuan ini termasuk dalam instrumentasi yang paling komersial. Peningkatan kedua rentang pemisahan dan resolusi DNA besar membutuhkan reorientasi sudut kecil, umumnya 96-140ø, dengan 120ø paling umum. sudut kecil (misalnya, 100ø) meningkatkan mobilitas DNA umumnya tanpa serius mempengaruhi resolusi. Batas bawah adalah sekitar 96ø. Di bawah ini, pemisahan serius dikompromikan.
Gambarrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
TAFE dan ST / RIDEtm menggunakan geometri yang rumit antara elektroda dan vertikal ditempatkan gel untuk mendapatkan jalur lurus. CHEF dan RGE mempertahankan medan listrik homogen dalam kombinasi dengan gel horisontal. CHEF perubahan arah medan listrik elektronik ke reorientasi DNA dengan mengubah polaritas array elektroda. Dengan RGE medan listrik adalah tetap, untuk memindahkan DNA ke arah yang baru, gel cukup berputar. Rotating Elektroforesis Gel RGE adalah salah satu perkenalan komersial terbaru dari peralatan lapangan berdenyut dan menggabungkan variabel sudut dengan medan listrik homogen (Gambar 3 dan 4) (Selatan, et al, 1987;. Anand dan Selatan, 1990; Serwer dan Dunn, 1990; dan Gemmill, 1991). Elektroda ditempatkan di sepanjang sisi yang berlawanan dari ruang buffer dengan polaritas mereka tetap. Secara singkat, gel adalah dilemparkan pada piring berjalan melingkar dan kemudian ditempatkan di ruang buffer. gel ini digabungkan ke drive magnetik di bawah ruang buffer untuk menghilangkan kemungkinan kebocoran yang koneksi langsung dapat menyebabkan. Untuk memaksa DNA bermigrasi ke arah baru, drive magnetik hanya berputar gel 31
ke sudut baru. Karena sudut reorientasi DNA ditentukan oleh kopling mekanik langsung, RGE menawarkan banyak fleksibilitas dengan biaya berkurang. Tegangan, sudut, dan waktu pulsa bervariasi dengan program yang tersimpan dalam memori unit. Preparasi Sampel Seiring dengan kemampuan untuk memisahkan DNA besar datang kebutuhan untuk persiapan sampel baru dan prosedur penanganan. DNA besar (misal, kromosom ragi) adalah mudah dicukur dan juga sulit untuk pipet karena viskositas tinggi. Solusi untuk masalah ini adalah pertama-tama menanamkan bakteri atau ragi dalam plugs agarose dan kemudian memperlakukan plugs dengan enzim untuk mencerna menjauh dinding sel dan protein, sehingga membuat DNA telanjang tidak rusak di agarose tersebut. Plugs kemudian dipotong sesuai ukuran, diperlakukan dengan enzim restriksi jika perlu, dimuat dalam sampel dengan baik, dan disegel ke tempatnya dengan agarose. Pemisahan Parameter Beberapa parameter bertindak dalam konser selama PFGE (Selatan, et al, 1987;. Anand dan Selatan, 1990; Birren, 1989; dan Gemmill, 1991). Ini akan dibahas secara singkat di bawah ini karena terkait dengan instrumen lapangan melintang seperti RGE. Jumlah minimum informasi yang dibutuhkan untuk mengulang perpisahan harus mencakup deskripsi singkat tentang instrumentasi lapangan berdenyut digunakan; tegangan diterapkan dan kekuatan medan (misalnya, 180 V pada 5,3 / cm V), panjang pulsa (misalnya, 87 detik); sudut reorientasi (misalnya, 120ø), penyangga (0.5x TBE); jenis dan konsentrasi agarosa (SeaKem Emas, 1,1%); ruang buffer suhu (misalnya, 10o), jenis standar (Clontech S. cerevisiae) dan, jika mungkin, jumlah DNA yang dimuat. Meskipun data yang tercantum di atas perlu setia mereproduksi pemisahan, informasi yang diberikan dalam publikasi jarang ini selesai. Gambar 3. Rotating elektroforesis gel (RGE) pemisahan cerevisiae kromosom cercevisiae (245-2190 kb). Jalankan kondisi: 180 V, 5,1 V / cm, 34 jam, 120 sudut, 60-120 detik.. pulsa jalan, 0.5x TBE, 1,2 GTG% agarose, 10 C. Dua sisir yang digunakan pada gel yang sama untuk me-load
Gambarrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrrr
32 sampel, maksimal 72 yang mungkin Pemisahan Area Kebanyakan sistem PFGE terpisah DNA di daerah yang relatif kecil, membatasi resolusi sampel yang kompleks. RGE adalah pengecualian untuk ini, dengan jarak pemisahan yang berguna sampai 20 cm dan ukuran gel maksimum 18 x 20 cm. Field Strength Kekuatan medan memiliki efek mendalam pada bidang perpisahan berdenyut dan merupakan kompromi antara waktu pemisahan dan resolusi kelas ukuran tertentu. Empat sampai enam volt / cm umumnya diwajibkan untuk menyelesaikan DNA 32
sampai dengan 2000 kb (misal, kromosom S. cerevisiae) dalam jangka waktu yang wajar (misalnya, 1-2 hari). Namun, lapangan kekuatan perangkap dan melumpuhkan DNA yang lebih besar dalam agarosa, dan DNA> 3000 kb memerlukan 2 V / cm atau kurang untuk pemisahan. Pulse Waktu Pulse waktu terutama perubahan berbagai ukuran pemisahan. pulsa kali lebih lama menyebabkan pemisahan DNA yang lebih besar. Sebagai contoh, sebesar 5,4 / cm V, 1,6 Mb dan 2,2 Mb dari kromosom S. cerevisiae terpisah sebagai band tunggal dengan panjang pulsa 90 detik. Meningkatkan panjang pulsa untuk 120 detik menyelesaikan ini menjadi dua band (Gemmill, 1991).
Reorientasi Angle Setiap sudut antara 96 dan 165ø menghasilkan sekitar pemisahan setara (Birren, et al, 1988;. Dan Gemmill, 1991). Semakin kecil sudut, bagaimanapun, semakin cepat mobilitas DNA. Dan untuk memisahkan DNA yang sangat besar, 96 untuk 105ø hampir satu persyaratan untuk mendapatkan pemisahan yang baik dalam waktu sesingkat mungkin. Buffer Dua buffer biasanya digunakan untuk PFGE - TAE dan TBE (1x TAE adalah 40 mM Tris asetat, 1 mM EDTA, pH 8,0; TBE 1x adalah 89 mM Tris, 89 mM asam borat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Keduanya digunakan pada kekuatan ion yang relatif rendah untuk mencegah pemanasan dan membawa sebutan baik 0,25 dan 0.5x untuk menunjukkan pengenceran relatif terhadap konsentrasi standar. Keuntungan ditambahkan ke buffer rendah kekuatan ion adalah peningkatan mobilitas DNA. Misalnya, ketika menggunakan RGE untuk membandingkan berbagai buffer dan agaroses, White (1992) menemukan bahwa penurunan baik TAE dan TBE menjadi 0,25 x memberikan mobilitas maksimum (40-50% lebih cepat dari 1x). 0.25x bawah, mobilitas DNA turun. Agarosa Jenis pemisahan agarosa juga mempengaruhi DNA, dengan Mobilitas tercepat dan resolusi terbaik dicapai dalam gel yang terbuat dari electroendosmosis rendah (EEO) agarosa (Birren, et al, 1989;. Dan White, 1992). Meskipun nilai elektroforesis agarosa paling standar cocok untuk PFGE (misalnya, SeaKem GTG), agarosa dengan EEO minimal akan memberikan pemisahan lebih cepat. EEO rendah Beberapa "nilai field berdenyut" yang tersedia, termasuk FastLane dan Gold (FMC Bioproducts), dan Megarose (Clontech). Gambar 4. Rotating elektroforesis gel (RGE) pemisahan 3000 hingga 6000 kb DNA kromosom pombe Schizosaccharomyces. Jalankan kondisi: 50 V, 1,4 V / cm, 100 jam, 100 sudut, menjalankan beberapa concatamated: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5x TBE, 0,8% megarose (Clontech), 10 C. Konsentrasi agarosa mempengaruhi baik resolusi dan mobilitas DNA (Birren, et al, 1989;. Dan White, 1992). konsentrasi yang lebih tinggi agarosa hasil lebih tajam, tetapi lebih lambat band bergerak. Dan konsentrasi biasa digunakan (0,8-1,2%) 33
merupakan tradeoff antara kecepatan dan resolusi. persentase Tinggi agarosa EEO rendah dapat meningkatkan resolusi tanpa mengorbankan kecepatan pemisahan (White, 1992). Google Terjemahan untuk:PenelusuranVideoEmailPonsel
GaMBARRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR
Suhu Karena mobilitas DNA juga tergantung pada suhu pemisahan, suhu harus konstan baik selama dan antara berjalan. Walaupun mobilitas tinggi meningkatkan suhu DNA, ia melakukannya dengan mengorbankan resolusi (Birren, et al, 1989;. dan Gemmill, 1991). Kesimpulan Sejak diperkenalkan lebih dari 8 tahun yang lalu, PFGE telah berkembang menjadi teknik, rutin pragmatis bagi ahli biologi molekuler. Hal ini tercermin dalam ketersediaan kini bab metode dan manual (misalnya, Birren dan Lai, 1990, 1993; Anand dan Selatan, 1990; Van Daelen dan Zabel, 1991). Apa Masa Depan? Kemungkinan termasuk menggunakan bahan pemisahan baru atau yang ditingkatkan, dan melampaui batas ukuran saat @ 10 Mb. Laporan anekdotal menunjukkan pemisahan dalam kisaran 20 Mb atau lebih besar yang mungkin, yang selanjutnya akan menyederhanakan tugas kompleks pemetaan genom. Untuk informasi lebih lanjut tentang Hoefer's HulaGeltm berputar unit elektroforesis gel, hubungi Layanan Teknis di Hoefer Ilmiah Instrumen di (415) 282-2307 atau 800-227-4750. Suhu Karena mobilitas DNA juga tergantung pada suhu pemisahan, suhu harus konstan baik selama dan antara berjalan. Walaupun mobilitas tinggi meningkatkan suhu DNA, ia melakukannya dengan mengorbankan resolusi (Birren, et al, 1989;. dan Gemmill, 1991). Kesimpulan Sejak diperkenalkan lebih dari 8 tahun yang lalu, PFGE telah berkembang menjadi teknik, rutin pragmatis bagi ahli biologi molekuler. Hal ini tercermin dalam ketersediaan kini bab metode dan manual (misalnya, Birren dan Lai, 1990, 1993; Anand dan Selatan, 1990; Van Daelen dan Zabel, 1991). Apa Masa Depan? Kemungkinan termasuk menggunakan bahan pemisahan baru atau yang ditingkatkan, dan melampaui batas ukuran saat @ 10 Mb. Laporan anekdotal menunjukkan pemisahan dalam kisaran 20 Mb atau lebih besar yang mungkin, yang selanjutnya akan menyederhanakan tugas kompleks pemetaan genom. Untuk informasi lebih lanjut tentang Hoefer's HulaGeltm berputar unit elektroforesis gel, hubungi Layanan Teknis di Hoefer Ilmiah Instrumen di (415) 282-2307 atau 800-227-4750. Suhu Karena mobilitas DNA juga tergantung pada suhu pemisahan, suhu harus konstan baik selama 34
dan antara berjalan. Walaupun mobilitas tinggi meningkatkan suhu DNA, ia melakukannya dengan mengorbankan resolusi (Birren, et al, 1989;. dan Gemmill, 1991). Kesimpulan Sejak diperkenalkan lebih dari 8 tahun yang lalu, PFGE telah berkembang menjadi teknik, rutin pragmatis bagi ahli biologi molekuler. Hal ini tercermin dalam ketersediaan kini bab metode dan manual (misalnya, Birren dan Lai, 1990, 1993; Anand dan Selatan, 1990; Van Daelen dan Zabel, 1991). Apa Masa Depan? Kemungkinan termasuk menggunakan bahan pemisahan baru atau yang ditingkatkan, dan melampaui batas ukuran saat @ 10 Mb. Laporan anekdotal menunjukkan pemisahan dalam kisaran 20 Mb atau lebih besar yang mungkin, yang selanjutnya akan menyederhanakan tugas kompleks pemetaan genom. Untuk informasi lebih lanjut tentang Hoefer's HulaGeltm berputar unit elektroforesis gel, hubungi Layanan Teknis di Hoefer Ilmiah Instrumen di (415) 282-2307 atau 800-227-4750.
Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology Esin (HACIOÚLU) BASIM S.leyman Demirel University, Faculty of Agriculture, Department of Plant Protection, 32260 ..n.r, Isparta - TURKEY
H.seyin BASIM Akdeniz University, Faculty of Agriculture, Department of Plant Protection, 07058, Antalya - TURKEY Received: 30.06.2000 Abstract: In recent years, the use of pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) in the molecular biology area has been subject to much research. PFGE is a powerful tool for characterizing various strains at the DNA level, obtaining relevant information on genome size and constructing the physical and genetic map of the chromosome of bacteria that are poorly understood at the genetic level as well as in separating chromosomes in microorganisms, and in the long-range mapping of mammalian genes. PFGE also has advantage of examining the elongated and oriented configuration of large DNA molecules in agarose gels at finite field strengths. In this review, the use of PFGE in molecular biology, the general characteristics of PFGE, different types of PFGE and factors affecting PFGE are introduced. Key Words: Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), CHEF, Molecular Biology, Biotechnology, Restriction Enzymes.
Pulsed-Field Jel Elektroforez (PFGE) TekniÛi ve Molek.ler Biyoloji AlanÝnda KullanÝmÝ .zet: Son yÝllarda, molek.ler biyoloji alanÝnda pulsed-field jel elektroforez (PFGE)Õin kullanÝmÝ bir ok araßtÝrmaya konu olmußtur. PFGE, DNA d.zeyinde eßitli strainlerin karakterize edilmesinde, genom b.y.kl.kleri hakkÝnda bilgi elde etmede, genetik d.zeyde anlaßÝlamamÝß bakteri kromozomlarÝnÝn fiziki ve genetik haritalarÝnÝn olußturulmasÝnda,mikroorganizmalarÝn kromozomlarÝnÝn ayrÝlmasÝnda, ve memeli genlerinin b.y.k aptaki haritalanmasÝnda kullanÝlan etkili bir metottur. PFGE; agaroz jel ierisindeki b.y.k DNA molek.llerinin uygun bir alanda deÛißik ßekillerde hareket etmesini saÛlayan bir avantaja da sahiptir. Bu derlemede, PFGEÕin molek.ler biyoloji alanÝnda kullanÝmÝ, PFGEÕin genel .zellikleri, eßitli tipleri ve PFGEÕi etkileyen fakt.rler sunulmußtur.
35
Anahtar S.zc.kler: Pulsed-Field Jel Elektroforez (PFGE), CHEF, Molek.ler Biyoloji, Biyoteknoloji, Restriksiyon Enzimler
405 Turk J Biol 25 (2001) 405-418 © T.BÜTAK Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
406 Introduction Much of the rapid progress that is being made in molecular biology today depends upon the ability to separate, size and visualize DNA molecules. The most common technique for this purpose is that of standard agarose gel electrophoresis. Gel electrophoresis (1) is one of the most commonly used separation techniques in the modern biology laboratory. Its ubiquity arises from both the simplicity and versatility of the technique. Electrophoresis has found widespread use in biological assays, and in the purification and separation of proteins and nucleic acids. The physical mapping of genes and DNA sequencing both depend on separation by gel electrophoresis (1). Conventional gel electrophoresis of DNA molecules is carried out by placing DNA in a solid matrix (i.e. agarose or polyacrylamide) and inducing the molecules to migrate through the gel under a static electric field. DNA fragments from 100 to 200 base pairs (bp) up to 50 kilobase pairs (kb) are routinely separated by conventional gel electrophoresis techniques. Above 50 kb, because of the size of the molecules, the sieving action of the gel is lost, and fragments run as a broad, unresolved band with anomalously high mobility. Although larger fragments (up to 750 kb) have been resolved by this technique (2), the gels used are extremely fragile due to the very low agarose concentrations, and the separation is not adequate for most applications. The separation of DNA molecules by other techniques is timeconsuming. The need for the analysis of large DNA molecules is in large-scale mapping (3). In 1982, Schwartz et al. (4) introduced the concept that DNA molecules larger than 50 kb can be separated by using two alternating electric fields (i.e. PFGE). Since that time, a number of instruments based on this principle have been developed, and the value of using pulsed fields has been demonstrated for separating DNAs from a few kb to over 10 megabase pairs (Mb). The development of PFGE has increased by two orders of magnitude the size of DNA molecules that can be routinely fractionated and analyzed. This increase is of major importance in molecular biology because it simplifies many previously laborious investigations and makes possible many new ones. Its range of application spans all organisms (2) from bacteria and viruses to mammals (5). PFGE has shown excellent ability to separate small, natural linear chromosomal DNAs ranging in size from 50-kb parasite microchromosomes to multimillionbp yeast chromosomes. However, intact human chromosomes range in size from 50 million to 250 million bp (Mb), too large for direct PFGE separations (6). PFGE provides the means for the routine separation of fragments exceeding 6,000 kb (2, 7, 8, 9). Therefore, PFGE separates DNAs from a few kilobase (kb) to over 10 megabase pairs (Mb) (10). The new technique of PFGE takes advantage of the elongated and oriented configuration of large DNA molecules in agarose gels at finite field strengths. An important bonus of this technique is the ease with which the genome size can be measured, a parameter that was previously subject to considerable error when measured by other techniques. One important outcome of the use of PFGE and restriction endonuclease digestion is the construction of a
36
physical map. General applications of PFGE can be in the separation of whole chromosomes, the large - scale restriction mapping of chromosome regions and in using DNA fragment purification as an aid in cloning. PFGE will greatly facilitate the precise selection of very large fragments for cloning, and it provides rapid analysis of a large chromosomal region. PFGE has proven extremely powerful in the analysis of large DNA molecules from a variety of sources, including specifically fragmented genomes of bacteria (11), mammals (5), parasite protozoa (12-15) and intact chromosomal DNAs from fungi (16-18). The introduction of PFGE techniques for separating large DNA molecules has had an invigorating effect on the study of chromosomal DNA molecules, genome structure and electrophoretical theory. In this review, the use of PFGE in molecular biology the general characteristics of PFGE, different types of PFGE and factors affecting PFGE are introduced. Types of PFGE PFGE size resolves DNA molecules of almost a millimeter in length through the use of pulsed-field electric fields, which selectively modulate mobilities in a size-dependent fashion. The pulsed electrophoresis effect has been utilized by a variety of instruments (FIGE, TAFE, CHEF, OFAGE, PACE and rotating electrode gel) to increase the size resolution of both large and small DNA molecules (1). It is important when choosing a PFGE system to evaluate cost and performance in the light of projected use. There are different types of PFGE. These are: 1. Field-Inversion Gel Electrophoresis (FIGE): In 1986, Carle, Frank and Olson developed a simpler system, FIGE, in which the two fields were 180¡ apart (19). Electrode polarity was reversed at intervals, with a longer forward than reverse pulse time to generate a net forward sample migration. Net forward migration is achieved by increasing the ratio of forward to reverse pulse times to 3:1. To improve the resolution of the bands by FIGE, the duration of pulse times is increased progressively during a run. This is called Òswitch time rampingÓ. By changing pulse durations continually during the course of an experiment, FIGE has the advantages of straight lanes and simple equipment. All that is needed are standard gel boxes and a pulse controller. Today, FIGE is very popular for smaller fragment separations. FIGE provides acceptable resolution up to 800 kilobases (600-750 kb). 2. Transverse-Alternating Field Gel Electrophoresis (TAFE): This form of PFGE allows separation of large DNA fragments in a simple, convenient format without the drawbacks of earlier pulsed-field techniques. In TAFE, the gel is oriented vertically and a simple fourelectrode array is placed not in the plane of the gel, but in front and at the back of it. Sample molecules are forced to zigzag through the thickness of the gel, and all lanes experience the same effects, so the bands remain straight (20). As the molecules move down the gel, they are subjected to continual variations in field strength and reorientation angle, but to all lanes equally. However, the angle between the electric fields varies from the top of the gel (115¡) to the bottom (approximately 165¡) and hence molecules still do not move at a constant velocity over the 407 E. (HACIOÚLU) BASIM, H. BASIM
length of the gel. TAFE technology, with regular and sharp separation of DNA bands, will be of special advantage in the study of genetics of many pathogenic protozoans, where such analysis was impossible before (20). TAFE has been used for the separation of fragments up to 1,600 kilobase fragments. 3. Contour-Clamped Homogeneous Electric Fields (CHEF): CHEF is the most widely used
37
apparatus. The CHEF apparatus provides a more sophisticated solution to the distorting effects of both the edges of the chamber and the passive electrodes. CHEF has twenty-four point electrodes equally spaced around the hexagonal contour. In the CHEF system, there are no ÒpassiveÓ electrodes. All the electrodes are connected to the power supply via an external loop of resistors, all of which have the same resistance. This loop is responsible for setting the voltages of all the electrodes around the hexagonal contour to values appropriate to the generation of uniform fields in each of the alternate switching positions. The CHEF system sets the voltages at these 24 points. This apparatus produces electric fields that are sufficiently uniform so that all lanes of a gel run straight. CHEF uses an angle of reorientation of 120¡ with gradiations of electropotential radiating from the positive to the negative pores. Molecules up to 7,000 kb can be separated by CHEF (10). 4. Orthogonal-Field Alternation Gel Electrophoresis (OFAGE): A similar apparatus that used two nonhomogeneous electric fields was reported by Carle and Olson (17) in 1984. The major drawbacks of these apparatuses were that because the electric fields were not uniform, and the angle between the electric field varied across the gel, DNA molecules migrated at different rates depending on their location in the gel. This is especially problematic in mammalian genome mapping, where a continuous distribution of fragment sizes is generated. Lane-to-lane comparisions and size estimations for digested genomic DNA are less straightforward when fewer discrete bands are being separated, as with the chromosomes of lower organisms like yeast. The angle between the electric fields varies from less than 180¡ and the more than 90¡. DNA molecules from 1,000 to 2,000 kb can be separated in OFAGE (17, 21). 5. Rotating Gel Electrophoresis (RGE): In England in 1987, Southern (22) described a novel PFGE system that rotates the gel between two set angles while the electrodes are off. In RGE, the electric field is uniform and bands are straight because only one set of electrodes is used. RGE makes it easy to perform time and voltage ramping. It also enables users to study the effects of different angles, and even to vary these, during an experiment-angle ramping. RGE uses a single homogeneous field and changes the orientation of the electric field in relation to the gel by discontinuously and periodically rotating the gel. Switch times are too long in RGE. The DNA molecules migrate in straight lanes, due to the homogeneous fields, and DNA molecules from 50 kb to 6,000 kb can be separated by adjusting the frequency of the gel rotation. In addition, the angle of reorientation can be easily altered simply by changing the angle of rotation (2, 23). Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
408 6. Programmable Autonomously-Controlled Electrodes (PACE): The PACE electrophoresis system offers precise control over all electric field parameters by the independent regulation of the voltages on 24 electrodes arranged in a closed contour. The flexibility of the PACE system derives from its ability to generate an unlimited number of electric fields of controlled homogeneity, voltage gradient, orientation and duration. The PACE system can perform all previous pulsed field switching regimens (i.e. FIGE, OFAGE, PHOGE, unidirectional pulsing), as well as generate voltage clamped homogeneous static fields. The PACE system separates DNA fragments from 100 bp to over 6 Mb. The ability to alter the
38
reorientation angle between the alternating fields permits an increased speed of separation for large DNA molecules. A computer-driven system known as PACE, designed by Lai et al. (1) may be the ultimate PFGE device. It is an extremely useful tool for studying variables such as pulse time, temperature, agarose concentration, voltage and angles between fields affecting DNA migration in PFGE (24). 7. Pulsed-Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis (PHOGE): The major difference between this instrument and other gel boxes with homogeneous electric fields is that the field reorientation angle is 90¡. PHOGE uses a 90¡ reorientation angle, but the DNA molecules undergo four reorientations per cycle instead of two. The DNA lanes in PHOGE do not run straight, a phenomenon which has been described for gel runs involving multiple electric fields in this manner. This system separates DNA fragments of up to 1 Mb (23). PFGE Equipment The basic components of a PFGE system consist of a gel box with some means of temperature regulation, a switching unit for controlling the electric fields, a cooler and a power supply (1). Gel Box The basic design of PFGE boxes consists of an immobilized gel within an array of electrodes and a means of circulating the electrophoresis buffer. Voltage gradients of 10 volts/cm are commonly used in PFGE. Voltage gradients as high as 15 volts/cm have been used in field inversion separations of cosmid clones (1). The temperature of the buffer is controlled by a heat-exchange mechanism. Generally, the buffer is recirculated throughout the gel box using inlet and outlet ports (17, 24). High Voltage Power Supply Precise control of the electric field gradient is necessary to obtain consistent PFGE separations. The output ratings of the power supply should therefore be high enough to meet 409 E. (HACIOÚLU) BASIM, H. BASIM
both the voltage and current requirements of the gel box. A typical PFGE gel box has electrodes that are 25 to 50 cm apart. To achieve the commonly used range of voltage gradients of 1.5 to 15 volts/cm requires a power supply with a maximum voltage rating of 750 volts. The current drawn at this voltage in most PFGE boxes is about 0.5 amperes at 14¡C using 0.5x TBE (1x TBE is 89 mM Tris pH: 7. 89 mM Boric acid and 2 mM EDTA) as running buffer (1). Switch Unit The ability to reproducibly control the switch interval is critical for the separation (24). The limited speed at which relays can switch will not accommodate the fast switching necessary for the PFGE separation of small DNA molecules (2-50 kb). The relays are usually controlled by a computer. To overcome the drawbacks of electromechanical relays, high-voltage solid-state electronics has supplanted electromechanical relays in recently designed commercial PFGE systems. These switching units are commonly based on the use of metal oxide semiconductor field effect transistors (MOSFETs) in both switching and electrode voltage control circuits. These designs offer the advantages of improved reliability, the capability of high speed switching (0.1 ms) and ample voltage (750 V) and current (0.5 amperes) ratings (1). These apparatuses have the ability to control the reorientation angles between electric fields. However, these instruments cannot provide fast enough switching for the improvement of the
39
separation of DNA molecules smaller than 50 kb. Computer Program Careful control of the switch interval is crucial in controlling the resolution in PFGE. A versatile switching unit should have software with the same characteristics. The algorithm should be fast enough so that switch times at least as short as 1 ms can be achieved and switch interval increments should have at least 1 ms resolution. Linear switch interval ramping has been the most commonly used procedure because of its simple implementation. The maximum run time should be about two weeks to allow for the separation of very large DNA molecules. This is controlled by a computer program (1). Cooler Buffer recirculation is an important factor, as it eliminates temperature variations within the gel so as to alleviate buffer breakdown due to electrolysis. DNA molecule migration is sensitive to temperature, and thus a uniform temperature across the gel is needed to ensure even migration in each of the lanes. Buffer is recirculated through the gel chamber by a reciprocating solenoid pump at a rate of about 450 ml/min. The buffer is chilled in its reservoir tank by cold water (5¡C) circulated through a glass tubing heat exchanger. Buffer temperature is thus maintained at 13-15¡C throughout a typical run (17, 24). Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
410 Running Conditions for PFGE PFGE separations are sensitive to a variety of different molecular and environmental variables. The principle significant variables are the molecular properties of the DNA, the pulse time, the electrical field shape, the electrical field strength, the gel composition, the sample concentration and the temperature. 1. Pulse Time: In PFGE, DNA is subjected alternately to two electrical fields at different angles for a time called the pulse time. The molecules must presumably change direction prior to net translational motion. Each time the field is switched, larger molecules take longer to change direction and have less time to move during each pulse, so they migrate slower than smaller molecules. Molecules so small that their reorientation time is short compared to the pulse time will spend most of the pulse duration in conventional electrophoretic motion where size resolution is quite limited. As a result of this, resolution in PFGE is likely to be optimal for molecules with reorientation times comparable to the pulse time. At applied field strengths of about 10 V/cm, 0.1 s pulse times resolve DNA optimally in the 5-kb size range, while pulse times of 1,000 s at 3 V/cm are used to resolve 3-7 Mb molecules. Pulse times are selected so that DNA molecules of a targeted size spend most of the duration of the pulse reorienting rather than moving through the gel, which accounts for the long periods of time, usually days or weeks, needed to fractionate large DNA molecules. The chromosomal DNA molecules of Saccharomyces cerevisiae in the 10 Mb range requires langer electrophoresis of approximately one week (25). 2. Electrical Field Shape: A number of different electrical field configurations were employed in early PFGE experiments. It was apparent that certain aspects at the field shape were critical in achieving high-resolution PFGE separations. Electrical field strength can be adjusted to tune the size range of effective PFGE resolution. The resolution of PFGE is affected
40
by the number and configuration of the electrodes used, because these alter the shape of the applied electrical fields. The most critical variable appears to be the angle between the alternate electrical fields. The most effective electrode configurations yield angles of more than 110¡. A continually increasing angle between the fields produces band sharpening that greatly enhances the resolution. The angle between the alternate fields is always greater than 90¡ where good resolution is observed. In cases of excellent resolution, field angles typically range from 120¡ to 150¡. In contrast, where poor resolution was seen, the field angles ranged typically from 110¡ to 150¡ (25). Angles of 90¡ or smaller are not effective, probably because the DNA molecules easily become oriented midway between the two applied fields. Angles larger than 90¡ are more effective (25). While more complete studies on optimum angles are needed, it is clear that angles in the range of 120¡-150¡ provide very high resolution (25). Field strengths that decrease, or angles that increase, progressively along the direction of the net DNA motion produce band sharpening because the molecules at the front of each DNA zone always migrate more slowly than those at the rear. 411 E. (HACIOÚLU) BASIM, H. BASIM
3. Electrical Field Strength: Electrophoretic mobility is defined as the velocity per unit field. In most ordinary electrophoresis, the mobility is independent of field strength. This independence is expected if the properties of the molecules are not directly altered by a separation process. The field strength affects mobility in two ways. The mobilities of 100-500 kb DNA show an approximately linear dependence on field strength. The field strength affects the DNA size of the transition between the two zones of resolution (25). 4. Reorientation Angle: The widening of the reorientation angle should yield sharper bands and better resolution. The separation of yeast chromosomes is nearly identical for those chromosomes separated with reorientation angles of 110¡ and 165¡. However, when reorientation angles from 105¡ to 165¡ are used to separate molecules in the size range of S. cerevisiae (200-3,000 kb), there is a 4-fold difference among the DNA velocities observed with these different angles (1). The increase in mobility obtained with smaller reorientation angles is even more pronounced when separating larger molecules. Most commercially available pulsed-field gel boxes use a fixed angle of 120¡ between the alternating fields. 5. Voltage: As with switch time, the choice of the voltage used in PFGE must also be varied with the size of the DNA to be separated. While voltage gradients of 6-10 V/cm can be used to separate molecules up to 1 Mb, resolving molecules larger than this in pulsed field gels requires a reduction in voltage gradient (14, 24). Separation of chromosomes from the yeast S. pombe (3 Mb, 5 Mb and 6 Mb) requires that voltage gradients do not exceed 2 V/cm. The even larger chromosomes of N. crassa (larger than 12 Mb) were separated at 1.5 V/cm (15). The practical effect is to increase the run times for larger DNA molecules. Thus, electrophoretic separation of N. crassa chromosomes required up to 7 days. When the voltage gradient is reduced to separate large DNAs, switching intervals must be lengthened (15).
41
6. Temperature: In conventional gel electrophoresis, DNA molecules were run at room temperature but, in PFGE, DNA was run at a low temperature (between 4¡C and 15¡C). Temperature has a dramatic effect on DNA mobility in PFGE. Temperatures between 14¡C and 22¡C are generally regarded as the best compromise between speed and resolution while gels can be run at room temperature, it is usually necessary to circulate the buffer through a heat exchanger to dissipate the heat generated by the voltage gradients used during most pulsed field runs (2, 25). The velocity of lambda DNA at 34¡C is twice that at 4¡C. However, gels run at temperatures as high as 34¡C show diminished resolution (1). 7. Switch interval: The single most important determinant of mobility in PFGE is the interval at which the direction of the electric field is switched. If the switching interval is increased beyond the time required for a fragment to reorient, then the fragment will spend a large portion of the gel run migrating, as in conventional electrophoresis, with a resulting loss in resolution. The choice of an appropriate switching interval for PFGE must reflect the size range of the fragments to be resolved. Birren et al. (24) have measured the velocity of DNA molecules from 50 to 1,000 kb in PFGE with switch times of from 5 to 300 s. The highest Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
412 resolution for molecules of a given size is obtained by using the shortest switch intervals which permit separation of the complete size range of the fragments (26). 8. Agarose Concentration: The agarose concentration will affect the separation obtained with PFGE. Faster DNA migration occurs in gels of lower agarose concentration. The DNA monomer (48.5 kb) migrates 50% faster in PFGE of 0.6% agarose compared to a 1% gel. The DNA bands which are quite diffuse in the 0.7% gel become increasingly sharp as the agarose concentration is raised in 1.4% and 1.8% gels over identical times. The distance migrated by the identical samples demonstrated the decrease in velocity as the agarose concentration is increased (24). 9. Restriction Enzymes: The ability of restriction enzymes (REs) to cut DNA at a specific sequence of bases has greatly stimulated the growth of recombinant DNA technology. Over 1,900 REs are known, and of there 275 are available from companies based around the world (27). The common restriction enzymes, EcoR I and Hind III, digest bacterial and mammalian DNA to fragments averaging approximately 4 kb in sizes much too small for PFGE. For this reason, it is advisable to use enzymes which have relatively few sites and give larger fragments from the target DNA in PFGE (27). Any enzyme producing a large number of small fragments (smaller than 10 kb) is unlikely to be useful for PFGE and mapping. A major factor in selecting suitable restriction enzymes is the base composition (%G+C content) of the target DNA. Analysis by PFGE and rare-restriction enzymes have been useful for obtaining relevant information on genome size, characterizing various strains at the DNA level (28), following the genetic history of a particular strain, constructing physical and genetic maps of bacterial chromosomes and studying chromosomal dynamics among bacteria (29-31). Enzymes that recognize sequences larger than 6 bp are potentially useful in genome mapping because they generate large fragments (27). At present, there are nine restriction enzymes commercially available with an 8-bp recognition sequence. Of these, Not I, Sfi I, Srf I, Ase I, Pac I and Swa I are rare-cutters in genomes with a G+C content of about 35-55%. Below and above these margins the number of fragments becomes too small and too large, respectively. Pac I
42
(AATTAATT), Swa I (ATTTAAAT), Pme I (GTTTAAAC) and Sse 83871 (CCTGCAGG) are new on the market (32). On the other hand, Pac I and Swa I enzymes should be useful especially for genomes with a G+C contents in the range of 45-65% (32). The 4-bp pair sequence 5ÕCTAG3Õ seems to be selected against in most bacterial genomes (33). This tetranucleotide is part of the recognition sequence of Spe I (A/CTAGT), Xba I (T/CTAGA), Nhe I (G/CTAGC) and Avr II (C/CTAGG). CTAG is found infrequently in most prokaryotes and restriction endonucleases that include this sequence in their recognition sequence cut bacterial genomes infrequently (32). PFGE of large fragments of DNA generated using infrequently cutting Swa I and Pac I restriction endonucleases were used in genome analysis of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria, a causal agent of leaf spot disease of pepper and tomato, and optimal conditions for digestion in the genome analysis were determined (26, 34-36). 413 E. (HACIOÚLU) BASIM, H. BASIM
Pulsed-Field Applications Full understanding of a biological system requires knowledge of the structure and function of the genes and their arrangement on the chromosome. PFGE has been used to separate DNA molecules as large as 12 Mb. The ability to analyze such large fragments will greatly facilitate the construction of physical maps (1). The ability to separate, isolate and analyze megabase size fragments of DNA is already providing insights into the genome organization of organisms as diverse as bacteria and humans (2). PFGE is used in the following areas: 1. The advent of PFGE techniques for the resolution of large DNA molecules has provided a new analysis approach for bacterial genomes (37). The PFGE of DNA fragments obtained using different enzymes is a powerful technique for quick resolution of the bacterial genome into a small number of large fragments. 2. The PFGE of DNA fragments obtained by using endonucleases produce a discrete pattern of bands useful for the fingerprinting and physical mapping of the chromosome (38). 3. The PFGE technique is useful to establish the degree of relatedness among different strains of the same species (38). 4. PFGE has proved to be an efficient method for genome size estimation and the construction of chromosomal maps, as well as being useful for the characterization of bacterial species (39-41). PFGE technology has proven invaluable for the accurate estimation of genome size and in the construction of physical maps of a diverse range of prokaryotic organisms (42,43). 5. PFGE is a powerful tool for genome characterization and has led to the construction of the physical map of more than 180 bacterial chromosomes (44). 6. PFGE has proven extremely powerful in the analysis of large DNA molecules from a variety of sources including intact chromosomal DNAs from fungi (16), parasitic protozoa (45) and specifically fragmented genomes of bacteria (26, 38) and mammals (5, 6). 7. PFGE simplifies many previously laborious investigations and makes possible many new investigations. This technique has been used extensively in application to all organisms from bacteria to viruses (2). 8. Yeast Artificial Chromosome (YAC) libraries have been constructed by PFGE (2). 9. PFGE experiments are used in the construction of transgenic mice (2).
43
10. PFGE has also shown itself useful in the study of radiation-induced DNA damage and repair, size organization and variation in mammalian centromers (2, 46). Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
414 11. Many investigations directly involve studies of genome organization. For example, in determining the physical proximity of two genes, while determining the size of very large genes or when identifying the location of chromosomal breaks (2, 46). 12. PFGE will play a major role in the mapping of the human genome (47). The physical mapping of a human chromosome involves ordering and measuring the distances between a set of DNA markers that are unique to that chromosome. Given the large sizes of the chromosomes involved (50,000-300,000 kb), PFGE is the method to pursue (47). 13. PFGE is used to determine the order of markers more precisely than is possible with genetic linkage analysis, and with a PFGE map available, new markers can be quickly localized within that region (32). 14. A new mutation can be mapped by cloning the gene, followed by restriction analysis and hybridization, to a set of ordered restriction fragments by PFGE (47). 15. PFGE will greatly facilitate the precise selection of large DNA fragments for cloning. REs which are specific for cutting infrequently occurring sequences, are used to create large DNA fragments which are then separated by PFGE. By blotting and hybridization the fragments containing the desired gene are determined. This region is recovered from the gel and cloned (2, 23). 16. PFGE allows for easy isolation of the individual restriction fragments for further restriction mapping, gene insertion and functional gene mapping (13). Results The developments in PFGE over the past decade have led to an ingenious collection of workable designs. TodayÕs instruments resolve DNA several orders of magnitude larger than was possible by conventional electrophoresis, permitting the direct study of intact chromosomes from yeasts and human parasites. Investigations now center on a better understanding of these techniques, which will support the design of new generations of devices to separate even larger fragments and, eventually, entire human genomes. The analysis of entire genomes represents a revolutionary approach to genetics, and the availability of vast amounts of information from these projects will allow new conceptual approaches in many areas of biological research. It is clear that at the present time, no single technique or strategy is sufficient for preparing a map of an intact human chromosome. However, the combined use of many powerful new techniques brings the analysis of mammalian genomes within reach. PFGE has made possible the development of the YAC cloning system and will play a major role in the mapping of the human genome. The PFGE technique will be useful for establishing the degree of relatedness among different strains of the same species. 415 E. (HACIOÚLU) BASIM, H. BASIM
Future applications for PFGE techniques may include protein separations and nucleic acid sequencing and studies of DNA topology. PFGE allows physical-map construction for virtually any organisms. PFGE techniques should soon provide physical maps and their applications for a wide number of microorganism. As physical mapping methods are rapidly displacing genetic
44
methods for chromosome assignment, it is essential to understand the behavior of circular DNA species on pulsed-field gels. Analysis with PFGE can be used to establish long-range maps based on anonymous markers that have been shown to be genetically linked. Ideally, the targeted region is saturated with markers, allowing the construction of several overlapping maps. However, for plant genomes, markers are rarely clustered with sufficient density to allow the immediate construction of detailed maps based on several markers. References 1. Lai, E., Birren, B. W., Clark, S. M., Simon, M. I., Hood, L. Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Biotechniques, 7: 3442, 1989. 2. Gardiner, K. Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Analytical Chemistry, 63: 658-665, 1991. 3. Southern, E. M., Elder, J. K. Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Edited by A. P. Monaco, Oxford, IRL Press, 1-119, 1995. 4. Schwartz, D. C., Saffran, W., Welsh, J., Haas, R., Goldenberg, M., Cantor, C. R. New techniques for purifying large DNAs and studying their prioreties and packaging. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, XLVII: 189-195, 1982. 5. Smith, C. J., Coote, J. G., Parton, R. R plasmid-mediated chromosome mobilization in Bordetella pertussis. J. Gen. Microbiol., 1432: 2685-2692, 1986. 6. Smith, C. L., Cantor, C. R. Current communications in molecular biology DNA probes. Applications in genetic and infectious disease and cancer. Edited by L. S. Lerman, Cold Spring Harbor Laboratory, 87-95, 1986. 7. Steward, G., Furst, A., Avdalovic, N. Transverse Alternating Field Electrophoresis (TAFE). Biotechniques, 6: 68-73, 1988. 8. Maloy, S. R., Cronan, J. E. Jr., Freifelder, D. Microbial Genetics. Jones and Bartlett Publishers, Second Edition, 45-47, 1994. 9. Kaufmann, M. E., Pitt, T. L. Methods in Practical Laboratory Bacteriology. Edited by H. Chart, FL, CRC Press Inc., 83, 1994. 10. Levene, S. D. Methods in Molecular Biology, Pulsed-Field Gel Electrophoresis. Eds. M. Burmeister and L. Ulanovsky, Totowa, NJ, The Humana Press, 345-365, 1992. 11. Smith, C. L., Econome, J. G., Schutt, A., Klco, S., Cantor, C. R. A physical map of the Escherichia coli K12 genome. Science, 236: 1448-1453, 1987. 12. VanderPloeg, L. H. T., Schwartz, D. C., Cantor, C. R., Borst, P. Antigenic variation in Trypanosoma brucei analyzed by electrophoretic separation of chromosome-sized DNA molecules. Cell, 37: 77-78, 1984. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
416 13. Smith, C. L., Klco, S. R., Cantor, C. R. Genome analysis a practical approach. Edited by K. E. Davis, Washington D.C., IRL Press, Oxford, 41-72, 1988. 14. Vollrath, D., Davis, R. W. Isolation of DNA molecules greater than 5 megabases by contour-clamped homogeneous electric fields. Nucl. Acids. Res., 15: 7865-7876, 1987. 15. Orcbach, M. J., Vollrath, D., Davis, R. W., Yanofsky, C. An electrophoretic karyotype of Neurospora crassa. Mol. Cell. Biol., 8: 1469-1473, 1988. 16. Schwartz, D. C., Cantor, C. R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed- field gradient gel electrophoresis. Cell, 37: 67-75, 1984. 17. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucl. Acids Res., 14: 5647-5663, 1984. 18. Carle, G. F., Olson, M. V. An electrophoretic karyotype for yeast. Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 3756-3760, 1985. 19. Carle, G. F., Frank, F., Olson, M. V. Electrophoretic separations of large DNA molecule by periodic inversion of electric field. Science, 232: 65-68, 1986. 20. Steward, G., Furst, A., Avdalovic, N. Transferse Alternating Field Electrophoresis (TAFE). Biotechniques, 6: 68-73, 1988. 21. Chu, G., Vollrath, D., Davis, R. W. Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields. Science, 234: 1582-1585, 1986. 22. Southern, E. M., Anand, R., Brown, W. R., Fletcher, D. S. A model for the separation of large DNA molecules by crossed-field gel electrophoresis. Nucl. Acids Res., 15: 5925-5943, 1987. 23. Ziegler, A., Vols, A. Methods in Molecular Biology, Pulsed-field gel electrophoresis. Eds. M. Burmeister, L. Ulanovsky, Totawa, NJ, Humana Press, 63-72, 1992. 24. Birren, B. W., Lai, E., Clark, S. M., Houd, L., Simon, M. I. Optimized conditions for pulsed-field gel electrophoretic separations of DNA. Nucl. Acids Res., 16: 7563-7581, 1988. 25. Cantor, C. R., Gaal, A., Smith, C. L. High-resolution separation and accurate size determination in pulsed-field gel electrophoresis of DNA. 3. Effect of electrical field shape. Biochemistry, 27: 9216-9221, 1988. 26. BasÝm, E., BasÝm, H., Stall, R. E., Jones, J. B. Bakteriyel genom analizinde PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) y.nteminin optimal koßullarÝnÝn belirlenmesi. Biyoteknoloji (K.kem) Dergisi, 23 (2): 107-112, 1999. 27. Bhagwat, A. S. Restriction enzymes: Properties and use. Methods in Enzymology, 216: 199-224, 1992.
45
28. Grouthues, D., T.mmler, B. New approaches in gene analysis by pulsed-field gel electrophoresis: application to the analysis of Pseudomonas species. Mol. Microbiol., 5: 2763-2776, 1991. 29. Kohara, Y., Akiyama, K., Isono, K. The physical map of the whole E. coli chromosome: Application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genome library. Cell, 50: 495-508, 1987. 30. Chang, N., Taylor, D. E. Use of pulsed-field agarose gel electrophoresis to size genomes of Campylobacter species and to construct a Sal I map of Campylobacter jejuni UA580. J. Bacteriology, 172: 5211-5217, 1990. 31. BasÝm, E. Pulsed-field jel elektroforez y.ntemi ile domates ve biberde yaprak lekesi etmeni (Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)Õ nÝn genom b.y.kl.Û.n.n saptanmasÝ ve fiziksel haritasÝnÝn olußturulmasÝ. Doktora tezi, Akdeniz .niv., Fen Bilimleri Enst., Bitki Koruma Anabilim DalÝ, 83 sayfa, 1998. 32. Burmeister, M. Methods in Molecular Biology. Eds. M. Burmeister, L. Ulanovsky, New Jersey, Humana Press, 259284, 1992.
417 E. (HACIOÚLU) BASIM, H. BASIM 33. Bautsch, W. Pulsed-field gel electrophoresis, protocols, methods and theories. Eds. M. Burmeister, L. Ulanovsky, Humana Press, 185-201, 1992. 34. McClelland, M., Jones, R., Patel, J., Nelson, M. Restriction endonucleases for pulsed-field mapping of bacterial genomes. Nucl. Acids Res., 15: 5985-6005, 1987. 35. HacÝoÛlu, E., BasÝm, H., Stall, R. E. Rarely-cutting restriction endonucleases useful for determining genome size and physical map of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria. Phytopathology, 86: 77-78, 1996. 36. HacÝoÛlu, E., BasÝm, H., Stall, R. E. Optimized conditions of Pac I and Swa I for genome analysis of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria by PFGE. Biotecniques, 22: 1024-1026, 1997. 37. Dempsey, J. A. F., Livaker, W., Madhure, A., Snodgrass, T. L., Cannon, J. G. Physical map of the chromosome of Neisseria gonorrhoea FA1090 with locations of genetic markers, including opa and pil genes. J. Bacteriology, 173: 5476-5486, 1991. 38. Correia, A., Martin, J. F., Castro, J. M. Pulsed-field gel electrophoresis analysis of the genome of aminoacid producing Corynebacteria: Chromosome sizes and diversity of restriction patterns. Microbiology, 140: 28412847, 1994. 39. BasÝm, H., Stall, R. E., Minsavage, J., Jones, J. Chromosomal gene transfer among strains of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria by conjugation. Phytopathology, 89: 1044-1049, 1999. 40. Churin, Y. N., Shalak, I. N., Borner, T., Shestakov, S. V. Physical and genetic map of the chromosome of the unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803. J. Bacteriology, 177: 3337-3343, 1995. 41. Roussel, Y., Pebay, M., Guedon, G., Simonet, J. M., Decaris, B. Physical and genetic map of Streptococcus thermophilus A054. J. Bacteriology, 176: 7413-7422, 1994. 42. Bourke, B., Sherman, P., Louie, H., Hani, E., Islur, P., Chan, V. L. Physical and genetic map of the genome of Campylobacter upsaliensis. Microbiology, 141: 2417-2424, 1995. 43. Pyle, L. E., Taylor, T., Finch, L. R. Genomic maps of some strains within theMycoplasma mycoides cluster. J. Bacteriology, 172: 7265-7268, 1990. 44. Bourgeois, P. L., Lautier, M., Berghe, L. V. D., Gasson, M. J., Ritzenthaler, P. Physical and genetic map of the Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 chromosome: Comparison with that of Lactococcus lactis subsp. lactis IL 1403 revals a large genome inversion. J. Bacteriology, 177: 2840-2850, 1995. 45. VanderPloeg, L. H. T., Schwartz, D. C., Cantor, C. R., Borst, P. Antigenic variation in Trypanosoma brucei analyzed by electrophoretic separation of chromosome-sized DNA molecules. Cell, 37: 77-78, 1984. 46. Suwanto, A., Kaplan, S. Physical and genetic mapping of the Rhodobacter sphaeroides 2-4.1. Genome: Presence of two unique circular chromosomes. J. Bacteriology, 171: 5850-5859, 1989. 47. Larsen, F., Gunderson, G., Prtdz, H. Choice of enzymes for mapping based on CpG islands in the human genome. GATA, 9(3): 80-85, 1992. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) Technique and its use in Molecular Biology
46
Berdenyut-Field Gel Elektroforesis (PFGE) Teknik dan perusahaan menggunakan dalam Biologi Molekular Esin (HACIOÚLU) Basim S.leyman Demirel University, Fakultas Pertanian, Departemen Proteksi Tanaman, 32260 .. n.r, Isparta - TURKEY H.seyin Basim Akdeniz University, Fakultas Pertanian, Departemen Proteksi Tanaman, 07058, Antalya - TURKEY Diterima: 2000/06/30 Abstrak: Dalam beberapa tahun terakhir, penggunaan elektroforesis gel berdenyutlapangan (PFGE) dalam biologi molekuler daerah telah dikenakan banyak penelitian. PFGE adalah alat yang ampuh untuk mengkarakterisasi berbagai strain di tingkat DNA, memperoleh informasi yang relevan pada ukuran genom dan membangun fisik dan peta genetik dari kromosom bakteri yang kurang dipahami di tingkat genetik serta dalam pemisahan kromosom pada mikroorganisme, dan dalam jangka panjang pemetaan gen mamalia. PFGE juga memiliki keuntungan dari memeriksa konfigurasi memanjang dan berorientasi DNA besar molekul dalam gel agarosa di kekuatan finite field. Dalam review ini, penggunaan PFGE dalam biologi molekular, karakteristik umum PFGE, berbagai jenis PFGE dan faktor yang mempengaruhi PFGE adalah diperkenalkan. Kata Kunci: Elektroforesis Gel Pulsed-Field (PFGE), CHEF, Biologi Molekuler, Bioteknologi, Pembatasan Enzim. Berdenyut-Lapangan jel Elektroforez (PFGE) TekniÛi ve Molek.ler Biyoloji AlanÝnda KullanÝmÝ zet: Putra yÝllarda, molek.ler biyoloji alanÝnda berdenyut-bidang jel elektroforez (PFGE) Oin kullanÝmÝ bir ok?.? araßtÝrmaya olmußtur konu. PFGE, DNA d.zeyinde? Eßitli strainlerin? Karakterize edilmesinde, genom bykl.kleri hakkÝnda Bilgi elde etmede, genetik d.zeyde anlaßÝlamamÝß bakteri kromozomlarÝnÝn fiziki ve genetik haritalarÝnÝn olußturulmasÝnda, ayrÝlmasÝnda kromozomlarÝnÝn mikroorganizmalarÝn, ve memeli genlerinin byk? aptaki haritalanmasÝnda kullanÝlan etkili bir metottur?. PFGE; jel agaroz i?? erisindeki byk DNA molek.llerinin uygun bir Alanda deÛißik ßekillerde hareket etmesini saÛlayan bir avantaja sahiptir da. Bu derlemede, PFGEÕin molek.ler biyoloji alanÝnda kullanÝmÝ, PFGEÕin genel zellikleri,.?? eßitli tipleri telah PFGEÕi etkileyen sunulmußtur fakt.rler. Anahtar S.zc.kler: Pulsed-Field CHEF jel Elektroforez (PFGE),, Biyoloji Molek.ler, Biyoteknoloji, Restriksiyon Enzimler 405 Turk J Biol 47
25 (2001) 405-418 © T. Butak Berdenyut-Field Gel Elektroforesis (PFGE) Teknik dan penggunaannya dalam Biologi Molekular 406 Pengantar Banyak kemajuan pesat yang sedang dibuat dalam biologi molekuler saat ini tergantung pada kemampuan untuk memisahkan, ukuran dan memvisualisasikan molekul DNA. Teknik yang paling umum untuk hal ini Tujuan adalah bahwa standar elektroforesis gel agarosa. Gel elektroforesis (1) adalah salah satu paling umum digunakan teknik pemisahan di laboratorium biologi modern. Its ubiquity timbul dari kedua kesederhanaan dan fleksibilitas dari teknik ini. Elektroforesis telah menemukan luas digunakan dalam pengujian biologis, dan dalam pemurnian dan pemisahan protein dan asam nukleat. Pemetaan fisik gen dan sekuensing DNA keduanya tergantung pada pemisahan dengan elektroforesis gel (1). elektroforesis gel Konvensional molekul DNA dilakukan dengan menempatkan DNA dalam (misalnya agarose atau poliakrilamida) matriks padat dan merangsang molekul-molekul bermigrasi melalui gel bawah medan listrik statis. DNA fragmen dari 100 ke 200 pasangan basa (Bp) sampai dengan 50 pasang kilobase (kb) secara rutin dipisahkan dengan elektroforesis gel konvensional teknik. Di atas 50 kb, karena ukuran molekul, aksi pengayak gel adalah hilang, dan fragmen dijalankan sebagai sebuah band, luas anomali terselesaikan dengan mobilitas tinggi. Meskipun fragmen yang lebih besar (hingga 750 kb) telah diselesaikan dengan teknik ini (2), gel yang digunakan adalah sangat rapuh karena konsentrasi agarosa sangat rendah, dan pemisahan tidak cukup untuk sebagian besar aplikasi. Pemisahan molekul DNA dengan teknik lainnya adalah memakan waktu. Kebutuhan untuk analisis molekul DNA besar dalam pemetaan skala besar (3). Pada tahun 1982, Schwartz et al. (4) memperkenalkan konsep bahwa DNA molekul yang lebih besar dari 50 kb dapat dipisahkan dengan menggunakan dua medan listrik bolak (PFGE yaitu). Sejak saat itu, nomor instrumen didasarkan pada prinsip ini telah dikembangkan, dan nilai menggunakan bidang berdenyut telah ditunjukkan untuk memisahkan DNA dari beberapa kb lebih dari 10 pasang megabase (Mb). Pengembangan PFGE telah meningkat dua perintah besarnya ukuran DNA molekul yang dapat secara rutin difraksinasi dan dianalisis. Peningkatan ini adalah sangat penting dalam biologi molekular karena menyederhanakan penyelidikan sebelumnya banyak melelahkan dan membuat 48
mungkin baru yang banyak. Its berbagai aplikasi mencakup semua organisme (2) dari bakteri dan virus untuk mamalia (5). PFGE telah menunjukkan kemampuan yang bagus untuk memisahkan kecil, alam linier DNA kromosom ukuran mulai dari microchromosomes parasit 50-kb untuk jutaan bp kromosom ragi. Namun, kromosom manusia utuh berbagai ukuran dari 50 juta menjadi 250 juta bp (Mb), terlalu besar untuk pemisahan PFGE langsung (6). PFGE menyediakan sarana untuk pemisahan rutin fragmen melebihi 6.000 kb (2, 7, 8, 9). Oleh karena itu, PFGE memisahkan DNA dari beberapa kilobase (kb) untuk lebih dari 10 pasang megabase (Mb) (10). Teknik baru PFGE mengambil keuntungan dari konfigurasi memanjang dan berorientasi molekul DNA besar dalam gel agarose pada kekuatan finite field. Bonus penting dari Teknik adalah kemudahan dengan ukuran genom yang dapat diukur, parameter yang sebelumnya memiliki kesalahan cukup bila diukur dengan teknik lain. Yang penting hasil dari penggunaan PFGE dan pencernaan pembatasan endonuklease adalah pembangunan fisik peta. Aplikasi umum dari PFGE bisa dalam pemisahan kromosom utuh, besar - pembatasan skala pemetaan daerah kromosom dan dalam menggunakan fragmen DNA pemurnian sebagai bantuan dalam kloning. PFGE akan sangat memudahkan pemilihan yang tepat sangat besar fragmen untuk kloning, dan menyediakan analisis cepat dari daerah kromosom besar. PFGE telah terbukti sangat kuat dalam analisis molekul DNA besar dari berbagai sumber, termasuk khusus genom bakteri terfragmentasi (11), mamalia (5), protozoa parasit (12-15) dan DNA kromosom utuh dari jamur (16-18). Pengenalan PFGE teknik untuk memisahkan molekul DNA besar memiliki efek menyegarkan pada studi molekul DNA kromosom, struktur genom dan teori electrophoretical. Dalam review ini, penggunaan PFGE dalam biologi molekular karakteristik umum PFGE, berbagai jenis PFGE dan faktor yang mempengaruhi PFGE diperkenalkan. Jenis PFGE PFGE menyelesaikan ukuran molekul DNA hampir milimeter panjang melalui penggunaan berdenyut-medan medan listrik, yang selektif memodulasi Mobilitas secara ukuran yang tergantung. Efek elektroforesis berdenyut ini telah digunakan oleh berbagai instrumen (FIGE, TAFE, CHEF, OFAGE, PACE dan gel elektroda berputar) untuk meningkatkan resolusi ukuran baik besar dan molekul DNA kecil (1). Hal ini penting ketika memilih suatu sistem PFGE untuk mengevaluasi biaya dan kinerja dalam terang penggunaan diproyeksikan. Ada berbagai jenis PFGE. Ini adalah: 1. Bidang-Inversion Gel Elektroforesis (FIGE): Pada tahun 1986, Carle, Frank dan 49
Olson dikembangkan sistem sederhana, FIGE, di mana dua bidang yang terpisah 180 ¡(19). Elektroda polaritas adalah terbalik pada interval, dengan maju lebih lama dari waktu pulsa reverse untuk menghasilkan maju bersih sampel migrasi. migrasi ke depan bersih dicapai dengan meningkatkan rasio ke depan untuk reverse kali pulsa ke 3:1. Untuk meningkatkan resolusi dari band-band oleh FIGE, durasi kali pulsa semakin meningkat selama berlari. Ini disebut waktu Òswitch rampingÓ. Dengan mengubah jangka waktu pulsa terus menerus selama percobaan, FIGE memiliki keuntungan dari jalur lurus dan peralatan sederhana. Semua yang dibutuhkan adalah kotak gel standar dan controller pulsa. Hari ini, FIGE sangat populer untuk perpisahan fragmen yang lebih kecil. FIGE menyediakan resolusi diterima sampai dengan 800 kilobases (600-750 kb). 2. Transverse-Alternating Field Gel Elektroforesis (TAFE): Bentuk PFGE memungkinkan pemisahan DNA besar fragmen dalam format sederhana, nyaman tanpa kelemahan sebelumnya berdenyut-bidang teknik. Di TAFE, gel berorientasi vertikal dan empat sederhana elektroda array ditempatkan tidak pada bidang gel, tapi di depan dan di belakang itu. Contoh molekul dipaksa untuk zigzag melalui ketebalan gel, dan semua jalur mengalami efek yang sama, sehingga band tetap lurus (20). Sebagai molekul bergerak ke bawah gel, mereka terkena terus-menerus variasi dalam kekuatan lapangan dan sudut reorientasi, tetapi untuk semua jalur sama. Namun, sudut antara medan listrik bervariasi dari puncak gel (115 ¡) ke bawah (Sekitar 165 ¡) dan karenanya molekul masih tidak bergerak dengan kecepatan konstan selama 407 E. (HACIOÚLU) Basim, H. Basim panjang gel. teknologi TAFE, dengan pemisahan teratur dan tajam pita DNA, akan menjadi khusus keuntungan dalam studi genetika protozoa patogen banyak, analisis mana seperti tidak mungkin sebelum (20). TAFE telah digunakan untuk pemisahan fragmen sampai dengan 1.600
kilobase fragmen. 3. Contour-jepit Homogen Electric Fields (CHEF): CHEF adalah yang paling banyak digunakan aparat. Aparat CHEF memberikan solusi yang lebih canggih untuk efek distorsi kedua tepi ruang dan elektroda pasif. CHEF memiliki 24 point elektroda sama spasi sekitar kontur heksagonal. Dalam sistem CHEF, tidak ada ÒpassiveÓ elektroda. Semua elektroda dihubungkan ke catu daya melalui loop eksternal resistor, semua yang memiliki ketahanan yang sama. loop ini bertanggung jawab untuk pengaturan 50
tegangan dari semua elektroda sekitar kontur heksagonal terhadap nilai-nilai yang sesuai dengan generasi bidang seragam di setiap posisi switching alternatif. Sistem CHEF set tegangan pada ini 24 poin. Alat ini menghasilkan medan listrik yang cukup seragam sehingga semua jalur dari menjalankan gel lurus. CHEF menggunakan sudut reorientasi 120 ¡dengan gradiations penyinaran electropotential dari positif ke negatif pori-pori. Molekul Facebook untuk 7.000 kb dapat dipisahkan oleh CHEF (10). 4. Orthogonal-Lapangan Alternatif Gel Elektroforesis (OFAGE): Sebuah alat serupa yang menggunakan dua medan listrik nonhomogen dilaporkan oleh Carle dan Olson (17) pada tahun 1984. The kelemahan utama dari aparat adalah bahwa karena medan listrik tidak seragam, dan sudut antara medan listrik bervariasi di seluruh gel, molekul DNA bermigrasi di tingkat yang berbeda tergantung pada lokasi mereka di gel. Hal ini terutama bermasalah di pemetaan genom mamalia, di mana distribusi kontinu ukuran fragmen yang dihasilkan. Lane-ke-jalur comparisions dan estimasi ukuran untuk DNA genomik dicerna kurang langsung ketika band diskrit lebih sedikit yang dipisahkan, seperti dengan kromosom organisme yang lebih rendah seperti ragi. Sudut antara medan listrik bervariasi dari kurang dari 180 ¡dan lebih dari 90 ¡. Molekul DNA dari 1.000 sampai 2.000 kb dapat dipisahkan dalam OFAGE (17, 21). 5. Rotating Gel Elektroforesis (RGE): Di Inggris pada tahun 1987, Selatan (22) dijelaskan novel PFGE sistem yang berputar gel antara dua sudut mengatur sedangkan elektroda tidak aktif. Dalam RGE, medan listrik seragam dan band lurus karena hanya satu set elektroda adalah digunakan. RGE memudahkan untuk melakukan waktu dan ramping tegangan. Hal ini juga memungkinkan pengguna untuk mempelajari efek dari sudut yang berbeda, dan bahkan untuk bervariasi ini, selama percobaan-sudut ramping. RGE menggunakan bidang homogen tunggal dan perubahan orientasi medan listrik dalam kaitannya ke gel dengan terputus-putus dan secara berkala berputar gel. Switch kali terlalu lama di RGE. Molekul-molekul DNA bermigrasi di jalur lurus, karena bidang homogen, dan DNA molekul dari 50 kb menjadi 6.000 kb dapat dipisahkan dengan menyesuaikan frekuensi gel rotasi. Selain itu, sudut reorientasi dapat dengan mudah diubah hanya dengan mengubah sudut rotasi (2, 23). Berdenyut-Field Gel Elektroforesis (PFGE) Teknik dan penggunaannya dalam Biologi Molekular 408 6. Programmable mandiri-Controlled Elektroda (PACE): PACE The sistem elektroforesis menawarkan kontrol yang lebih tepat semua parameter medan listrik oleh peraturan independen dari tegangan pada tanggal 24 elektroda disusun dalam kontur tertutup. The fleksibilitas dari sistem PACE berasal dari kemampuannya untuk menghasilkan jumlah yang tidak terbatas listrik bidang homogenitas dikendalikan, gradien tegangan, orientasi dan durasi. The PACE sistem dapat melakukan semua bidang berdenyut sebelumnya beralih rejimen (FIGE yaitu, OFAGE, PHOGE, 51
berdenyut searah), serta menghasilkan tegangan dijepit bidang statis homogen. The sistem PACE memisahkan fragmen DNA dari 100 bp hingga lebih dari 6 Mb. Kemampuan untuk mengubah reorientasi sudut antara bidang bolak izin kecepatan peningkatan pemisahan untuk molekul DNA besar. Sebuah sistem komputer berbasis dikenal sebagai PACE, dirancang oleh Lai et al. (1) dapat PFGE menjadi perangkat utama. Ini adalah alat yang sangat berguna untuk mempelajari variabel seperti pulsa waktu, suhu, konsentrasi agarosa, tegangan dan sudut antara bidang mempengaruhi DNA migrasi PFGE (24). 7. Berdenyut-Homogen Orthogonal Lapangan Gel Elektroforesis (PHOGE): Mayor perbedaan antara instrumen dan kotak gel lainnya dengan medan listrik homogen adalah bahwa reorientasi sudut lapangan adalah 90 ¡. PHOGE menggunakan sudut reorientasi 90 ¡, namun DNA molekul menjalani empat reorientasi per siklus bukan dua. jalur DNA di PHOGE melakukan tidak berjalan lurus, sebuah fenomena yang telah dijelaskan untuk gel berjalan melibatkan beberapa bidang listrik dengan cara ini. Sistem ini memisahkan fragmen DNA hingga 1 Mb (23). Peralatan PFGE Komponen dasar dari suatu sistem PFGE terdiri dari kotak gel dengan beberapa cara suhu peraturan, satu unit switching untuk mengendalikan medan listrik, pendingin dan power suplai (1). Kotak Gel Desain dasar dari kotak PFGE terdiri dari gel amobil dalam array elektroda dan sarana yang beredar buffer elektroforesis. gradien tegangan dari 10 volt / cm umum digunakan dalam PFGE. Gradien Tegangan setinggi 15 volt / cm telah digunakan dalam bidang inversi pemisahan klon kosmid (1). Suhu buffer dikendalikan oleh mekanisme pertukaran panas. Umumnya, buffer adalah diresirkulasi seluruh kotak gel menggunakan inlet dan outlet port (17, 24). Pasokan Listrik Tegangan Tinggi kontrol tepat dari gradien medan listrik yang diperlukan untuk memperoleh PFGE konsisten perpisahan. peringkat Output catu daya karenanya harus cukup tinggi untuk memenuhi 409 E. (HACIOÚLU) Basim, H. Basim baik tegangan dan arus persyaratan dari kotak gel. Sebuah kotak PFGE khas gel telah elektroda yang adalah 25 sampai 50 cm. Untuk mencapai kisaran umum digunakan dari gradien tegangan sebesar 1,5 untuk 15 volt / cm membutuhkan power supply dengan tegangan maksimum 750 volt. The arus ditarik pada tegangan ini dalam kotak PFGE kebanyakan sekitar 0,5 ampere pada 14 ¡C menggunakan 0.5x TBE (1x TBE adalah 89 mM Tris pH:. 7 89 mM asam Borat dan 2 mM EDTA) sebagai penyangga berjalan (1). Switch Unit Kemampuan untuk mengendalikan reproducibly interval saklar sangat penting untuk pemisahan 52
(24). The terbatas kecepatan relay dapat beralih tidak akan mengakomodasi puasa switching diperlukan untuk PFGE pemisahan molekul DNA kecil (2-50 kb). Relay biasanya dikontrol oleh komputer. Untuk mengatasi kelemahan dari relay elektromekanik, tegangan tinggi solid-state elektronik telah menggantikan relay elektromekanik di baru-baru ini dirancang PFGE komersial sistem. Unit-unit switching ini umumnya didasarkan pada penggunaan semikonduktor oksida logam transistor efek medan (MOSFET) di switching baik dan elektroda sirkuit kontrol tegangan. Desain ini menawarkan keuntungan dari peningkatan kehandalan, kemampuan kecepatan tinggi switching (0,1 ms) dan tegangan yang cukup (750 V) dan arus (0,5 ampere) peringkat (1). Ini aparat memiliki kemampuan untuk mengontrol sudut reorientasi antara medan listrik. Namun, instrumen tersebut tidak dapat menyediakan cukup cepat switching untuk perbaikan pemisahan molekul DNA yang lebih kecil dari 50 kb. Program Komputer kontrol hati-hati dari interval switch sangat penting dalam mengendalikan resolusi di PFGE. A unit switching serbaguna harus memiliki perangkat lunak dengan karakteristik yang sama. Algoritma harus cukup cepat sehingga kali beralih setidaknya sesingkat 1 ms dapat dicapai dan beralih increment interval harus memiliki minimal resolusi 1 ms. Linear beralih ramping Interval telah menjadi prosedur yang paling sering digunakan karena pelaksanaannya sederhana. maksimum run time harus sekitar dua minggu untuk memungkinkan pemisahan molekul DNA yang sangat besar. Hal ini dikendalikan oleh sebuah program komputer (1). Cooler resirkulasi Penyangga merupakan faktor penting, karena menghilangkan variasi suhu di dalam gel sehingga dapat mengurangi kerusakan buffer karena elektrolisis. migrasi molekul DNA sensitif untuk suhu, dan dengan demikian suhu seragam di seluruh gel diperlukan untuk memastikan bahkan migrasi di masing-masing jalur. Buffer diresirkulasi melalui ruang gel oleh reciprocating solenoid pompa pada laju sekitar 450 ml / menit. buffer ini dingin dalam tangki reservoir dengan dingin air (5 ¡C) beredar melalui kaca tabung penukar panas. Buffer suhu demikian dipertahankan pada 13-15 ¡C seluruh lari khas (17, 24). Berdenyut-Field Gel Elektroforesis (PFGE) Teknik dan penggunaannya dalam Biologi Molekular 410 Menjalankan Kondisi PFGE pemisahan PFGE peka terhadap berbagai molekul dan lingkungan yang berbeda variabel. Prinsip variabel yang signifikan adalah sifat molekul DNA, nadi waktu, bentuk listrik lapangan, kuat medan listrik, komposisi gel, sampel konsentrasi dan suhu. 1. Pulse Waktu: Dalam PFGE, DNA dikenakan bergantian untuk dua medan listrik pada waktu yang berbeda sudut waktu yang disebut waktu pulsa. Molekul-molekul mungkin harus mengubah arah 53
sebelumnya untuk gerak translasi bersih. Setiap kali lapangan diaktifkan, molekul yang lebih besar lebih lama perubahan arah dan memiliki sedikit waktu untuk bergerak selama pulsa masing-masing, sehingga mereka bermigrasi lebih lambat dari molekul yang lebih kecil. Molekul sangat kecil sehingga waktu reorientasi mereka adalah singkat dibandingkan dengan waktu pulsa akan menghabiskan sebagian besar durasi pulsa dalam gerak elektroforetik konvensional dimana Ukuran resolusi sangat terbatas. Sebagai akibatnya, resolusi di PFGE kemungkinan besar akan optimal untuk molekul dengan waktu reorientasi sebanding dengan waktu pulsa. Pada kuat medan penerapan sekitar 10 V / cm, 0,1 kali s pulsa menyelesaikan DNA secara optimal dalam berbagai ukuran 5kb, sementara pulsa kali 1.000 s pada 3 / cm V digunakan untuk menyelesaikan 3-7 molekul Mb. Pulse kali dipilih sehingga bahwa molekul DNA dengan ukuran yang ditargetkan menghabiskan sebagian besar durasi pulsa reorientasi daripada bergerak melalui gel, yang account untuk jangka waktu yang lama, biasanya hari atau minggu, diperlukan untuk fraksinasi molekul DNA besar. Molekul DNA kromosom Saccharomyces cerevisiae dalam kisaran 10 Mb membutuhkan elektroforesis semakin besar variabel sekitar satu minggu (25). 2. Bidang Listrik Bentuk: Sejumlah konfigurasi berbeda medan listrik adalah digunakan dalam percobaan PFGE awal. Itu jelas bahwa aspek-aspek tertentu pada bentuk bidang yang penting dalam mencapai pemisahan resolusi tinggi PFGE. kuat medan listrik dapat disesuaikan untuk menyempurnakan berbagai ukuran resolusi PFGE efektif. Resolusi PFGE dipengaruhi dengan jumlah dan konfigurasi elektroda yang digunakan, karena mengubah bentuk diterapkan medan listrik. Variabel yang paling penting tampaknya sudut antara alternatif bidang listrik. Konfigurasi elektroda yang paling efektif menghasilkan sudut lebih dari 110 ¡. A sudut terus meningkat antara ladang menghasilkan band penajaman yang sangat meningkatkan resolusi. Sudut antara bidang alternatif selalu lebih besar dari 90 ¡mana yang baik resolusi diamati. Dalam kasus resolusi yang sangat baik, sudut lapangan biasanya berkisar dari 120 ¡ untuk 150 ¡. Sebaliknya, di mana resolusi miskin terlihat, sudut-sudut lapangan biasanya berkisar dari 110 ¡¡ke 150 (25). Sudut 90 ¡atau lebih kecil tidak efektif, mungkin karena DNA molekul mudah menjadi berorientasi di tengah-tengah antara dua bidang yang diterapkan. Sudut yang lebih besar dari 90 ¡lebih efektif (25). Sementara studi selengkapnya mengenai sudut optimal yang diperlukan, maka jelas bahwa sudut dalam kisaran 120 -150 ¡¡menyediakan sangat resolusi tinggi (25). Lapangan kekuatan yang mengurangi, atau sudut yang meningkatkan, semakin sepanjang arah gerakan DNA bersih menghasilkan band mengasah karena molekul di bagian depan masing-masing zona DNA selalu 54
bermigrasi lebih lambat dari orang-orang di belakang. 411 E. (HACIOÚLU) Basim, H. Basim 3. Listrik Field Strength: mobilitas Elektroforesis didefinisikan sebagai kecepatan per unit lapangan. Dalam elektroforesis biasa kebanyakan, mobilitas adalah independen dari kekuatan medan. Ini kemerdekaan diharapkan jika sifat-sifat molekul tidak langsung diubah oleh proses pemisahan. Kekuatan lapangan mempengaruhi mobilitas dalam dua cara. Mobilitas dari 100-500 kb DNA menunjukkan ketergantungan sekitar linier pada kekuatan lapangan. Kekuatan lapangan mempengaruhi ukuran DNA transisi antara dua zona resolusi (25). 4. Reorientasi Angle: The pelebaran sudut reorientasi akan menghasilkan band tajam dan resolusi yang lebih baik. Pemisahan kromosom ragi hampir identik bagi mereka kromosom dipisahkan dengan sudut reorientasi 110 dan 165 ¡¡. Namun, ketika reorientasi sudut dari 105 ke 165 ¡¡digunakan untuk memisahkan molekul dengan ukuran S. cerevisiae (200-3,000 kb), ada perbedaan 4 kali lipat antara kecepatan DNA diamati dengan berbeda ini sudut (1). Peningkatan mobilitas diperoleh dengan sudut reorientasi kecil bahkan lebih menonjol ketika memisahkan molekul yang lebih besar. Kebanyakan tersedia secara komersial berdenyut-bidang kotak gel menggunakan sudut tetap sebesar 120 ¡antara bidang bergantian. 5. Voltage: Seperti waktu switch, pilihan dari tegangan yang digunakan dalam PFGE juga harus bervariasi dengan ukuran DNA yang akan dipisahkan. Sedangkan gradien tegangan 6-10 / cm V dapat digunakan untuk molekul yang terpisah sampai 1 Mb, memecahkan molekul lebih besar dari ini dalam bidang gel berdenyut membutuhkan penurunan gradien tegangan (14, 24). Pemisahan kromosom dari ragi S. pombe (3 Mb, 5 Mb dan 6 Mb) mensyaratkan bahwa gradien tegangan tidak melebihi 2 V / cm. Bahkan lebih besar kromosom crassa N. (lebih besar dari 12 Mb) dipisahkan sebesar 1,5 / cm V (15). Praktis efek adalah untuk meningkatkan waktu habis untuk molekul DNA yang lebih besar. Dengan demikian, pemisahan elektroforesis kromosom crassa N. dibutuhkan sampai 7 hari. Ketika gradien tegangan direduksi menjadi DNA besar yang terpisah, interval switching harus diperpanjang (15). 6. Suhu: Dalam elektroforesis gel konvensional, molekul DNA dijalankan di kamar temperatur tetapi, di PFGE, DNA dijalankan pada suhu rendah (antara 4 ¡¡C dan 15 C). Suhu memiliki efek dramatis pada mobilitas DNA dalam PFGE. Suhu antara 14 ¡C dan 22 ¡C umumnya dianggap sebagai kompromi terbaik antara kecepatan dan resolusi sementara gel dapat dijalankan pada suhu kamar, biasanya diperlukan untuk mengedarkan buffer melalui panas exchanger untuk mengusir panas yang dihasilkan oleh gradien tegangan yang digunakan selama paling berdenyut lapangan berjalan (2, 25). Kecepatan DNA lambda di 34 ¡C dua kali bahwa pada 4 ¡C. Namun, gel jalankan pada temperatur setinggi 34 ¡C menunjukkan berkurang resolusi (1). 55
7. interval Switch: Determinan terpenting mobilitas di PFGE adalah interval di mana arah medan listrik diaktifkan. Jika interval switching meningkat di luar waktu yang dibutuhkan untuk fragmen untuk reorientasi, maka fragmen akan menghabiskan sebagian besar jangka gel bermigrasi, seperti dalam elektroforesis konvensional, dengan kerugian yang dihasilkan dalam resolusi. Pemilihan interval switching yang tepat untuk PFGE harus mencerminkan ukuran berbagai fragmen untuk diselesaikan. Birren et al. (24) telah mengukur kecepatan DNA molekul dari 50 sampai 1.000 kb di PFGE dengan waktu beralih dari 5-300 s. Tertinggi Berdenyut-Field Gel Elektroforesis (PFGE) Teknik dan penggunaannya dalam Biologi Molekular 412 resolusi untuk molekul dengan ukuran yang diberikan diperoleh dengan menggunakan saklar interval terpendek yang izin pemisahan dari berbagai ukuran lengkap dari fragmen (26). 8. Agarosa Konsentrasi: Konsentrasi agarosa akan mempengaruhi pemisahan diperoleh dengan PFGE. Migrasi DNA yang lebih cepat terjadi pada gel agarosa konsentrasi rendah. DNA The monomer (48,5 kb) bermigrasi 50% lebih cepat dalam PFGE sebesar 0,6% dibandingkan dengan agarose gel 1%. The pita DNA yang cukup menyebar di gel 0,7% menjadi semakin tajam seperti agarosa yang konsentrasi dibesarkan di 1,4% dan 1,8% gel berulang kali identik. Jarak bermigrasi oleh sampel identik menunjukkan penurunan dalam kecepatan sebagai konsentrasi agarosa adalah meningkat (24). 9. Restriction Enzim: Kemampuan enzim restriksi (RES) untuk memotong DNA pada spesifik urutan basa telah sangat merangsang pertumbuhan teknologi DNA rekombinan. Atas 1.900 Res diketahui, dan ada 275 yang tersedia dari perusahaan yang berbasis di seluruh dunia (27). Enzim restriksi umum, EcoR I dan Hind III, mencerna bakteri dan mamalia DNA untuk fragmen rata-rata sekitar 4 kb dalam ukuran terlalu kecil untuk PFGE. Untuk ini Alasannya, disarankan untuk menggunakan enzim yang memiliki situs relatif sedikit dan memberikan fragmen-fragmen yang lebih besar dari DNA target dalam PFGE (27). Setiap enzim memproduksi sejumlah besar fragmen kecil (Lebih kecil dari 10 kb) adalah tidak mungkin berguna untuk PFGE dan pemetaan. Faktor utama dalam memilih enzim restriksi yang cocok adalah komposisi dasar (% G + C content) dari DNA target. Analisis oleh PFGE dan enzim langka-restriksi telah berguna untuk mendapatkan yang relevan informasi tentang ukuran genom, karakteristik berbagai strain di tingkat DNA (28), menyusul sejarah genetik strain tertentu, membangun peta fisik dan genetik dari bakteri kromosom kromosom dan dinamika belajar antara bakteri (29-31). Enzim yang mengenali urutan lebih besar dari 6 pb yang berpotensi berguna dalam pemetaan genom karena mereka menghasilkan fragmen besar (27). Saat ini, ada sembilan pembatasan enzim komersial tersedia dengan urutan pengakuan 8-bp. Dari jumlah tersebut, Bukan aku, SFI saya, SRF aku, Ase I, Pac I dan Swa saya jarang-pemotong dalam genom dengan kandungan G + C sekitar 35-55%. Bawah dan di atas ini 56
margin jumlah fragmen menjadi terlalu kecil dan terlalu besar, masing-masing. Pac Saya (AATTAATT), Swa I (ATTTAAAT), PME I (GTTTAAAC) dan SSE 83871 (CCTGCAGG) yang baru pasar (32). Di sisi lain, Pac I dan Swa aku enzim akan berguna khususnya bagi genom dengan isi G + C pada kisaran 45-65% (32). Pasangan 4-bp urutan 5O-CTAG3o tampaknya dipilih melawan dalam genom bakteri yang paling (33). tetranucleotide ini merupakan bagian dari urutan pengakuan Spe I (A / CTAGT), Xba I (T / CTAGA), nhé I (G / CTAGC) dan Avr II (C / CTAGG). CTAG jarang ditemukan pada prokariota paling dan endonuklease restriksi bahwa menyertakan urutan urutan pengakuan mereka dipotong genom bakteri jarang (32). PFGE besar fragmen DNA yang dihasilkan menggunakan jarang memotong Swa I dan Pac saya endonuklease restriksi yang digunakan dalam analisis genom axonopodis Xanthomonas pv. vesicatoria, agen penyebab penyakit bercak daun lada dan tomat, dan kondisi yang optimal untuk pencernaan dalam analisis genom ditentukan (26, 34-36). 413 E. (HACIOÚLU) Basim, H. Basim Berdenyut-Bidang Aplikasi Penuh pemahaman sistem biologi membutuhkan pengetahuan tentang struktur dan fungsi gen dan pengaturan mereka pada kromosom. PFGE telah digunakan untuk memisahkan DNA molekul sama besar dengan 12 Mb. Kemampuan untuk menganalisis fragmen besar seperti akan sangat memudahkan peta pembangunan fisik (1). Kemampuan untuk memisahkan, mengisolasi dan menganalisis megabase ukuran fragmen DNA sudah memberikan wawasan ke dalam organisasi genom organisme yang beragam seperti bakteri dan manusia (2). PFGE digunakan dalam bidang-bidang berikut: 1. Munculnya teknik PFGE untuk resolusi molekul DNA yang besar telah memberikan pendekatan baru analisis untuk genom bakteri (37). The PFGE fragmen DNA yang diperoleh menggunakan enzim berbeda adalah teknik yang kuat untuk resolusi cepat dari genom bakteri menjadi beberapa fragmen besar kecil. 2. The PFGE fragmen DNA yang diperoleh dengan menggunakan endonuklease menghasilkan pola diskrit band berguna untuk pemetaan sidik jari dan fisik dari kromosom (38). 3. PFGE Teknik ini berguna untuk menentukan tingkat keterkaitan antara berbagai strain dari spesies yang sama (38). 4. PFGE telah terbukti menjadi metode yang efisien untuk estimasi ukuran genom dan konstruksi peta kromosom, serta menjadi berguna untuk karakterisasi bakteri spesies (39-41). PFGE teknologi telah terbukti tak ternilai untuk perkiraan yang akurat dari genom ukuran dan dalam konstruksi peta fisik beragam organisme prokariotik 57
(42,43). 5. PFGE adalah alat yang ampuh untuk karakterisasi genom dan telah menyebabkan pembangunan peta fisik lebih dari 180 kromosom bakteri (44). 6. PFGE telah terbukti sangat kuat dalam analisis molekul DNA besar dari berbagai sumber termasuk DNA kromosom utuh dari jamur (16), protozoa parasit (45) dan khususnya terfragmentasi genom bakteri (26, 38) dan mamalia (5, 6). 7. PFGE menyederhanakan banyak penyelidikan melelahkan sebelumnya dan membuat banyak kemungkinan baru investigasi. Teknik ini telah digunakan secara luas dalam aplikasi untuk semua organisme dari bakteri virus (2). 8. Ragi Buatan Kromosom (YAC) perpustakaan telah dibangun oleh PFGE (2). 9. PFGE eksperimen digunakan dalam pembangunan tikus transgenik (2). 10. PFGE juga telah menunjukkan dirinya berguna dalam studi mengenai radiasi dan kerusakan DNA yang diinduksi perbaikan, ukuran organisasi dan variasi dalam centromers mamalia (2, 46). Berdenyut-Field Gel Elektroforesis (PFGE) Teknik dan penggunaannya dalam Biologi Molekular 414 11. Banyak investigasi langsung melibatkan studi organisasi genom. Misalnya, dalam menentukan kedekatan fisik dari dua gen, sedangkan menentukan ukuran gen sangat besar atau saat mengidentifikasi lokasi istirahat kromosom (2, 46). 12. PFGE akan memainkan peran utama dalam pemetaan genom manusia (47). Fisik pemetaan kromosom manusia melibatkan pemesanan dan mengukur jarak antara menetapkan penanda DNA yang unik untuk kromosom itu. Mengingat ukuran besar dari kromosom terlibat (50,000-300,000 kb), PFGE adalah metode untuk mengejar (47). 13. PFGE digunakan untuk menentukan urutan penanda lebih tepat daripada yang dimungkinkan dengan analisis keterkaitan genetik, dan dengan peta PFGE tersedia, spidol baru dapat dengan cepat dilokalisasi dalam bahwa daerah (32). 14. Sebuah mutasi baru dapat dipetakan dengan kloning gen, diikuti dengan analisis restriksi dan hibridisasi, untuk satu set fragmen restriksi yang diperintahkan oleh PFGE (47). 15. PFGE akan sangat memudahkan pemilihan tepat fragmen DNA besar untuk kloning. RES yang spesifik untuk memotong urutan jarang terjadi, digunakan untuk membuat DNA besar fragmen yang kemudian dipisahkan oleh PFGE. Dengan blotting dan hibridisasi fragmen mengandung gen yang diinginkan ditentukan. Wilayah ini pulih dari gel dan kloning (2, 23). 16. PFGE memungkinkan untuk isolasi mudah dari fragmen restriksi individu untuk 58
lebih lanjut pembatasan pemetaan, penyisipan gen dan pemetaan gen fungsional (13). Hasil Perkembangan PFGE selama dekade terakhir telah menyebabkan koleksi cerdik desain yang bisa diterapkan. instrumen TodayÕs menyelesaikan pesanan DNA beberapa kali lipat lebih besar dari dimungkinkan dengan elektroforesis konvensional, yang memungkinkan studi langsung utuh kromosom dari ragi dan parasit manusia. Penyelidikan saat ini berpusat pada yang lebih baik pemahaman teknik ini, yang akan mendukung desain generasi baru dari perangkat untuk memisahkan fragmen yang lebih besar dan, akhirnya, seluruh genom manusia. Analisis seluruh genom merupakan pendekatan revolusioner untuk genetika, dan ketersediaan jumlah besar informasi dari proyek-proyek ini akan memungkinkan baru konseptual pendekatan dalam banyak bidang penelitian biologi. Hal ini jelas bahwa pada saat ini, tidak ada satu teknik atau strategi sudah cukup untuk menyusun peta kromosom manusia utuh. Namun, penggunaan gabungan banyak teknik baru yang kuat membawa analisis genom mamalia dalam jangkauan. PFGE telah memungkinkan pengembangan sistem kloning YAC dan akan memainkan utama peran dalam pemetaan genom manusia. Teknik PFGE akan berguna untuk membangun tingkat keterkaitan antara strain yang berbeda dari spesies yang sama. 415 E. (HACIOÚLU) Basim, H. Basim aplikasi Masa Depan untuk teknik PFGE mungkin termasuk perpisahan protein dan asam nukleat sequencing dan studi tentang topologi DNA. PFGE memungkinkan konstruksi fisikmap untuk hampir setiap organisme. teknik PFGE harus segera menyediakan peta fisik dan aplikasi mereka untuk sejumlah luas mikroorganisme. Sebagai metode pemetaan fisik dengan cepat menggusur genetik metode untuk tugas kromosom, adalah penting untuk memahami perilaku DNA sirkular spesies di gel berdenyut-lapangan. Analisis dengan PFGE dapat digunakan untuk menetapkan peta jangka panjang berdasarkan penanda anonim yang telah terbukti secara genetik terkait. Idealnya, daerah ditargetkan sudah jenuh dengan spidol, memungkinkan pembangunan beberapa peta tumpang tindih. Namun, untuk genom tanaman, spidol jarang berkelompok dengan kepadatan yang cukup untuk memungkinkan pembangunan segera peta rinci berdasarkan beberapa spidol.
59