Development and validation of quantitative methods for the analysis of [PDF]

University of Oviedo Department of Physical and Analytical Chemistry

”Development and validation of quantitative methods for the analysis of clinical biomarkers of iron metabolism applying stable isotopes”

Dissertation

Tobias Konz April 2014

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esta hormona peptídica de 25 aminoácidos. Así, a lo largo de esta década se han desarrollado diferentes metodologías que se puede dividir en aquellas que se basan en el empleo de anticuerpos ó en las que emplean espectrometría molecular (líquidos masas ó SELDI-MS). Ambos tipos de métodos pueden servir para la cuantificación de la hormona hepcidina-25. De todas formas se debe considerar que las dos estrategias están acompañadas por algunas desventajas. En concreto, en el caso de la cuantificación que se basa en el empleo de anticuerpos, el reconocimieto del analíto (la hepcidina-25) es su punto débil: debido a su tamaño pequeño de solo 25 aminoácidos ofrece poco determinante antigénico por lo cual puede dar lugar a reactividad cruzada con otras isoformas de la hepcidina-25. Eso, finalmente, puede implicar la obtención de resultados sobreestimados. Por otro lado, la determinación del péptido por líquidos masas se basa en el empleo de estándares internos. Estos compuestos deben tener el mismo compartamiento químico, para lo cual se suelen utilizar moléculas de la misma estructura, marcadas con isótopos pesados. En el caso de la hepcidina-25 la síntesis de un estándar adecuado es laboriosa por su compleja estructura. Por todo esto, el trabajo realizado ha sido focalizado hacia el desarrollo de un nuevo método para el análisis de la hepcidina a través de la detección de azufre, utilizando el ICP-MS como detector tras llevar a cabo una cromatografía líquida capilar para la separación de las especies. El azufre (que esta presente en nueve de los 25 aminoácidos de la hepcidina-25) se puede detectar por ICP-MS después de la eliminación de interferencias. Para ello, hemos comparado tres detectores ICP-MS empleando distintas estrategias para superar las interferencias poliatómicas de azufre (p.e. celdas de colisión, doble enfoque y medida sobre el óxido). El equipo ICP-MS de doble enfoque ofreció los mejores límites de detección, una buena precisión y exactitud. Se obtuvieron recuperaciones cuantitativas del péptido estándar con la configuración propuesta (CapLC-ICP-MS) después de controlar la temperatura de la columna (50°C). A continuación, se estudiaron diferentes procedimientos de limpieza de la muestra con el fin de aplicar la metodología cuantitativa desarrollada a muestras de orina. Los mejores resultados se obtuvieron mediante una combinación de diálisis y extracción por fase sólida. Los extractos tratados se analizaron simultáneamente por la configuración CapLC-ICP-MS y también por CapLC-ESI-Q-TOF con fines confirmatorios. Los resultados obtenidos revelaron que la detección por ESI-Q-TOF es más adecuada para la determinación de hepcidina en las muestras de orina con respecto tanto a la selectividad como a la sensibilidad, debido a los bajos límites de deteción de azufre por ICP-MS. 2. Determinación de hepcidina mediante HPLC-ICP-MS tras el marcaje selectivo de la misma empleando metales bivalentes (Cu2+). Teniendo en cuenta las limitaciones de la cuantificación de la hepcidina-25 mediante la detección de azufre este capítulo se centró en el empleo de una metodología de marcaje. Siguiendo una filosofía de trabajo análoga a la que se emplea en estudios de proteómica, se aprovechará una propiedad característica de la hepcidina-25 de formar complejos con metales divalentes como Cu2+ o Ni2+ [3,4]. Este tipo de unión selectiva puede permitir la cuantificación del péptido. En nuestro caso, utilizamos una cromatografía de cambio aniónico acoplada a espectrometría de masas (LC-ICP-MS) para llevar a cabo la cuantificación de hepcidina-25 a través de detección de Cu. Para este propósito, la condiciones de incubación (entre la hepcidina-25 y Cu2+) fueron optimizados. Se encontró que el complejo “Cu:hepcidina-25” es estable bajo condiciones fisiológicas y muestra una estequiometría equimolar (1:1). Para la cuantificación de la hepcidina-25, se desarrollaron dos estrategias basadas en dilución isótopica. La primera de ellas, basada en la adición post-columna de un trazador de 65Cu (dilución isotópica post-columna o inespecífica), y en segundo lugar, mediante la síntesis del complejo “65Cu:hepcidina-25” empleado como trazador (dilución isotópica específica). Ambos métodos han sido optimizados y comparados críticamente en muestras reales. La determinación de hepcidina-25 en diferentes muestras de suero mostró una concentración promedia de 21,6 ng mL-1, que está de acuerdo con los datos publicados anteriormente. 3. Desarrollo de un método de determinación de la ferritina sérica mediante un ensayo inmunoquímico tipo “Sandwich” y detección por ICP-MS. La metodología desarrollada para la cuantificación precisa y exacta de la ferritina seríca consiste en un ensayo inmunológico tipo

“Sandwich” para el cual se emplearon dos anticuerpos monoclonales de ferritina: uno de ellos biotinilado y el otro marcado con un quelato de rutenio [Ru(bpy)3]2+. En disolución se forma un complejo entre la ferritina y los dos anticuerpos. El uso de micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina permite arrastrar el analíto así como la fácil eliminación del exceso de anticuerpos y especies libres. A continuación, se introdujo la suspensión directamente en el ICP-MS mediante FIA (análisis por inyección en flujo). Dado que el complejo de Ru también permite la cuantificación por quimioluminiscencia electrogenerada (ECL), la combinación de ambos datos (ICP-MS y ECL) permitó establecer la estequiometría entre la ferritina y Ru (~1:23). Esto proporciona una base para estudios de cuantificación de la proteina mediante el análisis por inyección en flujo (FIA) utilizando 99Ru isotópicamente enriquecido (dilución isotópica post-FIA). La estrategia desarollada permite la cuantificación de la ferritina absoluta a nivel picomolar con buena precisión (por debajo de 5%) y niveles alrededor de 87-102% de recuperación en un material de referencia de ferritina (Código NIBSC 94/572). 4. Puesta a punto de un método de determinación del Fe presente en la ferritina sérica. La cuantificacion del hierro presente en la ferritina se realizó mediante dos estrategías diferentes. En la primera aproximación se vio que era necesario eliminar otras especies que contienen hierro. Aunque inicialmente se empleó la estrategía desarollada para la cuantificación de ferritina por detección de Ru que se basa en el uso de micropartículas magnéticas (ver sección 3.3). Los resultados obtenidos no fueron satisfactorios ya que el núcleo férrico del estas partículas causó un alto grado de contaminación de hierro, por lo que fue necesario evitar su empleo. Como consecuencia se desarolló una estrategia de purificación multi-dimensional para aislar el analíto. De esta manera se llevó a cabo la cuantificación del hierro presente en la ferritina por dilución isotópica inespecífica en muestras totales. Para la segunda estrategía se ha sintetizado y caracterizado ferritina enriquecida en 57Fe. Este trazador permite la cuantificación del hierro unido a la ferritina seríca mediante HPLC acoplado a ICP-MS, empleando dilución isotópica específica. Con la concentración de hierro determinado por ICP-MS y la concentración de la ferritina (deteminado por ECL) se pudo calcular las proporciones entre hierro y ferritina, indicando su potencial como un nuevo biomarcador clínico en desórdenes del metabolismo del hierro. RESUMEN (en Inglés)

The continuous discovery of new biomarkers is reflected in current clinical practice and also in the bibliography. The urgent need to determine the values of such clinical parameters (biomarkers) in biological fluids is driving the development of new analytical methodologies capable of providing quantitative, precise, accurate and validated information on the concentration of these biomarkers, in control individuals as well as in patients affected by the pathologies in study. In this regard, diseases associated with disorders of the iron metabolism affect a significant proportion of the population, especially in the case of iron deficiencies (e.g. Fe-dependent anemia) as well as iron overload (e.g. Hereditary Hemochromatosis). Today, the analysis of the main clinical biomarkers of iron homeostasis is performed routinely in human serum. Among them, ferritin, the iron storage protein, is one of the most important parameters with great informative value. The serum ferritin concentration forms part of a series of values that are routinely determined to assess the iron status in the patient. Additionally, in 2001, a peptide hormone called hepcidin-25 was discovered, which is synthesized in the liver. In several studies it was demonstrated that this peptide provides important complementary information on the general iron status in the body due to the fact that it is the central regulator of iron metabolism. Despite their importance, there is currently a lack of analytical methodologies validated for determination of these biomarkers (in particular the hepcidin-25) that are necessary for validation. It is, therefore, essential to develop new analytical methodologies for the reliable determination of clinical biomarkers related to the iron metabolism. In addition, it would be of interest to investigate new parameters (e.g. the ferritin-bound Fe to ferritin ratio) to check if both ferritin and hepcidin-25 may serve as novel biomarkers of iron metabolism.

In this context, the main objective of the present dissertation is the development and validation of quantitative methods based on the use of stable isotopes for the determination of clinical biomarkers in disorders of iron metabolism. This overall purpose was pursued through the following specific objectives: 1. Development of a strategy of quantification of the peptide hepcidin-25 in human urine by HPLCICP-MS. Since the first publications dealing with hepcidin-25 and its biological function, more than one decade ago, many progresses have been made in the quantification of this peptide hormone. Thus, throughout this decade various methodologies have been developed that can be divided into antibodies-based techniques and those that employ molecular spectrometry (SELDI-MS or LC-MS). Both types of methods can be used for the quantification of the hormone hepcidin-25. However, it should be taken into account that both strategies are accompanied by some disadvantages. In particular, in the case of quantification based on the use of antibodies, the recognition of the analyte (hepcidin-25) is its weak point: due to its small size of only 25 amino acids offers low antigenic determinants which can result in cross-reactivity with other isoforms of the hepcidin-25. On the other hand, the determination of this peptide by LC-MS is based on the use of internal standards. These compounds should have the same chemical behavior, for which commonly molecules of the same structure, marked with heavy isotopes, are used. In the case of the hepcidin-25 the synthesis of an appropriate standard is laborious due to its complex structure. Thus, the work has been focused towards the development of a new method for the analysis of the hepcidin through the detection of sulfur, using ICP-MS as a detector after capillary liquid chromatography for the separation of the species. Sulfur (which is present in nine of the 25 amino acids of the hepcidin-25) can be detected by ICP-MS after the elimination of spectral interferences. For this purpose, three different ICP-MS instruments were compared with each other where each of them uses a different strategy to eliminate the polyatomic interference (e.g. collision cell, sector field (SF) and formation of oxides). Finally, ICPSF-MS offered the best limits of detection, accuracy and precision. Quantitative recoveries of the peptide standard with the proposed configuration (µLC-ICP-MS) were obtained maintaining the column temperature at 50°C. Then, various cleaning procedures of the sample were studied in order to apply the quantitative methodology developed to urine samples. The best results were obtained by a combination of dialysis and solid phase extraction. The treated extracts were analyzed by CapLC-ICPMS and also by µLC-ESI-Q-TOF for confirmatory purposes. The results revealed that screening by ESI-Q-TOF is more suitable for the determination of hepcidin in urine samples regarding both the selectivity and sensitivity, due to the low limits of detection of sulfur by ICP-MS. 2. Evaluation of a direct chemical labeling strategy with metal ions for the quantitative analysis of hepcidin in serum samples. Taking into account the limitations of quantification of hepcidin-25 through the detection of sulfur, the second objective focused on the use of a labeling strategy which takes advantage of hepcidin's affinity to form stable complexes with bivalent metal ions such as Cu. This type of selective union allowed the quantification of the peptide employing anion exchange chromatography coupled to mass spectrometry (LC-ICP-MS) through detection of Cu. For this purpose, conditions of incubation (between the hepcidin-25 and Cu2+) were optimized. It was found that the complex "Cu:hepcidin-25" is stable under physiological conditions and shows a equimolar stoichiometry (1:1). Two isotope dilution strategies were developed for the quantification of the hepcidin-25. The first one was based on the post-column addition of a 65Cu tracer (species-unspecific or post-column isotope dilution analysis), and secondly, by the synthesis of the complex "65Cu:hepcidin-25" used as spike (species-specific isotope dilution analysis). Both methods were critically compared with each other as well as to a commercially available ELISA kit. The determination of hepcidin-25 in different serum samples showed a concentration average of about 21.6 ng mL-1, which is in agreement with previously published #"$%&'()$*"*)*"+)$),-."./*01#. 2  6 6  82689 6    6633445 662648689334 3436 6 3 6  3 536653 9 3 8 8945  3668 6786 34486634 6868936 6 3266634 698 6  653 9 3 89:236 6 8;  45 :2>:22? !*$( 46  6

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7 Appendix

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