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Elisa 107,265 views Share Like ...
LABIMUNO UFBA, Docente at UFBA, Instituto de Ciências da Saúde Follow CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
http://www.elisa-development.com/
Published on Mar 17, 2010 Published in: Technology, Business 12 Comments 138 Likes Statistics Notes
Full Name Comment goes here. 12 hours ago Delete Reply Spam Block Are you sure you want to Yes No Your message goes here
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- Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específ... João Lopes de Sousa , Professor at Secretaria de Educação do DF Otimo material 7 months ago Reply Are you sure you want to Yes No Your message goes here
rimshaawan7 superbb............. 11 months ago Reply Are you sure you want to Yes No Your message goes here
GustavooOreis Ótimo. Bem didático e esclarecedor! 1 year ago Reply Are you sure you want to Yes No Your message goes here Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de qu... suzi clei ludovico guimaraes eu quero saber passo a passo os reagentes que se usa para realizar um texte elisa decaptura para dengue. 3 years ago Reply Are you sure you want to Yes No Your message goes here
farda22 !!!!!!!!! 4 years ago Reply Are you sure you want to Yes No Your message goes here Show More
Andréia Santos 1 month ago Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno i... Rosana Pereira at Banco do Nordeste 1 month ago
Saullo Diego , farmacêutico gerente at Hospital de Messejana Dr. Carlso Alberto Studart Gomes 2 months ago
vanessa0503 2 months ago
Antonio Carlos Medeiros , -- at Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - UERN 3 months ago Show More No Downloads Views Total views 107,265 On SlideShare 0 É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Elementos nece... From Embeds 0 Number of Embeds 521 Actions Shares 0 Downloads 0 Comments 12 Likes 138 Embeds 0 No embeds No notes for slide
Elisa 1. 1. E FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
ELISA
(enzyme-linkedimmunosorbentassay)
http://www.elisa-development.com/
Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Ludmilla Soares Sena sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
2. 2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
http://www.elisa-development.com/
Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac) 3. 3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura. 4. 4. Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades mínimas de uma substância em particular e com grande confiabilidade. 5. 5. Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas. 6. 6. É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Elementos necessários para a realização: 7. 7. Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac) 8. 8. Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag) 9. 9. Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos 10. 10. Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos 11. 11. Amostras a serem testadas 12. 12. Placa de poliestireno 13. 13. Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes 14. 14. Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima 15. 15. Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor 16. 16. Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO)
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Elementos necessários para a realização:
http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89
http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html
Placas de ELISA
http://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.html
Leitoras de ELISA
http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96cbc7f/placa_elisa.jpg
17. 17. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Vantagens 18. 18. Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsosAc purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag) negativos. 19. 19. Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos. 20. 20. Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo. 21. 21. Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
CARACTERÍSTICAS BÁSICAS
- Desvantagens 22. 22. Necessidade de mão de obraespecializada. 23. 23. Algunsreagentespodemdegradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadastemperaturas. 24. 24. Por ser umatécnicaaltamentesensível e específica, é muitosusceptível a erros de pipetagem, variaçõesnos tempos de incubação e lavagens, e alteraçõesnosreagentes.
PRINCIPAIS TIPOS
http://www.elisa-development.com/
25. 25. PRINCIPAIS TIPOS
- INDIRETO: detecta principalmente Ac 26. 26. SANDUÍCHE: detecta principalmente Ag 27. 27. COMPETIÇÃO: detecta Agcom baixo peso molecular (monovalentes) 28. 28. CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide)
ELISA INDIRETO
1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços
3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags
Y
Y
Y
4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags
Y
Y
Y
Y
5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs
Y
6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre
7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
Antígeno
Conjugado
Y
Anticorpo
Cromógeno
29. 29. ELISA INDIRETO
- Interpretação dos resultados: 30. 30. A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da amostra pesquisada. 31. 31. Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio. Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os negativos.
Contr. Negativo ->
Cut-off->
Contr. Positivo->
http://www.labimuno.org.br/ensino.cfm? load=aulas
- O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.
ELISA INDIRETO
- Aplicações na medicina humana e veterinária: Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos 32. 32. Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa. 33. 33. Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS. 34. 34. Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da LinfadeniteCaseosa e da Leishmaniose. 35. 35. OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.
AÇÃO DO FATOR REUMATÓIDE NO ELISA INDIRETO PARA IgM
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1) O Ag específico é adicionado á placa, e em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do excesso não ligado
2) Adiciona-se a amostra do paciente, que contém o Ac IgM pesquisado e o Fator Reumatóide. O Fator Reumatóide pode estar ligado a Acs IgG específicos para o Ag presente na placa, formando imunocomplexos que se ligam a este Ag
3) Adiciona-se o conjugado anti-IgM
4) Adiciona-se o cromógeno e o substrato, desenvolvendo-se cor. Devido ao Fator Reumatóide unido à IgG específica, tem-se um resultado superestimado da quantidade de IgM pesquisada, podendo levar até a resultados falsos-positivos
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Antígeno
Conjugado anti-IgM
AcIgG
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AcIgMespecí-
fico pesquisado
Cromógeno
Fator Reumatóide
36. 36. ELISA SANDUÍCHE
Y
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Y
1) Um Ac conhecido é adicionado à placa e se liga à sua superfície
2) Lavagens são feitas para retirar os Ac livres
3) Adiciona-se a solução com o Ag a ser pesquisado e este, caso presente, se liga aos Ac nos poços
Y
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Y
Y
4) Realiza-se lavagens para retirar o Ag não capturado
Y
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5) Adiciona-se conjugado específico para o Ag procurado
Y
6) Novas lavagens retiram o conjugado livre
7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
Antígeno
Conjugado
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Anticorpo
Cromógeno
37. 37. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
- Interpretação dos resultados: 38. 38. A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ag da amostra pesquisada. 39. 39. Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste.
Curva Padrão (exemplo)
Absorvância (450/620)
Concentração de IgE
http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
40. 40. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE
- Aplicações na medicina humana e veterinária:
41. 41. Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g. 42. 42. Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro). 43. 43. Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos alimentos).
ELISA POR COMPETIÇÃO
1) Adição do Ac específico aos poços da placa
2) Lavagem para retirar os Ac livres
3) Adição da solução com o Ag a ser pesquisado e de uma outra solução contendo Ag marcado (conjugado) no mesmo poço. Os Ags competem entre si pelo sítio de ligação do Ac e aquele que estiver em maior concentração, se ligará a mais Ac
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4) Lavagem para retirar os Ag não capturados
Y
5) Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac da placa, ocorrerá reação enzimática e o cromógeno será oxidado, havendo desenvolvimento de cor
Antígeno
Conjugado
Y
Anticorpo
Cromógeno
44. 44. ELISA POR COMPETIÇÃO
- Interpretação dos resultados: 45. 45. A intensidade da cor é INVERSAMENTE proporcional à concentração de ag da amostra pesquisada, ou seja, quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida.
ELISA POR COMPETIÇÃO
- Aplicações na Medicina Humana e Veterinária: Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos 46. 46. Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas. Diagnóstico sorológico de algumas doenças. 47. 47. Exemplo na Medicina Humana: dosagem de T3, T4, testosterona, estradiol, progesterona. 48. 48. Exemplo na Medicina Veterinária: detecção sorológica de Herpesvírus Bovino tipo I.
ELISA DE CAPTURA
1) Adição de Ac IgG monoclonal contra IgM aos poços da placa
2) Lavagem para retirar os Ac livres
3) Adição da solução com Ac IgM específico a ser pesquisado
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4) Lavagem para retirar o Ac não capturado
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5) Adiciona-se Ag específico marcado com uma enzima (conjugado) para o Ac pesquisado
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6) Lavagem
7) Adição de cromógeno e de substrato. Se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
Antígeno
Anticorpo IgM
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Anticorpo IgG
Cromógeno
Conjugado
49. 49. ELISA DE CAPTURA
- Interpretação dos resultados 50. 50. Intensidade da cor diretamente proporcional à concentração de Acs. 51. 51. Por ser um ELISA muito utilizado para a detecção de IgM, é capaz de identificar infecções na fase aguda.
ELISA DE CAPTURA
- Aplicações na Medicina Humana e Veterinária 52. 52. Principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários) em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento. Apesar de ser mais utilizado para a detecção de IgM, o ELISA de Captura também pode ser utilizado para a dosagem de outros Acs. 53. 53. Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico de rubéola, toxoplasmose, herpesvírus e citomegalia, em suas fases agudas, da gestante (complexo TORCH). 54. 54. Exemplo na Medicina Veterinária: diagnóstico da Diarréia Bovina Viral (DVB).
REFERÊNCIAS
- http://www.msdbrazil.com/msd43/m_manual/mm_sec22_243.htm 55. 55. http://images.google.com.br/imgres? imgurl=http://www.microvet.arizona.edu/courses/mic419/ToolBox/elisa3.jpg&imgrefurl=http://www.microvet.arizona.edu/courses/mic419/ToolBox/elisa.html&usg=__S6BHPlP0h7OPfk0xg8UxKPQY6o=&h=686&w=682&sz=56&hl=pt-BR&start=1&um=1&tbnid=gr7dJIdxrJF1eM:&tbnh=139&tbnw=138&prev=/images%3Fq%3DElisa%26hl%3DptBR%26sa%3DX%26um%3D1 56. 56. http://www.verus.net/index.php?option=com_content&task=view&id=79&Itemid=1&lang=pt_br 57. 57. http://www.actavetscand.com/content/49/1/7 Amostras a serem testadas 58. 58. http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
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Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.