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II IBEROAMERICAN CONFERENCE ON BENEFICIAL PLANT - MICROORGANISM - ENVIRONMENT INTERACTIONS (IBEMPA) XIV NATIONAL MEETING OF THE SPANISH SOCIETY OF NITROGEN FIXATION (SEFIN) XXVI LATIN AMERICAN MEETING ON RHIZOBIOLOGY (ALAR) III SPANISH-PORTUGUESE CONGRESS ON NITROGEN FIXATION “Microorganisms for future agriculture" Organizers Spanish Society of Nitrogen Fixation (SEFIN) Latin American Society Rhizobiology (ALAR) University of Seville ISBN-10: 84-616-6794-8 ISBN-13: 978-84-616-6794-9 Sponsors AMC Chemical Bruker Catering Sevilla Coitand C. Viral SL Kimitec Laboratorios Biagro Metabolon OpGen ResBioAgro Sistemas genómicos Symborg Thermo Fisher Scientific Welcome address Dear colleagues, On behalf of the Organizing Committee for II IBEMPA Meeting, it is our great pleasure and honour to welcome you to the II Iberoamerican Conference on Beneficial Plant Microorganism Environment Interactions (IBEMPA), XIV National Meeting of the Spanish Society of Nitrogen Fixation (SEFIN), XXVI Latin American Meeting on Rhizobiology (ALAR) and III SpanishPortuguese Con gress on Nitrogen Fixation. This meeting will provide the opportunity to share and discuss latest scientific news on genomic, biochemical, ecological and agronomic aspects of diazotrofic microorganisms or beneficial bacteria and their interaction with plants. We hope you agree that the selected topics and speakers are of great interest and exceptional quality. The meeting program includes six sessions plus the opening and closing keynote conferences. Each session includes keynotes speakers, oral communications and poster presentations. Before the beginning and in parallel to the congress three satellite workshops and a meeting have also been organized: “Omic-technologies Workshop” and “Workshop FABATROPIMED” (1st September), “Inoculant production Workshop” (2nd September) and the meeting on "Microorganisms for Agriculture Future" (4th September). We encourage all delegates to participate actively on all these activities. Besides, several attractive social activities have b een programmed. We would like to thank all institutions and companies that contributed to the organization of this congress, very specially to the University of Sevilla, the Spanish Society of Nitrogen Fixation and the Latin American Society of Rhizobiology. We hope that all delegates will enjoy during their stay in Sevilla and will found an excellent atmosphere to discuss about scientific matters, new collaborations and future directions in the field of the beneficial microorganisms and their association with plants. We also hope that you discover the hospitality of the people of Sevilla and have some free time for visiting this beautiful city. We look forward to welcome you in Seville in September 2013, for what we hope will be an enjoyable meeting both scientifically and socially. Yours sincerely, Manuel Megías President of the Organizing Committee i Committees Honor Committee S.A.R. la Infanta Doña Elena. Presidente del Comité de Honor. Excmo. Sr. D. Miguel Arias Cañete. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medioambiente. Excma. Sra. Dª Carmen Vela Olmo. Ministerio de Economía y Competitividad. Secretaría de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación Excmo. Sr. D. Luis Planas Puchades. Consejería Agricultura, Pesca y Medioambiente. Excmo. Sr. D. Antonio Ávila Cano. Consejería de Economía, Innovación, Ciencia y Empleo. Excmo. Sr. D. Juan Ignacio Zoido Álvarez. Alcaldía de Sevilla. Excmo. Sr. D. Fernando Rodríguez Villalobos. Diputación de Sevilla. Excmo. y Mgco. Sr. D. Antonio Ramírez de Arellano López. Universidad de Sevilla. Excmo. y Mgco. Sr. D. Juan Manuel Suárez Japón. UNIA. Sra. Dª Teresa Millán Valenzuela. Asociación Española de Leguminosas. Ilmo. Sr. D. José Luís García Palacios. Caja Rural del Sur. Ilmo. Sr. D. Antonio Vergel Román. COITAND. Sr. D. Joaquín Moya-Angeler Cabrera. CTA. Ilma. Sra. Dª María Cinta Castillo Jiménez. Doñana21. Sr. D. Francisco Casero Rodríguez. Valor Ecológico. Organizing Committee President: Dr. Manuel Megías. Universidad de Sevilla. España. Vice presidents: Dr. Eulogio Bedmar (President of SEFIN). Estación Experimental del Zaidín. CSIC. España. Dr. Alicia Arias (President of ALAR). Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), Uruguay. Dr. Francisco Merchán. Universidad de Sevilla. España. Dr. María Jesús Delgado. Estación Experimental del Zaidín. CSIC. España. Dr. Dulce Nombre Rodríguez. IFAPA. Las Torres-Tomejil. España. Dr. F. Javier Ollero. Universidad de Sevilla. España. Dr. Teresa Cubo. Universidad de Sevilla. España. Treasurers: Secretary: Web-Master: ii Scientific Committee Dr. José E. Ruíz. Dr. M. Rosario Espuny. Dr. Eduardo Leidi. Dr. Federico Sánchez. Dr. Yaakov Okon. Dr. Esperanza Martínez. Dr. Doris Zúñiga. Dr. Emanuel de Souza. Dr. Marcia Toro. Dr. Eduardo Ortega. Dr. Maribel Parada. Dr. Fabio L. Olivares. Dr. Elena Beyhaut. Dr. Rafael Rivilla. Dr. Isabel V. Castro. Dr. María J. Soto. Dr. Raúl Rivas. Dr. Milagros León. Dr. Nuria Ferrol. Dr. Manuel Becana. Dr. Fernando González. Dr. José Antonio Herrera. Dr. José Antonio Lucas. Dr. Eloisa Pajuelo. Dr. Pedro F. Mateo. Universidad de Sevilla. España. Universidad de Sevilla. España. Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología. CSIC. España. Instituto de Biotecnología. UNAM. Mexico. The Hebrew University. Jerusalem. Israel. Centro de Ciencias Genómicas. UNAM. México. Universidad Nacional Agraria La Molina. Perú. Universidad Federal de Parana. Brasil. Universidad Central de Venezuela. Venezuela. Universidad de la Habana. Cuba. Universidad de la Frontera. Chile. Universidad Estatal del Norte Fluminense. Brasil. INIA. Uruguay. Universidad Autónoma de Madrid. España. Instituto Nacional de Investigaciones Biológicas. Portugal. Estación Experimental del Zaidín. CSIC. España. Universidad de Salamanca. España. Universidad de la Laguna. España. Estación Experimental del Zaidín. CSIC. España. Estación Experimental de Aula Dei. CSIC. España. Universidad de León. España. Universidad de Granada. España. Universidad San Pablo CEU. España. Universidad de Sevilla y IFAPA-Las Torres-Tomejil. España. Universidad de Salamanca. España. Honor Scientific Committee Dr. José Olivares. Dr. Claudino Rodríguez-Barrueco. Dr. M. Rosario de Felipe. Dr. José M. Barea. Dr. Eugenio M. Ferreira. Dr. Roberto Racca. Dr. Alicias Godeas. Dr. Lillian Frioni. Dr. Carlos Labandera. Dr. Fabio Pedrosa. Dr. María Valdés. Dr. Eduardo Schroeder. Dr. Pedro Balatti. Dr. Gabriel Faveluques. Dr. João Ruy Jardim Freire. Dr. Avilio Antonio Franco. España. España. España. España. Portugal. Argentina. Argentina. Uruguay. Uruguay. Brasil. Mexico. Puerto rico. Argentina. Argentina. Brasil. Brasil. iii Local Organizing Committee Dr. Ignacio Rodríguez. Universidad de Sevilla. España. Dr. Pilar Tejero. Universidad de Sevilla. España. Dr. Ramón Bellogín. Universidad de Sevilla. España. Dr. Ana Buendía. Universidad de Sevilla. España. Dr. José María Vinardell. Universidad de Sevilla. España. Dr. Miguel Ángel Rodríguez-Carvajal. Universidad de Sevilla. España. Dr. Francisco Javier López-Baena. Universidad de Sevilla. España. Dr. Miguel Ángel Caviedes. Universidad de Sevilla. España. Dr. María Camacho. IFAPA-Las Torres-Tomejil. España. Dr. Carolina Sousa. Universidad de Sevilla. España. Dr. M. Carmen Márquez. Universidad de Sevilla. España. Omic-Tecnologies Workshop Organizing Committee Dr. Antonio M. Gil. Universidad de Sevilla. España. Dr. Francisco Martínez. Estación Experimental del Zaidín. CSIC. España. Dr. O. Mario Aguilar. Universidad Nacional de La Plata. Argentina. Inoculant Production Workshop Organizing Committee Dr. Francisco Temprano. IFAPA-Las Torres-Tomejil. España. Dr. Enrique Moretti. Laboratorios Biagro. Argentina. Dr. Mohammed Dary. ResBioAgro, SL. España. Dr. Antonio Lagares. BIOFAG. Universidad Nacional de La Plata. Argentina. Dr. Mariangela Hungria. EMBRAPA. Brasil. Dr. Juan Sanjuán. Estación Experimental del Zaidín. CSIC. España. iv General information Venue The meeting will be held in the Lecture Theatre of the Facultades de Ciencias del Trabajo y Derecho of the University of Seville (http://www.derecho.us.es) and Hotel NH Central Convenciones (http://www.nh-hoteles.es/nh/es/hoteles/espana/sevilla/nh-centralconvenciones.html) Language Spanish and Portuguese are the official languages of the congress. English is the scientific language. Registration and information desk The registration will be held on 2 September from 11:00 to 18:00 h. and during the meeting period at the desk located on the convention hall of the hotel. Information about the congress, social activities, etc. can also be obtained at the registration desk during the meeting. The official travel agency of the congress, CAC Travel ([email protected]), will be available at the registration desk for accommodation, touristic and travel information, etc. Lunch and coffee-breaks The lunch on 3, 5 and 6 September will be held at the hotel restaurant. These lunchs and coffee-breaks are included on the registration fee for meeting participants and accompanying persons. Oral presentations The keynote speakers have 20 minutes for their presentations plus 5 minutes for questions (25 minutes total), while the offered oral communications will be presented during 15 minutes plus 5 minutes for questions (20 minutes total). We encourage speakers to prepare their presentations according to the time assigned. Session Chairs have been asked to ensure that speakers restrict themselves to the allowed time; they have been advised to adhere most strictly to this policy. The meeting rooms are prepared with a PC (Powerpoint 2010) and projector. Macintosh is not available. Please note that we are unable to allow the use of personal laptops. Please bring your presentation in a memory stick (using the USB port in the computer) and load it on the meeting computer. Congress staff will be prepared to assist you. All presentations must be loaded preferably on Monday 2 September. Poster sessions Poster boards are located at Salón Marbella and Salón Málaga on the convention area of the hotel. Posters will be on display throughout Tuesday morning (3 September) up to late Thursday evening (5 September) with snacks and drinks. The dimensions of the poster are: 130 cm (height) by 90 cm (width). The organization will provide the materials necessary for mounting the posters on the boards. First authors of posters from Sessions I, V y VI should be present beside their own panel during the Poster Session on Tuesday 3 September (from 20:30 v to 22:00 h). First authors of posters from Sessions II, III and IV should be present beside their own panel during the Poster Session on Thursday 5 September (from 20:30 to 22:00 h). Poster discussion sessions will take place at the Salones Almenara, Almería and Alanda on the convention area of the hotel from 18:00 to 19:30 h, on Tuesday 3 September (Poster Sessions I, V y VI) and Thursday 5 September (Poster Sessions II, III and IV). Social events The social program includes: Musical performance at 19:40 h, on Monday 2 September following the opening ceremony and opening conference at the Lecture Theatre of the Facultades de Ciencias del Trabajo y Derecho of the University of Seville. Get Together at 21:30 h, on Monday 2 September at the Patios of the Facultades de Ciencias del Trabajo y Derecho of the University of Seville. Visit to the Guadalquivir marshes, on Wednesday 4 September. Buses will departure from Hotel NH Central Convenciones at 10:00 h (front door). It will include a visit to the rice fields of Seville (from 11:00 to 13:00 h) and tasting of typical products of the Guadalquivir marshes (from 13:00 to 15:30 h). Visit to the University of Seville (front door, c/ San Fernando), on Wednesday 4 September at 19:00 h. Tapas Tour, on Wednesday 4 September at 20:30 h. Closing dinner, on Friday 6 September at 22:00 h. at the “Hípica Pedro Macías” a riding centre served by Catering Sevilla in the arena of a bullring. (http://www.hipicapedromacias.es). It is not included with the registration. Its estimated price will be 45€. Buses will departure from Hotel NH Central Convenciones at 21:30 h. Accompanying persons The registration as accompanying participants includes Get together, lunches and coffee breaks, snakcs and drinks during poster sessions, Cultural visits and visit to the rice fields of the Guadalquivir marshes of Seville. Badge policy Delegates are requested to exhibit the congress badges all the time during the scientific and social events. Internet connection Wireless internet service will be available in the congress venue. vi Liability and insurance The organizers are not able to take responsibility whatsoever for injury or damage involving persons and property during the congress. Mobile phones Participants are requested to keep their mobile phones switched off in the session rooms. Time Sevilla time is the Central European time zone (Greenwich Mean Time + 2:00), i.e. one hour more than in Lisbon or London. Climate and clothing Sevilla enjoys a typically Mediterranean climate throughout the year. September in Sevilla is not as hot as August but is still extremely warm. The average daily temperature may reaches 32 °C (about 90 °F) at noon and 18 °C (64 °F) at night. The average daily sunshine is 9 hours a day with average rainfall being just 24 mm over 2 days. This means that the chance of rain is extremely unlikely, and you can still bring light clothing. Environment Hotel NH Central Convenciones includes this congress on its ECO-Meeting programme, which includes efficient use of water and energy, environmentally friendly materials, low fair-trade coffee and voluntary commitment of CO2 emissions. Travel agency The official travel agency is CAC Travel, Calle Virgen de la Victoria 12, 41011 Sevilla, Spain; phone: +34 955 099 142; email: [email protected] The address of the organization is: Department of Microbiology, Faculty of Biology, University of Sevilla, Avenida de la Reina Mercedes s/n, 41012-Sevilla, Spain; phone: +34 954 557 117; fax: +34 954 557 830; e-mail: [email protected], http://congreso.us.es/ibempa vii Meeting program MONDAY, 2 SEPTEMBER 11:00 - 18:00 Registration (Hotel NH Central Convenciones) LECTURE THEATRE OF THE FACULTADES DE CIENCIAS DEL TRABAJO Y DERECHO, UNIVERSITY OF SEVILLE Opening Session. Introduced by Antonio Gil-Serrano (Universidad de Sevilla, Sevilla, España). 18:15 - 18:20 18:20 - 19:15 Welcome address. Keynote Conference: Quorum sensing: a double-edge sword in bacterial-plant interactions. Miguel Cámara. Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham. Nottingham. Reino Unido. The speaker will be introduced by Ildefonso Bonilla Mangas (Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, España). 19:20 - 19:40 19:40 - 20:15 20:15 - 21:30 21:30 - 23:00 Presentation of the Congress picture “Uniendo pueblos”. Musical Performance. Opening Ceremony. Get together Patios of Facultades de Ciencias del Trabajo y Derecho, University of Seville. TUESDAY, 3 SEPTEMBRE LECTURE THEATRE OF THE FACULTADES DE CIENCIAS DEL TRABAJO Y DERECHO. UNIVERSITY OF SEVILLE. Session I Ecology, diversity and evolution of microorganisms beneficial to plants. Chairpersons: Dr. Fábio B. Reis Jr (EMBRAPA Cerrados, Brasil). Dr. María Luisa Izaguirre (IVIC, Venezuela). 09:00 - 09:25 SI-P-1 Diversidad y evolución de las comunidades microbianas en la rizosfera tras un incendio forestal. Fernández-López, M. Estación Experimental del Zaidín, CSIC. Granada. España. 09:25 - 09:55 SI-P-2 Species and symbiovars within Mesorhizobium: diversity and host range. Laranjo, M. Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterránicas, Universidade de Évora, Évora, Portugal. 10:00 - 11:30 Oral Communications SI-CO-1 Diversidad de hongos micorrizógenos arbusculares bajo situaciones contrastantes de fertilización fosfatada. * García, S., Rodríguez Blanco, A. , Pezzani, F. Facultad de Agronomía. Universidad de la República. Av. Garzón 780. Montevideo. Uruguay. viii SI-CO-2 Prospecting metal resistant plant-growth promoting rhizobacteria for rhizoremediation of metal contaminated estuaries using Spartina densiflora. Andrades-Moreno, L., del Castillo, I., Redondo-Gómez, S., Mesa, J., Caviedes M.A., Pajuelo, E., Rodríguez-Llorente, I.D.* Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla. España SI-CO-3 Symbiovar loti-type genes are widely spread across different chromosomal backgrounds, corresponding to up to nine Mesorhizobium genospecies nodulating Cicer canariense. * Pérez-Yépez, J. , Armas-Capote, N., Martínez-Hidalgo, P., Velázquez, E., PérezGaldona, R., Martíne z-Molina, E., León-Barrios, M. Departamento de Microbiología y Biología Celular. Universidad de La Laguna. Tenerife. España. SI-CO-4 Molecular phylogeny and phenotypic characterization of salt tolerant Sinorhizobia nodulating Phaseolus filiformis in Northern Mexico. Rocha, G., Medina, A., Carreño, R., Bustillos, R., Contreras, J.L., Villegas, M.C., Chaintreuil, C., Dreyfus, B., Le Queré, A., Munive, J.A. * Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Mexico. 11:30 - 12:00 General discussion. Coffee break. Session II Genetics and genomics of beneficial microorganisms and associated plants. Chairpersons: Dr. Fabricio Cassan (Univ. Nacional de Río Cuarto, Argentina). Dr. Marta Martín (Univ. Autónoma de Madrid, España). 12:00 - 12:25 SII-P-1 Genomics of host specificity in the Rhizobium-legume symbiosis. Imperial, J. ETS de Ingenieros Agrónomos y Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Universidad Politécnica de Madrid, Madrid, España. 12:30 - 12:55 SII-P-2 Genomic insights into the rhizosphere lifestyle of rhizobia. Ormeño-Orrillo, E. Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos, México. 13:00 - 14:30 Oral Communications SII-CO-1 First analyses of the genomic sequence of the soybean symbiont Sinorhizobium fredii HH103. * Vinardell, J.M. , Göttfert, M., Becker, A., Acosta-Jurado, S., Baena, I., Blom, J., Bonilla, I., Buendía, A.M., Crespo-Rivas, J.C., Goesmann, A., Jaenicke, S., Krol, E., Lloret, J., McIntosh, M., Margaret, I., Pérez-Montaño, F., Schneiker-Bekel, S., Serranía, J., Szczepanowski, R., Zehner, S., Pühler, A., Ruiz-Sainz, J.E., Weidner, S. Departamento de Microbiología, Universidad de Sevilla, España. SII-CO-2 Identificación y caracterización del regulador maestro del flagelo lateral de Bradyrhizobium japonicum USDA 110. * Mongiardini, E.J., Quelas, J.I., Lodeiro, A.R. IBBM-Facultad de Ciencias Exactas, UNLP-CONICET, La Plata, Argentina. ix SII-CO-3 Pyrosequencing reveals the presence of diverse bacterial genera which have not previously described to soil and rhizosphere. Lagos, L. *, Jorquera, M., Maruyama, F., Mora, M.L. Scientific and Technological Bioresource Nucleus, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. SII-CO-4 Temporal profile of nif gene expression in Azotobacter vinelandii: effect of nifA mutation. Navarro-Rodríguez, M.*, Poza-Carrión, C., Jiménez-Vicente, E., Rubio, L.M. Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid. Madrid. España 14:45 - 16:30 General discussion. Lunch at Hotel NH Central Convenciones. HOTEL NH CENTRAL CONVENCIONES 17:00 - 18:00 Meeting of the Latin American Society of Rhizobiology. 18:00 - 19:30 Poster Discussion Sessions I, V and VI. Chairpersons: Dr. Milagros León (Univ. de la Laguna, España). Dr. Maribel Parada (Univ. de la Frontera, Chile). 19:30 - 20:30 Corner business innovation I. Chairpersons: Dr. Alvaro Peix (IRNASA, CSIC, España). Dr. Khalid Alki (AMC Chemical, S.L., España). Participants: Sistemas Genómicos, España. Bruker, España. Corporación Tecnológica de Andalucía, España. 20:30 - 22:00 Posters Session I, V and VI (with snacks and drinks). WEDNESDAY, 4 SEPTEMBER 09:00 - 13:00 13:00 - 15:30 19:00 - 20:30 20:30 Visit to the rice fields of Seville. Tasting of typical products of the Guadalquivir marshes. Visit to the University of Seville. Tapas Tour THURSDAY, 5 SEPTEMBER LECTURE THEATRE OF THE FACULTADES DE CIENCIAS DEL TRABAJO Y DERECHO. UNIVERSITY OF SEVILLE Session III Symbiotic plant/microbe Interactions. Chairpersons: Dr. Carmen Quinto (Instituto de Biotecnología, UNAM, México). Dr. Maria do Carmo Catanho Pereira de Lyra (Instituto Agronômico de PernambucoIP, Brasil). x 09:00 - 09:25 SIII-P-1 Priming plant defences by beneficial soil microorganisms. Pozo-Jiménez, M.J. Estación Experimental del Zaidín, CSIC. Granada. España. 09:30 - 09:55 SIII-P-2 Una visión general del papel de los polisacáridos superficiales de Sinorhizobium fredii en su simbiosis con la soja y otras leguminosas. Ruiz Sainz. J.E. Departamento de Microbiología. Facultad de Biología. Universidad de Sevilla. España 10:00 - 11:30 Oral Communications SIII-CO-1 Boron deficiency affects rhizobia cell surface polysaccharides. Quijada, N.M., Cerda, M.E., Abreu, I.*, Pérez de Nanclares, M., Bonilla, I., Bolaños, L. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid. Madrid. SIII-CO-2 Threalose is a key carbon regulatory player in the Legume-Rhizobium symbiosis. Sánchez, F.*, Barraza, A., Estrada-Navarrete, G.,Quinto, C., Merino, E. Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México.. SIII-CO-3 RbohB-dependent reactive oxygen species regulates rhizobial infection, bacteroid development and nitrogen fixation in common bean. Arthikala, M.K., Montiel, J., Nava, N., Santana, O., Sánchez-López, R., Cárdenas, L., Quinto, C.* Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México. SIII-CO-4 Quorum Sensing systems and flavonoids via NodD1 coordinate and regulate the biofilm transition in Sinorhizobium fredii SMH12, which is necessary for a successful root colonization of Glycine max cv Osumi. Pérez-Montaño, F.*, Jiménez-Guerrero, I., Del Cerro, P., López-Baena, F.J., Ollero, F.J., Bellogín, R.A., Lloret, J., Espuny, M.R. Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. España 11:30 - 12:00 General discussion. Coffee break. Session IV Associative interaction plant/ beneficial microbe. Chairpersons: Dr. José Miguel Barea (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Spain). Dr. Verónica Reis (EMBRAPA-Agrobiología, Brasil). 12:00 - 12:25 SIV-P-1 Aplicaciones biotecnológicas de la interacción planta-microorganismos: salud, medioambiente y agricultura. Gutiérrez-Mañero, F.J. Facultad de Farmacia. Universidad San Pablo CEU. Madrid. España. xi 12:25 - 12:55 SIV-P-2 Aspectos bioquímicos y moleculares de la interacción Delftia-Rizobio-Alfalfa: un lenguaje de señales químicas. Castro-Sowinski, S. Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. 13:00 - 14:30 Oral Communications SIV-CO-1 Evaluation of Micromonospora as a potential biocontrol agent. * Martínez-Hidalgo, P. , Martínez-Molina, E., Pozo, M.J. Departamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca, España. GIR "Interacciones mutualistas planta-microorganismo", Unidad Asociada al IRNASA. CSIC, Salamanca. España. SIV-CO-2 Movimiento y quimiotáxis en Pseudomonas fluorescens F113, influencia en una colonización competente de la rizosfera de las plantas. Baena, I., Muriel, C., Martín, I., Jalvo, B., Hernanz, A., González de Heredia, E., Barahona, E., Navazo, A., Redondo-Nieto, M., Martínez-Granero, F., Lloret, J., Rivilla, R., Martín, M.* Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. SIV-CO-3 Caracterización de la interacción Delftia-Sinorhizobium en alfalfa. Morel, M.A.*, Cagide, C., Dardanelli, M.S., Castro-Sowinski, S. Unidad de Microbiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), Av. Italia 3318, Montevideo, Uruguay. SIV-CO-4 Estrés salino, calidad nutricional y comportamiento postcosecha, en lechuga inoculada con Azospirillum. Fasciglione, G.*, Casanovas, M., Yommi, A., Quillehauqui, V., Roura, S., Barassi, C.A. Unidad Integrada: Facultad de Cs. Agrs. (UNMdP) -EEA Balcarce (INTA). Ruta 226 Km 73,5 CC 276 (7620) Balcarce, Argentina. General discussion. Lunch at Hotel NH Central Convenciones. HOTEL NH CENTRAL CONVENCIONES 17:00 - 18:00 Meeting of the Spanish Society of Nitrogen Fixation 18:00 - 19:30 Poster Discussion Sessions II, III and IV. 14:45 - 16:30 Chairpersons: Dr. Fernando González (Univ. de León, España). Dr. José Antonio Lucas (Univ. CEU San Pablo, España). 19:30 - 20:30 Corner business innovation II. Chairpersons: Dr. Jesús González (Univ. de Granada, España). Dr. Mohamed Dary (ResBioAgro, S.L., España). Participants: Total Biotecnología, Brasil. ResBioAgro, España. ACM Chemical, España. Simborg, España. 20:30 - 22:00 22:00 Posters Session II, III and IV (with snacks and drinks). Removal of posters. xii FRIDAY, 6 SEPTEMBER LECTURE THEATRE OF THE FACULTADES DE CIENCIAS DEL TRABAJO Y DERECHO. UNIVERSITY OF SEVILLE Session V Physiology and biochemistry of beneficial microorganisms and associated plants Chairpersons: Dr. Manuel Sánchez (Univ. de Navarra, Spain). Dr. Carmen Lluch (Univ. de Granada, Spain). 09:00 - 09:25 SV-P-1 Fijación de nitrógeno en leguminosas en entornos variables: el bacteroide, el nódulo y la planta. César Arrese Igor. Universidad Pública de Navarra. Pamplona, España. 09:30 - 09:55 SV-P-2 Molecular physiology of nickel and cobalt homeostasis in Rhizobium leguminosarum. José Manuel Palacios Alberti Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Universidad Politécnica de Madrid, Pozuelo de Alarcón, Madrid, España 10:00 - 11:30 Oral Communications SV-CO-1 Engineering a hydrogen biosensor in the nitrogen-fixing strain Rhodobacter capsulatus. Gónzalez de Heredia, E.M.*, Barahona, E., Jiménez-Vicente, E., Echavarri-Erasun, C., Rubio, L.M. Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid, Campus de Montegancedo, Pozuelo de Alarcón 28223, Madrid. SV-CO-2 MtNramp1 mediates iron import in rhizobia-infected Medicago truncatula cells. Rodríguez-Haas, B., Finney, L., Kryvoruchko, I., González-Melendi, P., Udvardi, M., Imperial, J., González-Guerrero, M.* Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP) Universidad Politécnica de Madrid. Campus de Montegancedo, Pozuelo de Alarcón, Madrid, España. SV-CO-3 Selección de líneas de garbanzo tolerantes a la salinidad empleando caracteres de producción de biomasa y funcionamiento nodular como indicadores. Gómez, L.A.*, Vadez, V., Vaillhe, H., Pernot, C., Drevon, J.J. Instituto de Suelos. Autopista, Costa-Costa y Antigua Carretera de Vento, Capdevila, Boyeros. La Habana, Cuba. SV-CO-4 Estrés abitotico induce cambios en las señales de comunicación y en la interacción temprana entre maní y rizobacterias. Cesari, A., Paulucci, N., García, M., Dardanelli, M.S. * Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina. General discussion. 11:30 - 12:00 Coffee break. xiii Session VI Inoculants in agriculture and the environment. Chairpersons: Dr. Antonio M. de Ron (Misión Biológica de Galicia, MBG-CSIC). Dr. Yeda Mendes (EMBRAPA-Cerrados, Brasilia, Brasil). 12:00 - 12:25 SVI-P-1 Efficient soil microbial consorcia: a new dimension for sustainable agriculture and environmental sustainability. Cruz, C. Universidade de Lisboa, Lisboa. Portugal. 12:30 - 12:55 SVI-P-2 Oportunidades e ameaças à contribuição da fixação biológica do nitrogênio em leguminosas no Brasil. Nogueira, M.A. Embrapa Soja, Londrina, Paraná, Brazil. 12:00 - 14:30 Oral Communications SVI-CO-1 Selenium biofortification in wheat plants by co-inoculation of selenobacteria strains and arbuscular mycorhizal fungy for obtaining enriched selenium foods. Durán, P.*, Mora, M.M. Center of Plant, Soil Interaction and Natural Resources Biotechnology, Scientific and Biotechnological Bioresource Nucleus. Universidad de la Frontera, Temuco-Chile. SVI-CO-2 Evaluación de la degradación de tamo de arroz por microorganismos lignocelulolíticos. Gutiérrez-Rojas, I.*, Pedraza-Zapata, C., Sánchez-Rodríguez, L., Moreno-Sarmiento, N. Instituto de Biotecnología, Ciudad Universitaria, Edificio Manuel Ancizar, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biotecnología Aplicada, Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI), Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia. SVI-CO-3 Soil microbial phosphorus, phosphorus availability and crop yield of upland ricecommon bean interc ropping under organic and mineral fertilizer inputs on ferrallitic soil of Malagasy highlands. Henintsoa, M.*, Andriamananjara, A., Razakatiana, A.T.E., Larvy Delarivière, J., Rabeharisoa, L., Becquer, T. Laboratoire des Radioisotopes (LRI), University of Antananarivo, Madagascar. Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME), Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE), Antananarivo, Madagascar. Institut de Recherche pour le Développement (IRD), UMR Eco&Sols, c/o LRI, Madagascar. SVI-CO-4 Sistema uruguayo de fiscalización de inoculantes: complementación interinstitucional y aplicación de tecnologías de la información. Beyhaut, E*, Barlocco, C., Altier, N., Mayans, M. INIA Las Brujas, Ruta 48 Km 10, Canelones, Uruguay. 2 División Control de Insumos, DGSSAA. M.G.A.P, Av. Millán. Montevideo, Uruguay. 14:45 - 16:30 General discussion. Lunch at Hotel NH Central Convenciones. xiv LECTURE THEATRE OF THE FACULTADES DE CIENCIAS DEL TRABAJO Y DERECHO. UNIVERSITY OF SEVILLE Closing Session 18:30 - 19:30 Award “Antonio J. Palomares” Conference. Simplicity turned out complicated: How FixK2, a key regulator of genes for symbiosis, is exquisitely controlled by different means. Mesa, S. Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Granada, Spain. The speaker will be introduced by Eulogio Bedmar (SEFIN President). 19:30 - 19:40 “Bernardo Leicach - BIAGRO” awards ceremony. 19:40 - 20:40 Closing Conference. Uma década de ouro se aproxima para a microbiologia do solo: expectativas da pesquisa, da indústria, dos agricultores e da sociedade. Mariangela Hungría. Embrapa Soja, Londrina, Paraná, Brazil The speaker will be introduced by Tomás Ruíz Argüeso (Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid, España). 20:40 21:30 Closing ceremony Buses departure for closing dinner (Hotel NH Central Convenciones) 22:00 Closing dinner. “Hípica Pedro Macías” xv Floor plan xvi Contents Opening Session Quorum sensing: a double-edge sword in bacterial-plant interactions. Miguel Cámara. 2 Centre for Biomolecular Sciences, University of Nottingham. Nottingham NG7 2RD. Reino Unido). Session I. Ecology, diversity and evolution of microorganisms beneficial to plants. SI-P-1 Diversidad y evolución de las comunidades microbianas en la rizosfera tras un incendio forestal. Fernández-López, M. 7 Estación Experimental del Zaidín, CSIC. Granada. España. SI-P-2 Species and symbiovars within Mesorhizobium: diversity and host range. Laranjo, M. 11 Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterránicas, Universidade de Évora, Évora, Portugal. SI-CO-1 Diversidad de hongos micorrizógenos arbusculares bajo situaciones contrastantes de fertilización fosfatada. García, S., Rodríguez Blanco, A.*, Pezzani, F. 15 Facultad de Agronomía. Universidad de la República. Av. Garzón 780. Montevideo. Uruguay. SI-CO-2 Prospecting metal resistant plant-growth promoting rhizobacteria for rhizoremediation of metal contaminated estuaries using Spartina densiflora. Andrades-Moreno, L., del Castillo, I., Redondo-Gómez, S., Mesa, J., Caviedes M.A., Pajuelo, E., Rodríguez-Llorente, I.D.* 17 Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, c/ Profesor García González 2, 41012 Sevilla, Spain. SI-CO-3 Symbiovar loti-type genes are widely spread across different chromosomal backgrounds, corresponding to up to nine Mesorhizobium genospecies nodulating Cicer canariense. Pérez-Yépez, J., Armas-Capote, N., Martínez-Hidalgo, P., Velázquez, E., PérezGaldona, R., Martínez -Molina, E., León-Barrios, M.* 19 Departamento de Microbiología y Biología Celular. Universidad de La Laguna. Tenerife. España. SI-CO-4 Molecular phylogeny and phenotypic characterization of salt tolerant Sinorhizobia nodulating Phaseolus filiformis in Northern Mexico. Rocha, G., Medina, A., Carreño, R., Bustillos, R., Contreras, J.L., Villegas, M.C., Chaintreuil, C., Dreyfus, B., Le Queré, A., Munive, J.A. * 21 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Mexico. SI-CP-01 Phylogenetic diversity of bradyrhizobia nodulating cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) in Extremadura (Spain). Bejarano, A.*, Ramírez-Bahena, M.H., Velázquez, E., Peix, A. 23 SI-CP-02 MALDI-TOFF MS, a tool for diversity analysis and detection of novel rhizobial species nodulating Phaseolus vulgaris. * Flores-Félix, J.D. , García-Fraile, P., Sánchez-Juanes, F., Ramírez-Bahena, M.H., Ferreira, L., Mulas, D., Rivas, R., González-Andrés, F., Peix, A., González-Buitrago, J.M., Velázquez, E. 25 xvii SI-CP-03 Análisis de la biodiversidad de microorganismos en nódulos de Lotus corniculatus. Marcos-García, M., Menéndez, E., Celador-Lera, L., Rivera, L.P., Martínez-Molina, E., Mateos, P.F., Velázquez, E., Rivas, R.* 27 SI-CP-04 Where do PGPR interact with plants? An essential determination to develop effective agricultural inputs based on microorganisms. Mulas, R., Mulas, D.*, Menéndez, E., Rivera, L., Mateos, P., González-Andrés, F. 29 SI-CP-05 Biodiversity of endophytic bacteria and mycorrhizal fungi in roots of pepper(Capsicum annuum L.) in León province (Spain). * Barquero, M., Velázquez, E., Terrón, A. , González-Andrés, F. 31 SI-CP-06 Diversidad de los rizobios que nodulan Medicago marina de regiones del Odiel y San Fernando. Alías-Villegas, C.*, Bellogín, R.A., Camacho, M., Cubo, M.T., Temprano, F., Espuny, M.R. 33 SI-CP-07 Tolerancia a pH y salinidad extremos y propiedades simbióticas de aislamientos de rhizobia de Medicago marina L. Alías-Villegas, C., Espuny, M.R., Bellogín, R.A., Cubo, M.T., Camacho, M., Temprano, * F. 35 SI-CP-08 Estudio de la Biodiversidad microbiana en suelos de las Marismas del Odiel y de las Minas de Rio Tinto. Ruíz-Carnicer, A., Alías-Villegas, C., Bellogín, R.A., Manyani, H., Temprano, F., Espuny, M.R., Camacho, M.* 37 SI-CP-09 Componentes biológicos en el suelo de dos plantaciones similares de ciruelo en producción ecológica y convencional. Daza, A.*, Pérez-Romero, L.F., Arroyo, F.T., García-Galavís, P.A., Camacho, M., Santamaría, C. 39 SI-CP-10 Relative abundance of denitrification genes and diversity of bacterial denitrifiers in sediments with different nitrate concentration. Correa-Galeote, D., Tortosa, G., Bedmar, E.J. * 41 SI-CP-11 Experimental and modelling approach to the legume-Rhizobium interaction: test of plant-host sanctions in co-inoculated plants with fixing and non-fixing strains. Marco, D.E.*, Talbi, C., Bedmar, E.J. 43 SI-CP-12 Identification of rhizobial strains nodulating cultivated grain legumes in Egypt. Zahran, H.H.*, Chahboune, R., Bedmar, E.J., Abdel-Fattah, M., Yasser, M.M., Mahmoud, A.M. 45 SI-CP-13 Genetic diversity and biogeography of rhizobial genospecies nodulating wild chickpea Cicer canariense on La Palma (Canary Is.). Armas-Capote, N., Pérez-Yépez, J., Martínez-Hidalgo, P., Garzón-Machado, V., del Arco-Aguilar, M., Velázquez, E., León-Barrios, M.* 47 SI-CP-14 Identificación de dos bacterias diazótrofas asociadas a una Brassicaceae (Lepidium meyeni Walp.) de suelos altoandinos del Perú. * Chumpitaz, C. , Ogata, K., Santos, R. Zúñiga, D. 49 SI-CP-15 Análisis de la presencia natural de micorrizas en cultivos de algodón inoculados con Bacillus sp. y/o Bradyrhizobium sp. Valencia, C.*, Toro, M., Zúñiga, D. 51 SI-CP-16 Poblaciones microbianas con potencial PGPR en la rizósfera de cultivos de papas nativas amargas del altiplano peruano. Ramos, E.*, Santos, R., Velezmoro, C., Zúñiga, D. 53 xviii SI-CP-17 Capacidad PGPR de cepas de Bacillus y Pseudomonas aisladas de la rizosfera de aguaymanto (Physalis peruviana L.). Cumpa, A.*, Flores, L., Chumpitaz, C., Ogata, K., Zúñiga, D. 55 SI-CP-18 Phenotypic and molecular characterization of Lotus parviflorus nodule bacteria. * Soares, R., Lorite, M.J., Videira e Castro, I., Sanjuán, J. 57 SI-CP-19 Contribution of root nodule bacteria for the sustainability of “montado” (cork oak) ecosystem. Fernández, C., Soares, R., Barrento, M.J., Machado, H., Gomes, A.A., Videira e * Castro, I. 59 SI-CP-20 Estudio del carácter endófito de bacterias del género Pantoea aisladas de los cultivos de arroz de la Marisma del Guadalquivir. Megías, E., Benitez, C., Diaz-Olivares, I., Ollero, F.J., Megías, M. * 61 SI-CP-21 El género Pantoea en los cultivos de arroz de la Marisma del Guadalquivir: diversidad y posible descripción de una nueva especie. Megías, E.*, Fernández, M., Reis Junior, F.B., Márquez, M.C., Ollero, F.J., Megías, M. 63 SI-CP-22 Bacterial biodiversity within the genus Enterobacter in paddies of Guadalquivir marshes. * Fernández, M. , Megías, E., Reis Junior, F.B., Megías, M. 65 SI-CP-23 Isolation and characterization of a novel bacterium isolated from paddies of Guadalquivir marshes. Márquez, M.C.*, Fernández, M., Megías, E., Merchán, F. 67 SI-CP-24 Biodiversidad y performance simbiótica de bacterias noduladoras de soja alóctonas de suelos de Argentina. Covelli, J.M.*, López, M.F., Arrese-Igor, C., Lodeiro, A.R. 69 SI-CP-25 Búsqueda y caracterización de bacterias promotoras del crecimiento vegetal en rizosfera de plantas nativas antárticas. Fernández Garello, P., Braga, L., Senatore, D., Lagurara, P., Yanes, M.L., Vaz, P., Azziz, G., Bajsa, N.* 71 SI-CP-26 Caracterización de las comunidades de hongos micorrícico-arbusculares asociadas a metalofitas en suelos contaminados con Cu. Cornejo, P.*, García, S., Vidal, C., Meier, S., Borie, F. 73 SI-CP-27 Screening for phosphate solubilising rhizobia from faba bean in Marrakech region field cultures. Maghraoui, T.*, Domergue, O., Oufdou, K., Lahrouni, M., Galiana, A., Sanguin, H., Drevon, J.J., de Lajudie, P. 75 SI-CP-28 Estudio de la dinámica poblacional binaria de rizobacterias en Lupinus mediante citometría de flujo. Ruiz Palomino, M., Probanza, A.* 77 SI-CP-29 Utilização da técnica de MLSA em estudos taxonômicos e filogenéticos com Bradyrhizobium e sua importância na descrição de novas espécies. * Delamuta, J.R.M. , Ribeiro, R.A., Hungria, M. 79 SI-CP-30 Mycorrhizal fungal identity as determinant of functional assemblage of plantgrowth promoting bacte ria in the rhizosphere. Meleiro, A.I.*, Carvalho, L., Correia, P., Melo, J., Carolino, M., Cruz, C. 81 SI-CP-31 Diversity and stress tolerance in rhizobia from Parque Chaqueño region of Argentina nodulating Prosopis alba. Chávez Díaz, L., González, P., Rubio, E., Melchiorre, M. * 83 xix SI-CP-32 Condiciones de estrés hídrico o salino modifican la composición y capacidad formadora de biofilm de comunidades bacterianas aisladas de rizósfera de alfalfa. Bogino, P., Abod, A., Nievas, F., Santoro, V., Vicario, J. *, Giordano, W. 85 SI-CP-33 Supervivencia y capacidad formadora de biofilms por rizobacterias. * Abod, A. , Bogino, P., Vicario, J., Giordano, W. 87 SI-CP-34 Caracterización morfológica de rizobios asociados a cultivos de arveja (Pisum sativum L.), chocho (Lupinus mutabilis S.), fréjol (Phaseolus vulgaris L.), haba (Vicia faba L.) y vicia (Vicia atropurpurea) en suelos del Ecuador. * Carpio, M.J., Paucar, B.M. , Alvarado, S.P. 89 SI-CP-35 Bacterias con actividad ACC desaminasa en huertos de aguacate en Michoacán, México. Chávez-Bárcenas, A.T.*, Hernández-Valdés, E.F., Bárcenas-Ortega, A.E., LozunaLópez, F., García-Sau cedo, P.A., Olalde-Portugal, V. 91 SI-CP-36 Caracterização genotípica de bactérias diazotróficas isoladas de plantas de Brachiaria brizantha e B. humidicula no estado de Roraima, Amazônia, Brasil. * Chalita, P.B., Cunha, E.N., Zilli, J.E., Silva, K. 93 Session II. Genetics and genomics of beneficial microorganisms and associated plants. SII-P-1 Genomics of host specificity in the Rhizobium-legume symbiosis. Imperial, J. 96 ETS de Ingenieros Agrónomos y Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Universidad Politécnica de Madrid, Madrid, España. SII-P-2 Genomic insights into the rhizosphere lifestyle of rhizobia. Ormeño-Orrillo, E. 100 Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos, México. SII-CO-1 First analyses of the genomic sequence of the soybean symbiont Sinorhizobium fredii HH103. Vinardell, J.M.*, Göttfert, M., Becker, A., Acosta-Jurado, S., Baena, I., Blom, J., Bonilla, I., Buendía, A.M., Crespo-Rivas, J.C., Goesmann, A., Jaenicke, S., Krol, E., Lloret, J., McIntosh, M., Margaret, I., Pérez-Montaño, F., Schneiker-Bekel, S., Serranía, J., Szczepanowski, R., Zehner, S., Pühler, A., Ruiz-Sainz, J.E., Weidner, S. 103 Departamento de Microbiología, Universidad de Sevilla, Spain. SII-CO-2 Identificación y caracterización del regulador maestro del flagelo lateral de Bradyrhizobium japonicum USDA 110. Mongiardini, E.J.*, Quelas, J.I., Lodeiro, A.R. 105 IBBM-Facultad de Ciencias Exactas, UNLP-CONICET, La Plata, Argentina. SII-CO-3 Pyrosequencing reveals the presence of diverse bacterial genera which have not previously described to soil and rhizosphere. Lagos, L. *, Jorquera, M., Maruyama, F., Mora, M.L. 107 Scientific and Technological Bioresource Nucleus, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. SII-CO-4 Temporal profile of nif gene expression in Azotobacter vinelandii: effect of nifA mutation. * Navarro-Rodríguez, M. , Poza-Carrión, C., Jiménez-Vicente, E., Rubio, L.M. Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid, Campus de Montegancedo, Pozuelo de Alarcón 28223, Madrid. xx 109 SII-CP-01 Singularidades adaptativas del genoma de Pseudomonas fluorescens F113. Comparación con otras cepas del género Pseudomonas. Redondo-Nieto, M.*, Martínez-Granero, F., Muriel, C., Martín, M., Rivilla, R. 111 SII-CP-02 AmrZ es un regulador transcripcional global en Pseudomonas fluorescens F113. * Martínez-Granero, F., Redondo-Nieto, M., Vesga, P., Martín, M., Rivilla, R. 113 SII-CP-03 The rkp-2 region of Sinorhizobium fredii HH103 is involved in LPS and EPS production. Acosta-Jurado, S.*, Crespo-Rivas, J.C., Murdoch, P.S., Rodríguez-Carvajal, M.A., RuizSainz, J.E., Vinardell, J.M. 115 SII-CP-04 Study of the quorum sensing Sin system of Sinorhizobium fredii HH103. * Crespo-Rivas, J.C. , Pérez-Montaño, F., Acosta-Jurado, S., Payán-Bravo, L., McIntosh, M., Meyer, S., Becker, A., Ruiz-Sainz, J.E., Vinardell, J.M. 117 SII-CP-05 Lotus japonicus Gifu and L. burttii responses to inoculation with a collection of S. fredii HH103 mutants affected in symbiotic signals. Rodríguez-Navarro, D.N., Jin, H., Kawaharada, Y., Sandal, N., Andersen, S.U., Stougaard, J., Ruiz-Sainz, J.E.* 119 SII-CP-06 Analyses of the Sinorhizobium fredii HH103 and USDA257 secretomes in the presence and absence of the flavonoid genistein. Yao, W., Thomas, J.R., Jiménez-Guerrero, I., López-Baena, F.J.*, Ruiz-Sainz, J.E., Vinardell, J.M. 121 SII-CP-07 Ocorrência e caracterização de bactérias isoladas de nódulos de amendoinzeiro (Arachis hypogaea L.) em solos paranaenses, Brasil. * Andrade, D.S. , Cardoso, J.D., Pertinhez, G.N., Saturno, D.F., Lovato, G.M., Nomura, R.B.G., Hungria, M. 123 SII-CP-08 The Type 3 secretion system effector NopP from Ensifer (=Sinorhizobium) fredii HH103 is phosphorylated by a soybean kinase. Calero, B.*, Jiménez-Guerrero, I., Pérez-Montaño, F., Monreal, J.A., Ollero, F.J., López-Baena, F.J. 125 SII-CP-09 A yeast-based array to study the function of Ensifer (=Sinorhizobium) fredii HH103 Type 3 secretion system effectors in symbiosis. Ollero, F.J.*, Jiménez-Guerrero, I., Pérez-Montaño, F., Mesa, B., Medina, C., LópezBaena, F.J. 127 SII-CP-10 Implicación del gen bgvA en la formación de biofilm por Rhizobium tropici CIAT899. Del Cerro, P.*, Ollero, F.J., Megías, M., Bellogín, R.A., Guasch-Vidal, B., PérezMontaño, F., Espu ny, M.R. 129 SII-CP-11 Identification and characterization and of a soybean kinase that phosphorylates the Type 3 secretion system effector NopL from Ensifer (=Sinorhizobium) fredii HH103. * Jiménez-Guerrero, I. , Pérez-Montaño, F., Ollero, F.J., Monreal, J.A., Cubo, M.T., López-Baena, F.J. 131 SII-CP-12 Control de movilidad y producción de EPS I en Sinorhizobium meliloti: nuevas funciones asignadas al sistema NtrY/X. Calatrava*, N., Nogales, J., Ameztoy, K., van Steenbergen, B., Soto, M.J. 133 SII-CP-13 Auxotrophy accounts for nodulation impairment in a Sinorhizobium meliloti mutant defective for meso-diaminopimelate biosynthesis. García-Rodríguez, F.M., Ortigosa, A., Millán, V., Toro, N., Martínez-Abarca, F.* 135 xxi SII-CP-14 Genomic analysis of Azospirillum brasilense Az39 the most extensively used strain for inoculant production in Argentina. Cassán, F.*, Rivera Bottia, D., Molina, R., Revale, S., Vazquez, M., Spaepen, S., Vanderleyden, J., Perticari, A. 137 SII-CP-15 Two-dimensional proteomic reference map of Bradyrhizobium diazoefficiens strain CPAC 7 (=SEMIA 5080). Gomes, D.F.*, Batista, J.S.S., Hungria, M. 139 SII-CP-16 Emprego da metodologia de MLSA em avaliações de filogenia e taxonomia de rizóbios: estudo com Rhizobium spp. microssimbiontes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). * Ribeiro, R.A. , Delamuta, J.R.M., Hungria, M. 141 SII-CP-17 Relative expression of hypothetical protein-related genes for Bradyrhizobium diazoefficiens CPAC 7. Gomes, D.F., Rolla-Santos, A.A.P.*, Batista, J.S.S., Hungria, M. 143 SII-CP-18 PoolSeq analysis of the selection of the Rhizobium genotypes by the legume host plant. * Jorrín, B. , Imperial, J. 145 SII-CP-19 Incorporación estable y expresión del gen de la diguanilato ciclasa PleD* en el genoma de bacterias que interaccionan con plantas. Romero-Jiménez, L.*, Rodríguez, D., Prada-Ramírez, H., Gallegos, M.T., Sanjuán, J., Pérez-Mendoza, D. 147 SII-CP-20 Identification of the gene responsible for a non-nodulating phenotype in chickpea. Ali, L., Madrid, E., Sánchez, R., Temprano, F., , Gil, J., Rubio, J., Millan, T.* 149 SII-CP-21 Functional characterization of Ensifer meliloti denitrification genes. Torres, M.J.*, Rubia, M.I., Coba de la Peña, T., Pueyo, J.J., Bedmar, E.J., Delgado, M.J. 151 SII-CP-22 Genome sequence of Herbaspirillum rubrisubalbicans M1, an endophytic diazotroph and mild phytopathogen of sugarcane. Souza, E. M.*, Chubatsu, L., Cardoso, R.A., Raittz, R.T., Weiss, V.A., Monteiro, R.A., Faoro, H., Wassem, R., Baura, V.A., Balsanelli, E., Huergo, L., Muller-Santos, M., Tadra-Sfeir, M., Cruz, L.M., Pedrosa, F.O. 153 SII-CP-23 Sinorhizobium meliloti differentially expressed non-coding RNAs modulating nitrogen fixaion and cell cycle progression. Robledo, M.*, Frage, B., Schlüter, J.P., Becker, A. 155 Session III. Symbiotic plant/microbe Interactions. SIII-P-1 Priming plant defences by beneficial soil microorganisms. Pozo-Jiménez, M.J. 158 Estación Experimental del Zaidín, CSIC. Granada. España. SIII-P-2 Una visión general del papel de los polisacáridos superficiales de Sinorhizobium fredii en su simbiosis con la soja y otras leguminosas. Ruiz Sainz. J.E. 162 Departamento de Microbiología. Facultad de Biología. Universidad de Sevilla. SIII-CO-1 Boron deficiency affects rhizobia cell surface polysaccharides. Quijada, N.M., Cerda, M.E., Abreu, I.*, Pérez de Nanclares, M., Bonilla, I., Bolaños, L. Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid. Madrid. xxii 166 SIII-CO-2 Thehalose is a key carbon regulatory player in the Legume-Rhizobium symbiosis Sánchez, F.*, Barraza, A., Estrada-Navarrete, G., Quinto, C., Merino, E. 168 Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México. Av. Universidad # 2001, Col. Chamilpa. C.P.: 62210, Cuernavaca, Morelos, México. SIII-CO-3 RbohB-dependent reactive oxygen species regulates rhizobial infection, bacteroid development and nitrogen fixation in common bean. Arthikala, M.K., Montiel, J., Nava, N., Santana, O., Sánchez-López, R., Cárdenas, L., Quinto, C.* 170 Departamento de Biología Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, UNAM, Apartado Postal 510-3, Cuernavaca, Morelos 62271, México. SIII-CO-4 Quorum Sensing systems and flavonoids via NodD1 coordinate and regulate the biofilm transition in Sinorhizobium fredii SMH12, which is necessary for a successful root colonization of Glycine max cv Osumi. * Pérez-Montaño, F. , Jiménez-Guerrero, I., Del Cerro, P., López-Baena, F.J., Ollero, F.J., Bellogín, R.A., Lloret, J., Espuny, M.R. 172 Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. Avda. Reina Mercedes, 6. 41012 - Sevilla, Spain. SIII-CP-01 Proteolytic control of the Bradyrhizobium japonicum transcriptional regulator FixK2. Fernández, N.*, Bonnet, M., Stegmann, M., Maglica, Z., Weber-Ban, E., Hennecke, H., Bedmar, E.J., Mesa, S. 174 SIII-CP-02 Effect of temperature on ectomycorrhizal fungi associated with Pinus sylvestris L. in organic vs mineral soils. Gómez-Gallego, T., García-Rabasa, S., Flores-Rentería, D., Rincón, A.* 176 SIII-CP-03 Ensifer meliloti is the preferred symbiont of Medicago arborea in eastern Morocco soils. Missbah El Idrissi, M., Guerrouj, K., Pérez-Valera, E., Abdelmoumen, H.*, Bedmar, E.J. 178 SIII-CP-04 Interaction between Arbuscular Mycorrhizal Fungi and rhizobia on the growth of subclover under Mn toxicity: The role of Extraradical Mycelium. Alho, L.*, Carvalho, M., Goss, M.J., Brito, I. 180 SIII-CP-05 Autochthonous drought-tolerant arbuscular mycorrhizal fungi and bacteria can increase nutrients acquisition and alleviate drought stress in lavandula plants. Armada, E., Roldán, A., Azcón, R.* 182 SIII-CP-06 Análisis filogenético de la diversidad de hongos formadores de micorrizas arbusculares presentes en los distintos tipos de propágulos asociados a especies de plantas características del Parque Natural Sierra de Baza (Granada, España). Varela-Cervero, S., López-García, A., Berrio, E., Barea, J. M., Azcón-Aguilar, C.* 184 SIII-CP-07 Influencia de la composición de la cubierta vegetal sobre los hongos micorrícicoarbusculares y la estabilización de un suelo degradado en un ecosistema mediterráneo. Cornejo, P., Ferrol, N., Barea, J.M.*, Azcón-Aguilar, C. 186 SIII-CP-08 Salt tolerance evaluation in Casuarina glauca: impact on the photosynthetic apparatus. Batista-Santos, P.*, Graça I., Semedo J., Lidon, F., Alves, P., Scotti, P., Pais, I., Ribeiro, A.I., Ramalho, J.C. 188 xxiii SIII-CP-09 Rhizosphere symbiots valorisation: Common bean-rhizobia symbiosis adaptation to P deficiency in Ain Temouchent agro-ecosystem in Algeria.7 Benadis, Ch.*, Bekki, A., Lazali, M., Drevon, J.J. 190 SIII-CP-10 The genotypic variability of beans affects the growth parameters, the nodulation and the microorganisms which initiate nodulation. Benadis, Ch., Bekki, A.*, Abed, N.H., Ouzane, H., Irekti, H. 192 SIII-CP-11 Phosphoenol pyruvate phosphatase transcript in nodule cortex of Phaseolus vulgaris. * Bargaz, A. , Drevon, J.J., Lazali, M., Ghoulam, C. 194 SIII-CP-12 P-deficiency increases phytase activity and O2 uptake per N2 reduced in Phaseolus vulgaris L. Lazali, M.*, Abadi, J., Ounane, S.M., Bargaz, A., Pernot, C., Drevon, J.J. 196 SIII-CP-13 Effect of inoculation with selected rhizobia on symbiotic nitrogen fixation and Faba bean grains yield in north Tunisia agro-ecosystems. Sifi, B.*, Maazaoui, H., Drevon, J.J. 198 SIII-CP-14 Integrating soil microbial community context in plant response to mycorrhizal symbionts. * Carvalho, L. , Correia, P., Meleiro, A.I., Carolino, M., Dionisio, F., Cruz, C. 200 SIII-CP-15 Identificación y caracterización de sistemas de transporte de hierro en el hongo micorrícico arbuscular Rhizophagus irregularis. Tamayo, E., Ferrol, N.* 202 SIII-CP-16 Structure of the exopolysaccharide isolated from Sinorhizobium fredii HH103. Rodríguez-Carvajal, M.A.*, Acosta-Jurado, S., Rodríguez-Navarro, D.N., Crespo-Rivas, J.C., Margaret, I., Sanjuán, J., Soto, M.J., Vinardell, J.M., Ruiz-Sainz, J.E., Gil-Serrano, A. 204 SIII-CP-17 First evidence for interlinked control of surface motility and biofilm formation in Sinorhizobium meliloti. Amaya-Gómez, C.V., Hirsch, A.H., Soto, M.J.* 206 SIII-CP-18 Symbiotic phenotype of different rhizobial species on Lotus japonicus Gifu and Lotus burttii. Rodríguez-Navarro, D.N.*, Temprano, F., Velázquez, E., Ruiz-Sainz, J.E. 208 SIII-CP-19 Los efectores secretados a través del T3SS suprimen la respuesta de defensa en soja inducida por Ensifer (=Sinorhizobium) fredii HH103. Cubo, M.T.*, Jiménez-Guerrero, I., Pérez-Montaño, F., Ollero, F.J., López-Baena, F.J. 210 SIII-CP-20 Pode Bradyrhizobium japonicum, em combinação com diferentes densidades de plantio de soja alterar componentes do rendimento? * de Luca, M.J. , Nogueira, M.A., Hungria, M. 212 SIII-CP-21 Effects of glyphosate-resistant gene and herbicides on biological nitrogen fixation symbiotic efficiency and grain productivity of soybean in Brazil. * Hungria, M., Mendes, I.C., Nakatami, A.S., Reis-Junior, F.B., Fernandes, M.F. 214 SIII-CP-22 Diversidade genética de bactérias que colonizam nódulos radiculares de Phaseolus vulgaris L. cultivado em campo e em casa de vegetação. * Oliveira-Francesquini, J.P. , Hungria, M., Glienke, C., Kava-Cordeiro, V., GalliTerasawa, L. 216 SIII-CP-23 Symbionts of Mimosa spp. in ultramafic soils in central Brazil. Reis Junior, F.B.*, James, E.K., Hertel Júnior, C.R., Lopes, A.A.C., Alves, M.R.P., Souza, L.M., Baura, V.A., Mendes, I.C., Andrade, L.R.M. 218 xxiv SIII-CP-24 Cloning, Expression and Characterization of a Chitinase class III from Casuarina glauca nodules. Graça, I.*, Liang, J., Guilherme, M., Ferreira-Pinto, M., Ribeiro, A., Pereira A.S, 220 SIII-CP-25 Negative short-term salt effects on the soybean-B. japonicum interaction and partial reversion by calcium addition. Muñoz, N., Rodríguez, M., Robert, G., Lascano, R. * 222 SIII-CP-26 Expresión de supresores de muerte celular en raíces en cabellera de soja: efectos bajo condiciones de estrés y en la interacción con Bradyrhizobium japonicum. * Robert, G. , Muñoz, N., Lascano, R. 224 SIII-CP-27 Efecto del contenido de taninos condensados (TC) sobre la formación de nódulos en especies del género Lotus. Escaray, F.J.*, Estrella, J., Paolocci, F., Damiani, F., Ruiz, O.A. 226 SIII-CP-28 Alteraciones en el proceso de nodulación en ausencia y presencia de fuente de nitrógeno externa de un mutante deficiente en el transporte de nitrato de la leguminosa Lotus japonicus. García-Calderón, M.*, Pal’ove-Balang, P., Pérez, C.M., Betti, M., Marquez, A.J. 228 SIII-CP-29 Phylogenetic diversity and structure of sebacinoid fungi associated with plant communities along an altitudinal gradient. Garnica, S.*, Riess, K., Bauer, R., Oberwinkler, F. 230 SIII-CP-30 Grain yield of cowpea in Ghana responds to Rhizobium inoculation. Atakora, W.K., Guimarães, A.P.*, Fosu, M., Boddey, R.M., Xavier, G.R. 232 SIII-CP-31 Pseudomonas fluorescens enhances photosynthesis and improves bioactive profiles and antioxidant potential in blackberry (Rubus sp. Var. Lochness) in field conditions. García-Seco, D., Bonilla, A., Algar, E., García-Villaraco, A., Gutiérrez Mañero, F.J.*, Ramos Solano, B. 234 SIII-CP-32 Improving opium poppy yield through MAMPs from selected beneficial bacterial strains in field trials. Bonilla, A., Garcia-Seco, D., Muñoz Ledesma, F.J., Lucas, J.A.*, Ramos Solano, B., Gutiérrez Mañero, F.J. 236 SIII-CP-33 Rhizobial cellulase CelC2 and its Ensifer homolog play an important role in plant and nodule development. Menéndez, E.*, Robledo, M., Velázquez, E., Martínez-Molina, E., Rivas, R., Mateos, P.F. 238 SIII-CP-34 Ocorrência de fungos micorrízicos arbusculares na cultura da palma no semiárido de Pernambuco. Mergulhão, A.C.E.S.*, Silva, M.L.R.B., Figueroa, C.S., Lyra, M.C.C.P. 240 SIII-CP-35 Bactérias diazotróficas associadas a cladódios de palma: solubilização de fosfato inorgânico e tolerância à salinidade. Silva, M.L.R.B.*, Figueroa, C.S., Mergulhão, A.C.E.S., Lyra, M.C.C.P. 242 SIII-CP-36 Genotypic characterization of natural rhizobial populations isolated from pea and lentil in two eco-climatic subhumid and semi-arid zones in Algeria. Riah, N.*, Djekoun, A., Heulin, K., Laguerre, G. 244 SIII-CP-37 Native bradyrhizobia isolated from Lupinus mariae-josephae possess an essential T3SS for symbiosis. Durán, D., Pastor, V., Zehner, S., Göttfert, M., Imperial, J., Rey, L., Ruiz-Argüeso, T.* 246 xxv SIII-CP-38 Which phosphatases may contribute to P use efficiency for N2 fixation in the rhizobial symbiosis with legumes? Drevon, J.J.*, Amenc, L. , Pernot, C., Abadie, J., Blair, M., Lazali, M., Bargaz, A., Ghoulam, C., Ounane, S.M., Zaman-Allah, M. 248 SIII-CP-39 nod gene inducers released by Mimosa flocculosa seeds and its effects on common bean growth and yield under Brazilian cerrado soil conditions. Mercante, F.M.*, Otsubo, A.A., Cunha, C.O. 250 SIII-CP-40 Diversidade de fungos micorrízicos arbusculares e colonização do solo em sistema de cultivo consorciado cafeeiro (Coffea arábica L.) e seringueira (Hevea brasiliensis). Colozzi-Filho, A.*, Bugatti, E.P., Garbossi, A., Scaramal, A., Machineski, O., Carrenho, R. 252 SIII-CP-41 Effect of mycorrhizal inoculation on wheat and barley genotypes differing in Altolerance growing a t phytotoxic Al level. Meier, S., Curaqueo, G., Seguel, A., Aguilera, P., Cornejo, P., Borie, F.* 254 SIII-CP-42 Origin of arbuscular mycorrhizal fungi determines plant development and resource distribution between Phaseolus vulgaris L. and Oriza sativa in intercropping. Ramanankierana, H.*, Rasamiarivelo, A.V., Razafimbelo, T., Becker, T., Razakatiana, A.T.E., Manitriniaina, H., Rabeharisoa, L., Randriambanona, H., Drevon, J.J., Duponnois, R. 256 SIII-CP-43 Asociación Española de Leguminosas. De Ron, A.M., De la Cuadra, C., Millán, T* 258 Session IV. Associative interaction plant/beneficial microbe. SIV-P-1 Aplicaciones biotecnológicas de la interacción planta-microorganismos: salud, medioambiente y agricultura. Gutiérrez-Mañero, F.J. 261 Facultad de Farmacia. Universidad San Pablo CEU. Madrid. España. SIV-P-2 Aspectos bioquímicos y moleculares de la interacción Delftia-Rizobio-Alfalfa: un lenguaje de señales químicas. Castro-Sowinski, S. 265 Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. SIV-CO-1 Evaluation of Micromonospora as a potential biocontrol agent. Martínez-Hidalgo, P.* , Martínez-Molina, E., Pozo, M.J. 269 Departamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca, España. GIR "Interacciones mutualistas planta-microorganismo", Unidad Asociada al IRNASA. CSIC, Salamanca. España. SIV-CO-2 Movimiento y quimiotáxis en Pseudomonas fluorescens F113, influencia en una colonización competente de la rizosfera de las plantas. Baena, I., Muriel, C., Martín, I., Jalvo, B., Hernanz, A., González de Heredia, E., Barahona, E., Navazo, A., Redondo-Nieto, M., Martínez-Granero, F., Lloret, J., Rivilla, * R., Martín, M. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Autónoma de Madrid. xxvi 271 SIV-CO-3 Caracterización de la interacción Delftia-Sinorhizobium en alfalfa. Morel, M.A.*, Cagide, C., Dardanelli, M.S., Castro-Sowinski, S. 273 Unidad de Microbiología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), Av. Italia 3318, Montevideo, Uruguay. SIV-CO-4 Estrés salino, calidad nutricional y comportamiento postcosecha, en lechuga inoculada con Azospirillum. Fasciglione, G.*, Casanovas, M., Yommi, A., Quillehauqui, V., Roura, S., Barassi, C.A. 275 Unidad Integrada: Facultad de Cs. Agrs. (UNMdP) -EEA Balcarce (INTA). Ruta 226 Km 73,5 CC 276 (7620) Balcarce, Argentina. SIV-CP-01 Bioprospecção de Bactérias Isoladas de Milho para Promoção de Crescimento de Plantas. Ikeda, A.C.*, Szilagy-Zecchin, V.J., Hungria, M., Kava-Cordeiro, V., Glienke, C., GalliTerasawa, L .V. 277 SIV-CP-02 Caracterización de una metilobacteria aislada de la superficie del grano de arroz. Gallego Parrilla, J.J., Alías-Villegas, C., Díaz-Olivares, I.M., Gutiérrez Alcántara, R., Madinabeitia-Peiró, N., Bellogín, R.A.*, Espuny, M.R. 279 SIV-CP-03 Resistencia a metales pesados de bacterias aisladas de leguminosas de las Marismas del Odiel y del entorno del Río Tinto. Lara-Dampier, V., Acera-Mateos, P., Alías-Villegas, C., Gómez-Cárdenas, A.J., Temprano, F., Camacho, M., Bellogín, R.A., Espuny, M.R.* 281 SIV-CP-04 Comparación de las características microbiológicas del suelo en huertos de aguacate bajo manejos orgánico y convencional. Bárcenas-Ortega, A.E.*, Chávez-Bárcenas, A.T., García-Saucedo, P.A., OlaldePortugal, V., Tulais-Al varado, C.A., Zavala-Gómez, A. 283 SIV-CP-05 Efecto de la inoculación foliar y radicular de bacterias PGPR en el cultivo de Aguaymanto (Physalis peruviana). Flores, L., Ogata, K.*, Zúñiga, D. 285 SIV-CP-06 Bacillus sp. y hongos micorrícicos para el control biológico del nemátodo Meloidogyne incognita en el cultivo de Aguaymanto (Physalis peruviana). Isla, F.*, Carbonell, E., Ogata, K., Zúñiga, D. 287 SIV-CP-07 Identificación de dos bacterias diazótrofas asociadas a una Brassicaceae (Lepidium meyeni Walp.) de suelos altoandinos del Perú. * Chumpitaz, C., Ogata, K., Santos, R., Zúñiga, D. 289 SIV-CP-08 Selección de cultivos rizobianos aislados de nódulos de leguminosas de diferentes regiones del Perú con capacidad de promover el crecimiento de lechuga, páprika y tomate. Soriano-Bernilla, B.*, Prado-Chávarry, G., Zavaleta-Verde, D., Valdez-Nuñez, R. 291 SIV-CP-09 Promoção de crescimento de tomate (Solanum lycopersicum L.) estimulado por Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Szilagyi-Zecchin, V.J.*, Ruaro, L., Mógor, A.F. 293 SIV-CP-10 Efecto de volátiles emitidos por la bacteria bCT34 en la promoción de crecimiento de Arabidopsis thaliana. Parada, M.*, Quiroz, A., Parra, L., Mendoza, D., Fincheira, P. 295 SIV-CP-11 Functionality of phosphate solubilizing bacteria isolated from the rhizosphere of papaya plants under conventional and organic farming systems. * Melo, J. , Azevedo-Junior, R.R. , Eutropio, F.J., Correira, P., Carvalho, L. , Meleiro, A.I., Teixeira, M.S., Carolino, M. , Ramos, A.C., Cruz, C. 297 xxvii SIV-CP-12 Plant-growth promoting Sphingomonas sp. associated with annual ryegrass. Dourado, A.C., Castanheira, N., Cortés Pallero, A., Delgado Rodriguéz, A.I., Alves, P.I.L., Barreto Crespo, M.T., Fareleira, P.* 299 SIV-CP-13 Paenibacillus species isolated from Pisum sativum nodules in Lanzarote present several in vitro plant growth promotion mechanisms. Ramírez-Bahena, M.H., Flores-Félix, J.D., Tejedor, C., León-Barrios, M., Peix, A.*, Velázquez, E. 301 SIV-CP-14 Efecto de rizobacterias en el enraizamiento de miniestacas en dos clones híbridos de Eucalyptus spp. González-Candia, P.*, Sossa, K., Rodríguez, F., Sanfuentes, E. 303 SIV-CP-15 Azoarcus sp. CIB, un nuevo endófito del arroz que degrada anaeróbicamente hidrocarburos aromáticos. Fernández, H., Prandoni, N., Fernández-Pascual, M., Morcillo, C., Fajardo, S., Díaz, E., Carmona, M.* 305 SIV-CP-16 Impacts of rice-bean intercropping on soil microbial activity and the development of rice plants. * Razakatiana, A.T.E. , Henintsoa, M., Becquer, T., Ramanankierana, H., Baohanta, H.R., Raherimandimby, M., Rabeharisoa, L., Duponnois, R. 307 SIV-CP-17 Efeito de bactérias PRPG com indução de ácido salicílico em plântulas de duas cultivares de palma forrageira (Opuntia e Nopalea). Lyra, M.C.C.P.*, Pérez-Montaño, F., Jiménez-Guerrero, I., Madinabeitia, N., DiazOlivares, I.M., Gu tiérrez-Alcántara, R., Ollero, F.J. 309 SIV-CP-18 Análisis cualitativo y cuantitativo de vitamina C en fresas, en presencia de microorganismos endófitos. Aranda-Alonso, C.*, Rodríguez-Carvajal, M.A., Ollero, F.J., Megías, M., Gil-Serrano, A. 311 SIV-CP-19 Occurrence of rhizobacteria with PGPR activities in different ecosystems and agroecosystems of nor thern, central and southern Chile. Barra, P., Jorquera, M., Acuña, J.*, Lagos, L., Marileo, L., Inostroza, N., Mora, M.L. 313 SIV-CP-20 Efecto de plaguicidas sobre la actividad biológica de la cubierta vegetal (L. perenne) de un sistema de biopurificación denominado lecho biológico. Diez, M.C.*, Gallardo, F. 315 Session V. Phisiology and biochemistry of beneficial microorganisms and associated plants. SV-P-1 Fijación de nitrógeno en leguminosas en entornos variables: el bacteroide, el nódulo y la planta. César Arrese Igor. 318 Universidad Pública de Navarra. Pamplona, España. SV-P-2 Molecular physiology of nickel and cobalt homeostasis in Rhizobium leguminosarum. José Manuel Palacios Alberti Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Universidad Politécnica de Madrid, Pozuelo de Alarcón, Madrid, España xxviii 319 SV-CO-1 Engineering a hydrogen biosensor in the nitrogen-fixing strain Rhodobacter capsulatus. Gónzalez de Heredia, E.M.*, Barahona, E., Jiménez-Vicente, E., Echavarri-Erasun, C., Rubio, L.M. 323 Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas, Universidad Politécnica de Madrid, Campus de Montegancedo, Pozuelo de Alarcón 28223, Madrid. SV-CO-2 MtNramp1 mediates iron import in rhizobia-infected Medicago truncatula cells. Rodríguez-Haas, B., Finney, L., Kryvoruchko, I., González-Melendi, P., Udvardi, M., * Imperial, J., González-Guerrero, M. 325 Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP) Universidad Politécnica de Madrid. Campus de Montegancedo, Pozuelo de Alarcón, 28223 Madrid, España. SV-CO-3 Selección de líneas de garbanzo tolerantes a la salinidad empleando caracteres de producción de biomasa y funcionamiento nodular como indicadores. Gómez, L.A.*, Vadez, V., Vaillhe, H., Pernot, C., Drevon, J.J. 327 Instituto de Suelos. Autopista, Costa-Costa y Antigua Carretera de Vento, Capdevila, Boyeros. La Habana, Cuba. SV-CO-4 Estrés abitotico induce cambios en las señales de comunicación y en la interacción temprana entre maní y rizobacterias. Cesari, A., Paulucci, N., García, M., Dardanelli, M.S. * 329 Departamento de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Exactas, Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina. SV-CP-01 Movilidad en cepas de rizobios nodulantes de maní. Vicario, J.*, Dardanelli, M.S., Giordano, W.F. 331 SV-CP-02 Effects of phosphorus and nitrogen level fertility on growth parameters of Faba bean inoculated with rhizobia. Maazaoui, H.*, Sifi, B., Drevon, J.J. 333 SV-CP-03 Phytate mineralising bacteria increase in the rhizosphere of nodulated common bean (Phaseolus vulgaris) under P deficiency. Maougal, R.T.*, Brauman, A., Plassard, C., Abadi, J., Djekoun, A., Drevon, J.J. 335 SV-CP-04 Is the contrast between nodulated recombinant imbred lines of common bean (Phaseolus vulgaris L.) linked with available phosphorus in soil ? A multi-local field test in Mediterranean conditions. Alkama, N.*, Jaillard, B. , Ounane, S.M., Ounane, G., Drevon, J.J. 337 SV-CP-05 Phosphoenol pyruvate phosphatase transcript in nodule cortex of Phaseolus vulgaris. * Bargaz, A. , Lazali, M., Ghoulam, C., Drevon, J.J. 339 SV-CP-06 Phytate-mineralizing rhizobia from Vicia faba symbiosis in an agro-ecosystem of south of France. * Domergue, O. , Chouayekh, H., Abadie, J., Amenc, L., Pernot, C., de Lajudie, P., Galiana, A., Drevon, J.J. 341 SV-CP-07 Daily simulation of plant and microbial transfers of carbon between the soil and the atmosphere under wheat-faba bean intercropping. * Ibrahim, H. , Hatira, A., Blavet, D., Drevon, J.J., Pansu, M. 343 SV-CP-08 Effect of phosphorus deficiency on some agrophysiological and biochemical parameters in faba bean (Vicia faba)-rhizobia symbiosis. Makoudi, B., Mouradi, M., Kabbadj, A., Farissi, M., Drevon, J.J., Ghoulam, C.* 345 SV-CP-09 Acúmulo de açúcares e fixação biológica de nitrogênio em genótipos de soja sob restrição hídrica. * Cerezini, P., Pípolo, A.E., Hungria, M., Nogueira, M.A. 347 xxix SV-CP-10 Mannose Rich N-Glycoproteins synthesized during the development of the Rhizobium-pea symbiosis are potential boron ligands. Abreu, I., Valiente, R., Poza, L., Quijada, N.M., Reguera, M., Bonilla, I., Bolaños, L. * 349 SV-CP-11 Regulation of cellulose-like polysaccharide synthesis in Sinorhizobium meliloti. * Baena, I., Valiente, E., Bonilla, I., Martín, M., Rivilla, R., Lloret, J. 351 SV-CP-12 Functional roles of HypC and HupK in the biosynthesis of [NiFe] hydrogenase in Rhizobium leguminosarum. Albareda, M.*, Manyani, H., Rey, L., Brito, B., Ruiz-Argüeso, L., Imperial, J., F. Pacios, L., Palacios, J.M. 353 SV-CP-13 Quorum Sensing is essential for an effective symbiosis in R. leguminosarum UPM791. Sánchez-Cañizares, C., Ruiz-Argüeso, T., Imperial, J., Palacios, J.M. * 355 SV-CP-14 DmeRF system is required for nickel and cobalt resistance in Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Rubio-Sanz, L.*, Prieto, R.I., Palacios, J.M., Brito, B. 357 SV-CP-15 Efectos de la variación de la transpiración sobre la fijación biológica de nitrógeno y el transporte de metabolitos a larga distancia en guisante. * Aldasoro Galán, J. , Arrese-Igor, C. 359 SV-CP-16 Importancia de la relación fuente/sumidero en la inhibición de la fijación de nitrógeno. García y García, K.*, Arrese-Igor, C. 361 SV-CP-17 Implicación de la trehalosa-6-fosfato en la respuesta a sequía de nódulos de judía. * Hidalgo-García, A. , Argandoña, M., González, E.M., Arrese-Igor, C., Vargas, C., Delgado, M.J. 363 SV-CP-18 Study of sulphur assimilation and sulphur sources used by Rhizobium leguminosarum strain 3841 in free-living and symbiotic conditions. Muñoz-Azcárate, O.*, Karunakaran, R., Arrese-Igor, C., Poole, P.S. 365 SV-CP-19 Towards the optimization of hydrogen production by nitrogenase: In vitro directed evolution of Rhodobacter capsulatus molybdenum nitrogenase. Barahona, E.*, González de Heredia, E.M., Rubio, L.M. 367 SV-CP-20 The FdxN protein is required for the biosynthesis and activity of the NifDK nitrogenase components in Azotobacter vinelandii. Jiménez-Vicente, E.*, Poza-Carrión, C., Navarro-Rodríguez, M., Rubio, L.M. 369 SV-CP-21 Two-Hybrid System in the nitrogen-fixing bacterium Azotobacter vinelandii. Moreno-Urbano, E.*, López-Torrejón, G., Rubio, L.M. 371 SV-CP-22 Boron deficiency in Anabaena PCC7120: potential boron ligands. * Bonilla, I. , Abreu, I., Bolaños, L. 373 SV-CP-23 Metabolismo antioxidante inducido por imazamox en distintos órganos de judía en simbiosis con Rhizobium tropici. * García-Garijo, A., López, M., Palma, F., Tejera, N.A., Lluch, C. 375 SV-CP-24 Implicación de las poliaminas en la respuesta a la salinidad de nódulos de Phaseolus vulgaris. * Cobos, L., López-Gómez, M. , Hidalgo, J., Iribarne, C., Lluch, C. 377 SV-CP-25 Pantoea eucalypti M91 favorece la adquisición de hierro y mejora la performance de Lotus japonicus, ecotipo Gifu, bajo condiciones de estrés alcalino. Campestre, M.P., Castagno, L.N., Estrella, M.J., Ruiz, O.A. * 379 xxx SV-CP-26 Caracterización de aldehído oxidasas en la simbiosis Medicago truncatula-Ensifer meliloti en condiciones de estrés por cadmio. Coba de la Peña, T.*, Pallol, B., Pérez, E., Pueyo, J.J., Lucas, M.M. 381 SV-CP-27 Response of the symbiotic system Medicago truncatula-Ensifer meliloti to cadmium stress: Ionome and ion transporters. Fedorova, E., Coba de la Peña, T., Pueyo, J.J., Lucas, M.M. * 383 SV-CP-28 Nonsymbiotic and truncated hemoglobins of legumes: biochemical characterization and subcellular localization. * Sainz, M., Pérez-Rontomé, C., Ramos, J., Mulet, J.M., James, E.K., Becana, M. 385 SV-CP-29 Producción y actividad nodular de dos variedades de alfalfa (Europa y Aragón) en condiciones de CO2 elevado. Kizildeniz, T., Erice, G., Sanz-Sáez, A., Aguirreolea, J., Sánchez-Díaz, M., Irigoyen, J.J.* 387 SV-CP-30 Análisis de la diversidad de polihidroxialcanoato-sintasas (PhaC) en Bradyrhizobium japonicum USDA 110. Quelas, J.I.*, Pérez-Giménez, J., Mongiardini, J., Carriño, J., Parisi, G., Lodeiro, A.R. 389 SV-CP-31 La mutación de ntrB en Bradyrhizobium japonicum afecta su crecimiento aeróbico en nitrato pero no en amonio. * López, M.F. , Lamelza, F., Lodeiro, A.R., López García, S.L 391 SV-CP-32 Application of calcium, phosphorus and antioxidants do not promote tolerance to high solar irradiance in Rhizobium-nodulated Phaseolus vulgaris L. Izaguirre-Mayoral, M.L.*, Silvera, J., Rodríguez, M. 393 SV-CP-33 Localization and dynamics of the succinoglycan translocon in Sinorhizobium meliloti cells. Rivero, M.R., Medeot, D.B., Contreras-Moreira, B., Liaudat, J.P., Ferrari, W., Rossi, F., Fischer, S.E., Becker, A., Jofré, E.* 395 SV-CP-34 Implication of NRT2.5 and NRT2.6 genes in growth promotion response of Arabidopsis by Phyllobacterium brassicacearum STM196. Kechid, M.*, Desbrosses, G., Varoquaux, F., Djekoun, A., Touraine, B. 397 SV-CP-35 Micorrizas arbusculares: estado actual del conocimiento y perspectivas en pastizales de Uruguay. Pezzani, F.* 399 SV-CP-36 The potential of NIR and MIR spectroscopy to predict the P retention capacity of Malagasy and Brasilan uplands soils. Ramaroson, H.V.*, Marchão, R.L., Vendrame, P.R.S., Razafimahatratra, H., Fanjaniaina, M.L., Andriamalaza, S., Rakotondrazafy, A.F.M., Razafimbelo, T., Rabeharisoa, L., Becquer, T. 401 SV-CP-37 Avaliação da produção de ácido indolacético por bactérias do gênero Azospirillum isoladas de pastagens nativas do Pantanal Sul-Mato-Grossense. Souza, M.S.T., Brasil, M.S.*, Reis Junior, F.B. 403 SV-CP-38 La respuesta de la expresión fitasa nodular a bajo fósforo varía según aislados de rizobios en la simbiosis Phaseolus vulgaris L. Morales Valdés, A.N.*, Gómez, L.A. , Amenc, L., Gregorio, C., Drevon, J.J. 405 SV-CP-39 Oxidases of diterpene phytohormone biosynthesis in Bradyrhizobium japonicum bacteroids. Rojas, M.C.*, Mendez, C., Baginsky, C., Hedden, P., Carú, M. 407 SV-CP-40 Effects of salts levels on phosphorus availability in non calcareous soil. Hamdi, W.*, Seffen, M., Deleporte, P., Drevon, J.J., Blavet, D., Gérard, F. 409 SV-CP-41 Bacterial acid phosphatase activity and localization in Phaseolus vulgaris nodules. Amenc, L.*, Drevon, J.J. 411 xxxi SV-CP-42 Responses of soil catabolic functions in cereal-legume intercrops. Wahbi, S., Baudoin, E., Maghraoui, T., Sanguin, H., Oufdou, K., Hafidi, M., Galiana, A., De Lajudie, P., Prin, Y., Duponnois, R. * 413 SV-CP-43 Managing a pluridisciplinary data base: Integrating knowledge to engineer the complexity of microbe-soil-plant interactions in FabaTropiMed agro-ecosystems Soto, P.*, Blavet, D., Balboa, A., Zanetto, A., Drevon, J.J., Desclaux, D. 415 Session VI. Inoculants in agriculture and the environment. SVI-P-1 Efficient soil microbial consorcia: a new dimension for sustainable agriculture and environmental sustainability. Cruz, C. 418 Universidade de Lisboa, Lisboa. Portugal. SVI-P-2 Oportunidades e ameaças à contribuição da fixação biológica do nitrogênio em leguminosas no Brasil. Nogueira, M.A. 422 Embrapa Soja, Londrina, Paraná, Brazil. SVI-CO-1 Selenium biofortification in wheat plants by co-inoculation of selenobacteria strains and arbuscular mycorhizal fungy for obtaining enriched selenium foods. Durán, P.*, Mora, M.M. 426 Center of Plant, Soil Interaction and Natural Resources Biotechnology, Scientific and Biotechnological Bioresource Nucleus. Universidad de la Frontera, Temuco-Chile. SVI-CO-2 Evaluación de la degradación de tamo de arroz por microorganismos lignocelulolíticos. Gutiérrez-Rojas, I.*, Pedraza-Zapata, C., Sánchez-Rodríguez, L., Moreno-Sarmiento, N. 428 Instituto de Biotecnología, Ciudad Universitaria, Edificio Manuel Ancizar, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C., Colombia. Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Laboratorio de Biotecnología Aplicada, Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI), Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia. SVI-CO-3 Soil microbial phosphorus, phosphorus availability and crop yield of upland ricecommon bean interc ropping under organic and mineral fertilizer inputs on ferrallitic soil of Malagasy highlands. Henintsoa, M.*, Andriamananjara, A., Razakatiana, A.T.E., Larvy Delarivière, J., Rabeharisoa, L., Becquer, T. 430 Laboratoire des Radioisotopes (LRI), University of Antananarivo, Madagascar. Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME), Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE), Antananarivo, Madagascar. Institut de Recherche pour le Développement (IRD), UMR Eco&Sols, c/o LRI, Madagascar. SVI-CO-4 Sistema uruguayo de fiscalización de inoculantes: complementación interinstitucional y aplicación de tecnologías de la información. * Beyhaut, E. , Barlocco, C., Altier, N., Mayans, M. 432 INIA Las Brujas, Ruta 48 Km 10, Canelones, Uruguay. 2 División Control de Insumos, DGSSAA. M.G.A.P, Av. Millán 4703, Montevideo, Uruguay. SVI-CP-01 Análise de crescimento e acúmulo de nutrientes pela variedade RB92579 de cana de açúcar plantada em um Argissolo com e sem inoculação e aplicação de Nfertilizante. Reis, V.M.*, de Oliveira, R.P., Schultz, N., de Araújo, A.P., Urquiaga, S. 434 SVI-CP-02 Effect of Maize-common bean intercropping on nitrogen uptake. Latati, M., Pansu, M., Drevon, J.J., Ounane, S.M. * 436 xxxii SVI-CP-03 Leguminous and cereal associations in the Sudano-sahelian agro-systems of Burkina Faso: agronomic and socio-economic determinants. Zongo, K.F.*, Hien, E., Drevon, J.J., Nacro, H.B. 438 SVI-CP-04 Emisión del gas de efecto invernadero óxido nitroso por nódulos de soja. * Tortosa, G., Bedmar, E.J., Mesa, S., Delgado, M.J. 440 SVI-CP-05 Development of biofertilisers and biocontrol agents with autochthonous microorganisms in Spain and Dominican Republic. Mulas, D., Díaz Alcántara, C., Barquero, M., Marcano, I., Urbano, B., Terrón, A., * Velázquez, E., González-Andrés, F. 442 SVI-CP-06 Soybean yield and nodule occupancy as a function of yearly inoculation in the Brazilian Cerrados. Mendes, I.C.*, Reis Junior, F.B., Hungria, M. 444 SVI-CP-07 Recuperação e sobrevivência de Bradyrhizobium em sementes de soja tratadas com fungicidas e inseticidas Ferreira, E.*, Nogueira, M.A., Fukami, J., Gundi, J.S., Terassi, F.S., Conceição, R., Hungria, M. 446 SVI-CP-08 Influence of nitrate fertilization on Hg uptake and oxidative stress parameters in alfalfa plants cultivated in two different Hg-polluted soils. Carrasco-Gil, S., Aguareles, A., Leralta, D., Sobrino-Plata, J.*, Millán, R., Hernández, L.E. 448 SVI-CP-09 Gluconacetobacter diazotrophicus enhances growth in initial stages of Ilex paraguariensis development. Dos Santos, K . C. G . , Lopez, D.S.H., Perez, L.M., Roberti, L., Figueredo, I.E., Schmid, P.G., Peres, C.K., Rojas, C.A.* 450 SVI-CP-10 Nuevas herramientas metodológicas para la evaluación de inoculantes destinados al tratamiento de leguminosas. Penna, C.*, Massa, R., Cabrini, P., Scarabel, D., de Araujo, S.C., Cassan, F. 452 SVI-CP-11 Selección de cepas de rhizobia tolerantes a mercurio por su capacidad de bioacumulación y su efectividad en leguminosas arbustivas. Ruiz-Díez, B., Fajardo, S., Quiñones, M.A., López, M.A., Higueras, P., FernándezPascual, M.* 454 SVI-CP-12 Genetically modified rhizobia (GMR) for phytostabilization of copper in polluted soils. * Pajuelo, E. , Delgadillo, P., Doukkali, J., Pérez-Palacios, B., Caviedes, M.A., RodríguezLlorente, I.D. 456 SVI-CP-13 Utilización de biorrollos vegetales en cultivos de olivar para la reducción de las pérdidas de nitratos por escorrentía. * Pesciaroli, C. , Rodríguez García, E., Rodelas, B., Contreras-Medrano, V., GarcíaMartínez, F.J., G onzález-Martínez, J., González-López, J., Osorio Robles, F. 458 SVI-CP-14 Soybean Biological Nitrogen Fixation in Brazil, inoculant quality 2010- 2011. Beneduzi, A.*, Bangel, E.V., Alvarenga, S.M., Ferreira, S., Bertolo, F., Silva, G., Freire, J.R.J. 460 SVI-CP-15 Ensayo en diferentes cultivos y condiciones de un biofertilizante en base a Pseudomonas spp y Azospirillum spp. Rosas, S.*, Neiderhauser, M., Bettera, C., Bosch, E. 462 SVI-CP-16 Mistura polimérica como veículo na formulação de inoculante rizobiano para feijão-caupi. * Xavier, G.R. , Silva Júnior, E.B., Fernandes Júnior, P.I., Oliveira, P.J., Rumjanek, N.G., Boddey, R.M. 464 xxxiii SVI-CP-17 Substrate-based vs commercial inocula of arbuscular mycorrhizal fungi in lettuce. Garmendia, I., Mangas, V.J.* 466 SVI-CP-18 Algunas experiencias con inoculantes de hongos Glomeromycota y bacterias solubilizadoras de roca fosfórica en sistemas agrícolas venezolanos. * Toro, M. , Mora, E., López-Hernández, D. 468 SVI-CP-19 Plant-growth promotion and biocontrol properties of Colombian Streptomyces spp. isolates to control bacterial rice diseases. Suárez-Moreno, Z.R., Vergara, D.I., Vinchira-Villarraga, D.M., Castellanos, L., Ramos, * F.A., Degrassi, G., Guarnaccia, C., Venturi, V., Moreno-Sarmiento, N. 470 SVI-CP-20 Microbial consortia of mycorrhizal fungi and plant-growth promoting rhizobacteria: a tool to increase maize nutrient use efficiency. Correia, P.*, Carvalho, L., Meleiro, A.I., Reis, A., Costa, F., Delgado, M., Mesquita, L., Dores, J.M., Patanita, M., Castro Pinto, J., Varennes, A., Carolino, M., Cruz, C. 472 SVI-CP-21 Mycelial inoculant production of the ectomycorrhizal fungus Amanita caesarea. Daza, A., Camacho, M., Romero de la Osa, L., Santamaría, C.* 474 SVI-CP-22 Organic selenium forms from selenobacteria strains able to enhance selenium in wheat grain. * Mora, M.L. , Acuña, J.L., Durán, P., Demanet, R. 476 SVI-CP-23 Efecto de metales pesados en el crecimiento de bacterias aisladas del compost de lodos de depuradora. Vela Cano, M.*, Castellano Hinojosa, A., Fernández Vivas, A., Martínez Toledo, M.V. 478 SVI-CP-24 Capacidad de nodulación y fijación de nitrógeno de cepas nativas de Bradyrhizobium sp. en el cultivo de guandul (Cajanus cajan, L.) bajo ambiente controlado, en República Dominicana. Monegro, F., Sosa, R., Vicioso, A.F., Pimentel, A., González-Andrés, F., Díaz Alcántara, C.A.* 480 SVI-CP-25 Mycorrhizal inoculation in organic farming can improve fruit quality. Aguirrebengoa, M., Rivero, J., García, J.M., Azcón-Aguilar, C., López Raez, J.A., Pozo, M.J.* 482 SVI-CP-26 Efecto del herbicida MCPA y flumetsulam en bacterias nitrificantes en suelos volcánicos tratados con urea. Palma, G.*, Jorquera, M., Marileo, G., Briceño, G., Demanet, R., Mora, M.L. 484 SVI-CP-27 Produção de biomassa e fixação biológica de nitrogênio em Flemingia macrophylla. Abboud, A.C.S.*, Salmi, A.P. 486 SVI-CP-28 A construção de uma rede de promoção do benefício da fbn através dos inoculantes: uma proposta metodológica de parceria público privado. Amâncio, C.*, Amâncio, R., Garofolo, A.C., Xavier, G.R., Hungria, M., Cipriano, R., Balbinot Jr, A., Motta, R. 488 SVI-CP-29 FP7 REFERTIL Project: results on Input materials and Compost on Month 24. * * González Granados, I. , Segura Muñoz, I., Estrada de Luis, B.I., García García, R. 490 xxxiv Award “Antonio J. Palomares” Conference Simplicity turned out complicated: How FixK2, a key regulator of genes for symbiosis, is exquisitely controlled by different means. Mesa, S. 493 Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín, Consejo S uperior de Investigaciones Científicas, Granada, Spain. Closing Conference Uma década de ouro se aproxima para a microbiologia do solo: expectativas da pesquisa, da indústria, dos agricultores e da sociedade. Mariangela Hungría. 497 Embrapa Soja, Londrina, Paraná, Brazil Indexes Author index 506 Participants 519 xxxv Opening Session Opening Session Quorum sensing: a double-edge sword in bacterial-plant interactions. Cámara, M.* Centre for Biomolecular Sciences, School of Life Sciences, University of Nottigham, Nottingham NG7 2RD. * [email protected] Quorum sensing: a universal signaling language Bacteria are highly social organisms capable of sophisticated co-operative behaviours mediated via chemical communication or ‘quorum sensing’ (QS). This is a gene regulatory mechanism usually defined as cell population density dependent regulation and is mediated via self-generated extracellular signal molecules (Figure 1) (Joint et al., 2007; von Bodman et al., 2008; Williams et al., 2007). These low molecular weight compounds or ‘autoinducers’ activate or repress QS target genes once a critical threshold concentration of signal has been reached. The key components of any QS ‘module’ are the QS signal synthase, the signal receptor and the signal molecule (Figure 2) ( Williams et al., 2007). -Butyrolactones N-Acylhomoserine Lactones Many bacteria possess several HO O interacting QS gene regulatory OH O CH modules employing multiple AI-2 2-Alkyl-4signal molecules. Such QS Cyclic Pep des Quinolones HO OH HO O systems are often subject to B O HO DSF O positive feedback CH Furanones CSP-1 (autoinduction) which at high C18-FAME -EMRLSKFFRDFILQRKKpopulation densities results in a marked increase in QS signal Gram-posi ve Gram-nega ve molecule (QSSM) production and consequently enhanced expression of the target gene(s) (Figure 2). Bacterial Farnesol Oxylipids cell-to-cell communication does not however only occur at high cell population Figure 1. Chemical structures of a range of quorum sensing signal molecules in eukaryotes and prokaryotes densities and QS has been adopted as a generic term for the description of any bacterial intercellular communication involving diffusible signal molecules. Bacteria employ a chemically diverse range of molecules as QSSMs some of which interact with receptors at the cell surface while others act following internalization ((Joint et al., 2007; Williams et al., 2007). R1 R2 O H O N H HO O H 3 O O R1 N H O R2 COOH O OH S S H Tyr 3 Ser Thr N H O Phe Me NH Asp Ile 2HN PROKARYOTES O O COOH H3CO EUKARYOTES Until the early 1990’s, N-acylhomoserine lactone (AHL)mediated regulation of gene expression was considered to be interesting but restricted to just a few esoteric bioluminescent marine bacteria related to Vibrio fischeri. However, the Gramnegative plant pathogen Erwinia carotovora was unexpectedly Figure 2: Typical prototype of quorum sensing cascade 2 Opening Session discovered to use N-3-oxohexanoyl-homoserine lactone (3OC6-HSL) to control both the production of a carbapenem antibiotic and virulence. Mutants which could not synthesize 3OC6-HSL were avirulent in a plant model of infection, and virulence could be restored in these mutants by the addition of synthetic 3OC6-HSL. This discovery was followed by a major surge of interest in the role of AHLs in bacterial gene expression. A family of AHL signal molecules has now been identified which varies predominantly in the presence or absence of an acyl chain substituent group at C3 (oxoor hydroxy-) and the length of the N-acyl side chain. In addition, genes encoding homologues of the V. fischeri LuxI and LuxR proteins have identify from many different Gram-negative associated with human, animals and plants. Since this initial discoveries, quorum sensing signal molecules of a novel nature have been identified not only in Gram negative and positive bacteria but also in eukaryotic organisms such as yeast (Figure 1) ( Williams et al., 2007) Quorum sensing and cross-talk QSSMs have been found in different environments from the human host during infection to marine biofilms providing evidence that QS is active in vivo situations. These molecules not only affect the expression the biology of the organisms that make them but can also affect the behaviour of other organisms from different species and kingdom. Figure 3 illustrates some examples of crosscommunication. Cross-talk bacteria-bacteria While most investigations of QS signal transduction pathways have focused on the response of the producer to its own signal, in natural environments and in mixed infections, QS signal molecules are likely impact on the behavior of other microorganisms which ei ther produce similar signals or very different signals. In the latter case, the P. aeruginosa QS signals 3-oxo-C12-HSL has been shown to inhibit the growth of Staphylococcus aureus at concentrations above 30 µM whereas at sub-growth 3 Opening Session inhibitory concentrations inhibited the expression of the staphyloccal agr-mediated quorum sensing system, enhancing the expression of colonisation factors but switching off the production of host-damaging toxins (Qazi et al., 2006). Cross-talk bacteria-yeast Cross-communication has also been found between bacteria and yeast using QSSMs. One example is the interactions observed between P. aeruginosa and Candida albicans which can co-exist in certain environments The QSSM 3-oxo-C12-HSL from P. aeruginosa can suppres filamentation in C. albicans without affecting fungal growth whereas the sesquiterpene farnesol used as a QSSM in C. albicans can interfere with QS in P. aeruginosa (Cugini et al., 2007; Cugini et al., 2010). Current research is looking at how wide spread these mechanisms of cross-talk between eukaryotes and prokaryote using QSSMs are. Cross-talk bacteria eukaryotic cells A significant amount of work has shown that QSSM molecules can have a serious impact in the mammalian host by altering immune responses, producing strong cardiovascular effects resulting in the potential increase in blood flow to the site of infection and disrupting tight cell junction to enable invasion. This multiple impact facilitate the survival of pathogenic bacteria under hostile environment of the host (Williams and Cámara, 2009). Cross-talk between bacteria and plants It has been demonstrated that QS is required for the successful colonisation of plant hosts by bacteria. The best studied QSSMs in this relationship are AHLs. In plantassociated Gram-n egative bacteria, AHLs are used by symbiotic, pathogenic, and biological control strains to regulate a wide range of phenotypes including virulence, rhizosphere competence, conjugation, the secretion of hydrolytic enzymes, and the production of antimicrobial secondary metabolites. Very importantly, AHLs play a key role in bacterial-plant cross-signaling, and some plants have been shown to be able to reprogram gene expression in the presence of these bacterial molecules. In general AHLs with short N-acyl chains can promote plant growth by inducing a change in the hormonal balance between indole acetic acid and cytokinin whereas some AHLs with longer N-acyl chain tend to modulate root development and root hair formation although the mechanisms behind this are still not well understood. Finally some AHLs with long N-acyl chains have been shown to induce resistance against microbial pathogens. Interestingly, plants have develop the ability to interfere with AHL-QS systems by producing small molecules which can interfere with bacterial QS-mediated mechanisms (Gonzalez and Venturi, 2013). The close relationship between QS producers and the plants reach such level that a new class of AHL signals have been found which require the plant precursors for its biosynthesis. These AHLs are pcoumaroyl-AHLs. The precursor molecule p-coumarate is not synthesized by the bacterium but is provided by the plant and it can be found in the plant environment suggesting that bacteria can only synthesise these signals in the proximity of the plant (Schaefer et al., 2008). Cross-talk bacteria-algae The green seaweed Ulva is the most common macro-alga contributing to biofouling of man-made surfaces throughout the world with enormous reproductive potential releasing vast quantities of motile zoospores from each thallus. Zoospores were shown 4 Opening Session to preferentially settle on top of AHL-producing bacterial biofilms and hence using these signal molecules as a cue for the selection of sites for attachment (Joint et al., 2002). The mechanisms responsible for this seems to involve a process of chemokinesis which affects the swimming behaviour of the zoospores through the induction of an increase in intracellular Ca2+ levels. Interestingly, bacteria producing AHL degrading enzyme within microbial biofilms on rocks can interfere with the settlement of zoospores in mixed biofilms showing a direct correlation between the levels of AHLs, degradation activity and spore settlement (Tait et al., 2009). Similarly, reduction of AHL stability by the pH of sea water can affect spore settlement (Tait et al., 2005). Very recently it has been demonstrated that epiphytic bacteria associated with Ulva can interfere with the germination and growth of Ulva zoospores and that this interference is mediated via the production of AHLs by these bacteria, revealing an additional role for AHLs per se in the interactive relationships between marine bacteria and Ulva zoospores (Twigg et al., 2013). In conclussion, quorum sensing is a very versatile bacterial language with an important impact on the relationship between bacterial species and between bacterial communitites and their hosts. Whilst these relationship can sometimes result in very postive symbiosis, in some instances it can have a negative efffect on the host. Understanding better this interactions will be paramount in may areas of research including agriculture. REFERENCES Cugini, C., et al. (2007). Mol. Microbiol. 65: 896-906. Cugini, C., et al. (2010). Microbiology 156: 3096-3107. Gonzalez, J.F., and Venturi, V. (2013). Trends Plant Sci, 18: 167-174. Joint, I., et al. (2007). Philos. T. Roy. Soc. B 362: 1115-1117. Joint, I., et al. (2002). Science 298: 1207. Qazi, S., et al. (2006). Infect. Immun. 74: 910-919. Schaefer, A.L., et al. (2008). Nature 454: 595-599. Tait, K., et al. (2005). Environ. Microbiol. 7: 229-240. Tait, K., et al. (2009). Environ. Microbiol. 11: 1792-1802. Twigg, M., et al. (2013). Environ. Microbiol. (in press). von Bodman, S.B., et al. (2008). J. Bacteriol. 190: 4377-4391. Williams, P., and Cámara, M. (2009). Curr. Opin. Microbiol. 12: 182-191. Williams, P., et al. (2007). Philos. T. Roy. Soc. B 362: 1119-1134. 5 Session I Ecology, diversity and evolution microorganisms beneficial to plants of Session I SI-P-1 Diversidad y evolución de las comunidades microbianas en la rizosfera tras un incendio forestal. Fernández-López, M.1*, Fernández-González, A.J.1, Cobo-Díaz, F.J.1, Villadas, P.J.1, Tringe, S.G.2, Toro, N.1 1 Departamento de Microbiología del Suelo, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, calle Profesor Albareda 1, 18008 Granada, España. 2 Joint Genome Institute, Dept. of Energy, Walnut Creek, Califo rnia, USA. * [email protected] Ecología microbiana y nuevas tecnologías de secuenciación masiva. Si como científicos pioneros de los estudios de diversidad microbiana podemos citar a Louis Pasteur y a Robert Koch, en los de ecología microbiana no podemos dejar de mencionar a Vladimir I. Vernadsky, Segei Winogradsky y Martinus Beijerinck. El primero de ellos definió los conceptos de ciclos biogeoquímicos y el de biosfera, el segundo trabajó en los ciclos biogeoquímicos de S, Fe y N, así como desarrolló el concepto de quimioautotrofía, y por su parte Beijerinck ideó los cultivos de enriquecimiento, trabajó en el ciclo del N y aisló los microorganismos responsables de este proceso. A pesar de que sus inicios están en el siglo XIX, el desarrollo real de la ecología microbiana se ha producido gracias a las técnicas de biología molecular. Así no podemos olvidar los trabajos de Carl Woese en la década de los años 70 del siglo XX, a partir de los que se estableció el gen 16S rRNA como herramienta con validez taxonómica y filogenética para identificar microorganismos. La introducción de estas técnicas moleculares ha permitido realizar estimaciones realistas sobre la diversidad de microorganismos presentes en el suelo, constituyendo un tópico citar lo mucho que desconocemos. Así se ha citado ampliamente que los microorganismos constituyen la mayor biodiversidad del planeta (Gans et al., 2005; Rusch et al., 2007) y comprenden la mayor parte de la biomasa de los organismos que lo habitan con 10 3-104 kg de masa microbiana por hectárea de superficie del suelo (Fierer et al., 2007), que sólo hemos sido capaces de cultivar el 1 % del total de microorganismos; o que en 1 gramo de suelo podemos encontrar entre 103 y 104 especies diferentes, representando una abundancia total de 109 procariotas por gramo de suelo (Gans et al., 2005, Torsvik et al., 1990). De lo expuesto anteriormente se deduce que el que un microorganismo pueda ser cultivado es más una excepción que la regla. Todo esto nos lleva a concluir que debemos aplicar técnicas moleculares a los estudios de las comunidades microbianas, si queremos tener una visión realista de lo que está ocurriendo en el medio ambiente. En este contexto, Handelsman y colaboradores acuñaron el término “metagenoma” para definir el conjunto de los genomas de todos los organismos presentes en un determinado hábitat. En su primera acepción, se consideró el metagenoma como el resultado de extraer el ADN de todo un ecosistema para clonarlo en complejas genotecas de ADN recombinante (librerías de ADN ambiental). Posteriormente estas genotecas se sometían a protocolos de búsqueda de compuestos de interés o de identificación de genes que aporten información sobre las rutas metabólicas activas en el ecosistema, el funcionamiento potencial del ecosistema (Hall, 2007). Estas aproximaciones metodológicas también se han aplicado al estudio de la rizosfera tanto de plantas con interés agronómico como forestal (Fernández-López et al., 2013). Hasta ahora, el éxito de estos métodos metagenómicos dependía en gran medida de la capacidad de clonar fragmentos de ADN de suelo suficientemente grandes en los vectores apropiados y de su capacidad para expresar la información genética en hospedadores heterólogos de forma eficiente (Rondon et al., 2000). 7 Session I SI-P-1 Sin embargo el desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva (NGS) a partir del año 2005 nos permite obviar la construcción de estas genotecas para pasar a secuenciar directamente el ADN ambiental extraído del suelo, es decir sin necesidad de clonarlo en ningún tipo de vector. El desarrollo vertiginoso de estas tecnologías de secuenciación masiva es el que nos ha llevado a una nueva era, permitiendo la aparición de aproximaciones de tipo post-genómico (Medini et al., 2008). Al realizar la secuenciación de forma directa se evitan los sesgos motivados por el propio proceso de clonación y obtenemos una visión más realista de los procesos que ocurren en el suelo. Estos nuevos métodos de secuenciación basados en distintas técnicas y puestos a punto por diferentes compañías, tienen en común su bajo coste y su alto rendimiento: el gran número de lecturas que ofrecen en un periodo corto de tiempo. Así la pirosecuenciación 454 Titanium Plus de Roche permite obtener 1 millón de lecturas de 800 bp, la secuenciación por síntesis de Illumina nos ofrece 1.500 millones de lecturas de 2 x 100 bp o la secuenciación por ligación SOLID rinde 171 millones de lecturas de 70 bp (Zhang et al., 2011). Una alternativa es la aplicación de estas técnicas a la secuenciación de amplicones de genes de interés, como puede ser el 16S rRNA, de esta manera se puede conocer la diversidad presente en las comunidades microbianas con una cobertura superior al 90 %. Por otra parte las tecnologías NGS han permitido que se empiece a desarrollar la “metatranscriptómica”. En esencia, esta aproximación consiste en la extracción del ARN total presente en el suelo, para posteriormente sintetizar un cDNA mediante el empleo de oligonucleótidos cebadores al azar y proceder a su secuenciación mediante cualquiera de las técnicas NGS. A diferencia de la metagenómica que nos ofrece una visión del catálogo general de especies y de procesos funcionales que pueden estar presentes y desarrollarse en un ecosistema, la metatranscriptómica, nos ofrece una visión de las especies y procesos metabólicos que están activos. Por tanto este doble abordaje nos permite describir tanto el potencial de cada ecosistema (metagenoma), como los organismos procariotas y procesos que actúan en un momento determinado (metatranscriptoma). Esta aproximación se ha aplicado para el estudio de distintos ecosistemas incluyendo el océano abierto o columnas de agua del mismo (Stewart et al., 2010), suelos, suelos agrícolas, compost, muestras fecales y orales de mamíferos, y aguas residuales (McGrath et al., 2008), así como en suelos forestales (Baldrian et al., 2012). Bosque mediterráneo e incendios forestales. Donde las condiciones ambientales lo permiten, los bosques son la etapa clímax en la sucesión de un ecosistema, presentando al mismo tiempo la menor diversidad de especies y la mayor especialización de las mismas. Esto hace que pequeños cambios ambientales puedan tener un gran impacto sobre estas formaciones. En los ecosistemas de tipo mediterráneo las comunidades vegetales están expuestas a unas condiciones climáticas que pueden considerarse como extremas ya que alternan periodos de heladas invernales, sequía y alta temperatura estival, y ocasionales lluvias torrenciales. Además en un escenario de cambio climático como el que se prevé para la zona mediterránea, con una temperatura mayor y una precipitación menor, catástrofes como los incendios forestales se verán incrementadas. En España, la superficie afectada por incendios forestales alcanzó una media de 127.209 ha al año en el periodo comprendido entre los años 2000-09, incluyendo en esta superficie bosques, matorral y formaciones herbáceas (http://www.magrama.gob.es/es/biodiversidad/temas/defensa -contra-incendiosforestales/estadisticas -de-incendios-forestales/). En la cuenca mediterránea, la intervención humana promoviendo el pastoreo, las talas o las quemas controladas ha 8 Session I SI-P-1 dado lugar al desarrollo de una vegetación específica y adaptada a estas condiciones. Entre esta vegetación podemos destacar a la encina, Quercus ilex subsp. ballota, que tiene capacidad de rebrotar desde la raíz tras un incendio forestal. La encina es la quercínea que ocupa una mayor extensión en España (96.579 Km2), aunque sus bosques son muy escasos ya que en su mayoría han sido manejados hasta la actual fisonomía de dehesas (Felicísimo et al., 2011). Se trata de un árbol o arbusto perenne ampliamente distribuido por toda la región mediterránea, apareciendo desde el nivel del mar hasta los 1.700 m de altitud en exposiciones no umbrías, con climas desde frío semiárido hasta mediterráneo húmedo templado, aunque prevalece en zonas áridas con precipitaciones estivales bajas y máximas elevadas, siendo indiferente al tipo de suelo. En el mes de Septiembre del año 2005 se produjo un incendio forestal en el Parque Nacional de Sierra Nevada, que afectó 3.416,74 has. (Gómez-Zotano et al., 2010). Aunque la cubierta vegetal más afectada en este incendio fue la de matorral, hay que señalar que la quema de vegetación forestal constituyó casi el 21% del total, estando localizada principalmente en los términos municipales de Lanjarón y Lecrín. El encinar afectado supuso el 1,56% del total de la vegetación, con una superficie de 53,41 has; pero si sumamos los distintos tipos de cubiertas vegetales (tomillar, espinal, piornal,…) afectadas que presentaban encinas en su composición, este porcentaje se eleva al 12,06% lo que se traduce en una superficie de 412 has quemadas (Gómez-Zotano et al., 2010). Microbiota rizosferica tras un indendio forestal. Las altas temperaturas alcanzadas en un incendio forestal inducen cambios inmediatos en las propiedades físicas y químicas del suelo, cuya intensidad depende de la gravedad del incendio y del tipo de suelo (Certini 2005). Estos cambios más las condiciones ambientales post-incendio determinarán los cambios de las características biológicas del suelo como la biomasa y la actividad microbiana (Wang et al., 2012). Además se produce una alteración de la estructura de las comunidades microbianas con un incremento de las bacterias formadoras de esporas más resistentes a las altas temperaturas (Yeager et al., 2005; Bárcenas-Moreno et al., 2011). Hay que tener en cuenta que después de un incendio forestal, de forma efímera, hay una ganancia neta de Nitrógeno (N) disuelto. Así se ha concluido que en las zonas mediterráneas hay un incremento del Carbono orgánico del suelo y del N total después del incendio, pero no de la mineralización de N (Wang et al., 2012), por lo que se incrementa la posibilidad de pérdidas de este elemento debido a lixiviación y a una menor actividad. Las bacterias del suelo son componentes esenciales del ciclo biogeoquímico del N, pero han sido poco estudiadas en las condiciones del suelo posteriores a un incendio forestal (Goodale and Aber, 2001). En nuestro grupo estamos trabajando en estas condiciones en la rizosfera de especies forestales, en concreto en encinas. Para estudiar la diversidad y la evolución de las comunidades microbianas hemos optado por la aplicación de técnicas de secuenciación masiva, tanto 454 Titanium como Illumina. Así, la rizosfera de encinas afectadas y no afectas por el incendio forestal del año 2005, la hemos muestreado 3 y 6 años después. El ADN total obtenido del suelo ha sido tratado con 2 aproximaciones: a) Amplificación del gen 16S rRNA y pirosecuenciación para determinar la diversidad microbiana de forma exhaustiva. b) Secuenciación directa del ADN mediante el sistema Illumina para determinar las variaciones del ciclo del N por efecto del incendio. El detalle y las implicaciones de estos resultados se discutirá en la presentación. 9 Session I SI-P-1 AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el Organismo Autónomo Parques Nacionales del Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (proyecto OAPN 21/2007), por la Junta de Andalucía (proyecto de excelencia P08-CVI-03549) y por el programa Consolider-Ingenio (CSD 2009-00006). AJFG es beneficiario de una beca FPU del Ministerio de Innovación y Ciencia, y JFCD de una beca predoctoral de la Junta de Andalucía. BIBLIOGRAFÍA Baldrian, P., et al. (2012). ISME J. 6: 248-258. Bárcenas-Moreno, G., et al. (2011). Biol. Fert. Soils 47: 261-272. Certini, G. (2005) Oecologia 143: 1-10. Felicísimo, Á.M., et al. (2011). Impactos, vulnerabilidad y adaptación al cambio climático de la biodiversidad española. 1. Flora y vegetación. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Madrid. Fernández-López, M., et al. (2013). En: Encyclopedia of Metagenomics. K.E. Nelson, S. Highlander, F. Rodríguez-Valera y B.A. White (eds.). http://www.springerreference.com DOI: 10.1007/SpringerReference_304477. Fierer, N., M. et al. (2007). Appl. Environ. Microbiol. 73: 7059-7066 Gans J, M. et al. (2005). Science 309: 1387-1390. Gómez-Zotano, J., et al. (2005). Cuadernos Geográficos 37: 205-214. Goodale, C.L., and J.D. Aber (2001) Ecol. Appl. 11: 253-267. Hall, N. (2007) J. Exp. Biol. 209: 1518-1525. McGrath, et al. (2008).J. Microb. Meth. 75: 172-176. Medini D, D. et al. (2008). Nature Rev. Microbiol. 6: 419-430 Rondon M.R., P.R. et al. (2000). Appl Environ Microbiol 66:2541-2547. Rusch, D.B., et al. (2007). PLoS Biol. 5: e77. Stewart, F.J., et al. (2010). ISME J 4: 896-907. Torsvik V, et al. (1990). Appl. Environ. Microbiol. 56: 782-787. Wang, Q., et al.. (2012). Forest Ecol. Manag. 271: 91-97. Yeager, C.M., et al. (2005). Appl. Environ. Microbiol. 71: 2713-2722. Zhang, J., et al. (2011). J. Genet. Genomics 38: 95-109. 10 Session I SI-P-2 Species and symbiovars within Mesorhizobium: diversity and host range. Laranjo, M.1, 2*, Oliveira, S.1 1 ICAAM-Instituto de Ciências Agrárias e Ambientais Mediterrânicas, Universidade de Évora, Portugal IIFA-Instituto de Investigação e Formação Avançada, Universidade de Évora, Portugal * [email protected] 2 ABSTRACT The genus Mesorhizobium includes species able to nodulate a wide variety of legumes. Our aim was to investigate the evolutionary relationships among mesorhizobia species that nodulate the same host plant. A multilocus sequence analysis (MLSA) phylogeny of the Mesorhizobium genus showed a higher resolution compared to the 16S rRNA gene phylogeny. The phylogenies of symbiosis genes, such as nodC, are not congruent with the phylogenies based on core genes, reflecting rhizobial host range and legume phylogeny. This suggests that Mesorhizobium species are able to exchange symbiosis genes by lateral gene transfer (LGT), thus acquiring the ability to nodulate a new host. Phylogenetic analyses of the Mesorhizobium genus based on core or accessory genes reveal complex evolutionary relationships and a high genomic plasticity, rendering the Mesorhizobium genus as a good model to investigate rhizobia genome evolution and adaptation to different host plants. INTRODUCTION Rhizobia are the root nodule bacterial symbionts of legumes, which fix atmospheric N2 in a process known as biological nitrogen fixation. All described rhizobial species belong to ten genera of Alpha- and three genera of Betaproteobacteria. Mesorhizobia nodulate a wide variety of legumes, such as chickpea (Sprent, 2009). There are 25 Mesorhizobium species. Additionally, five more species are listed in “IJSEM-Papers in Press”. This genus includes a non-rhizobium-M. thiogangeticum (Ghosh & Roy, 2006). Biovars have been described in bacteria as a group of strains distinguishable from others of the same species on the basis of physiological or biochemical characters. In rhizobia, biovars have been used to distinguish symbiotically distinct groups within a single species (Rogel et al., 2011). These symbiovars may belong to different species due to lateral transfer of symbiosis genes (Laranjo et al., 2008). A Mesorhizobium MLSA phylogeny based on the 16S rRNA gene, the ITS region (16S–23S rRNA) and five core genes: atpD (ATP synthase F1, subunit), dnaJ (DnaJ chaperone), glnA (glutamine synthetase I), gyrB (DNA gyrase subunit) and recA (recombinase A) is presented. Moreover, phylogeny of the symbiosis gene nodC (Nacetylglucosaminylt ransferase) is compared with a legume phylogeny based on the chloroplast maturase K (matK) gene (Wojciechowski et al., 2004). MATERIAL AND METHODS Phylogenetic analyses were conducted with MEGA5 using the maximum likelihood method. The best-fitting evolutionary model of nucleotide substitutions was determined. A bootstrap confidence analysis was performed on 100 replicates. Azorhizobium caulinodans was used as outgroup. RESULTS AND DISCUSSION The 16S rRNA gene based phylogeny including all 25 species is shown in Figure 1. Four species groups (A to D) can be considered and at least two species have an 11 Session I SI-P-2 undefined position, namely M. albiziae and M. chacoense. M. thiogangeticum has a clearly separate position from other mesorhizobia. Mesorhizobium mediterraneum UPM-Ca36 93 Mesorhizobium temperatum SDW 018 Mesorhizobium muleiense CCBAU 83963 47 86 Mesorhizobium robiniae CCNWYC 115 Mesorhizobium caraganae CCBAU 11299 70 Mesorhizobium gobiense CCBAU 83330 A Mesorhizobium metallidurans STM 2683T 59 Mesorhizobium tarimense CCBAU 83306 Mesorhizobium tianshanense A-1BS Mesorhizobium tamadayense Ala-3 41 70 Mesorhizobium huakuii IFO 15243 Mesorhizobium opportunistum WSM2075 Mesorhizobium amorphae ACCC19665 21 61 Mesorhizobium septentrionale SDW 014 B Mesorhizobium plurifarium LMG 11892 95 Mesorhizobium silamurunense CCBAU 01550 Mesorhizobium albiziae CCBAU 61158 95 96 Mesorhizobium australicum WSM2073 Mesorhizobium shangrilense CCBAU 65327 100 90 Mesorhizobium ciceri UPM-Ca7 C Mesorhizobium loti LMG 6125 Mesorhizobium chacoense PR5 Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2 40 100 Mesorhizobium camelthorni CCNWXJ40-4 D Mesorhizobium thiogangeticum SJT Azorhizobium caulinodans ORS 571 0.01 Figure 1. Mesorhizobium maximum likelihood phylogeny of the 16S rRNA gene (25 species). Tamura 3pa rameter model with a discrete Gamma distribution and invariant sites was used. The 16S rRNA gene phylogeny was compared to a MLSA phylogram of seven loci (16S rRNA, ITS, atpD, dnaJ, glnA, gyrB and recA) (Figure 2). 46 Mesorhizobium tarimense 100 Mesorhizobium tianshanense 100 48 100 73 43 Mesorhizobium gobiense Mesorhizobium mediterraneum Mesorhizobium temperatum Mesorhizobium metallidurans Mesorhizobium amorphae 100 Mesorhizobium septentrionale 74 Mesorhizobium caraganae 100 Mesorhizobium ciceri Mesorhizobium loti 100 56 60 Mesorhizobium australicum Mesorhizobium huakuii Mesorhizobium opportunistum Mesorhizobium plurifarium Mesorhizobium chacoense Azorhizobium caulinodans 0.5 Figure 2. MLSA maximum likelihood phylogeny for the Mesorhizobium genus (15 species). Tamura 3para meter model with a discrete Gamma distribution and invariant sites was used. The resulting MLSA phylogeny with a subgroup of 15 species is highly resolved, with all branches having high bootstrap support (Laranjo et al., 2012). Although most Mesorhizobium species show relatively low sequence divergence at core loci, there are certain groupings of species that are consistently recovered both in the 16S rRNA gene phylogeny and in the MLSA phylogeny, namely M. mediterraneum/M. 12 Session I SI-P-2 temperatum, M. gobiense/M. tarimense/M. tianshanense, M. loti/M. ciceri, M. amorphae/M. septentrionale, as had been observed before between phylogenies of different core loci (Alexandre et al., 2008; Laranjo et al., 2012). This suggests that there is little horizontal gene transfer of core loci between these groupings. However, it is not clear that every species within each group is genetically isolated. On the other hand, there are some species within the Mesorhizobium clade which have a poorly resolved phylogenetic position, such as M. albiziae, M. chacoense and M. thiogangeticum, among others. Contrary to Rhizobium and Sinorhizobium, which carry symbiosis plasmids, Bradyrhizobium and Mesorhizobium species harbour their symbiosis genes clustered in the chromosome. In Mesorhizobium strains symbiosis genes are most commonly located in chromosomal symbiosis islands (Kaneko et al., 2000; Nandasena et al., 2007) and rarely in plasmids (Wang et al., 1999; Zhang et al., 2000). These islands have been shown to be mobile in Mesorhizobium, but not in Bradyrhizobium. 100 100 Mesorhizobium australicum Mesorhizobium opportunistum Mesorhizobium metallidurans 77 Mesorhizobium ciceri 36 99 100 Cicer arietinum Mesorhizobium mediterraneum Mesorhizobium loti 26 Lotus Mesorhizobium tarimense Mesorhizobium amorphae 14 44 Biserrula pelecinus Mesorhizobium chacoense Amorpha fruticosa Prosopis Mesorhizobium temperatum 13 97 Mesorhizobium septentrionale 86 Mesorhizobium gobiense 91 Mesorhizobium tianshanense Glycyrrhiza Astragalus Mesorhizobium caraganae Mesorhizobium huakuii Azorhizobium caulinodans Sesbania 0.1 Figure 3. Mesorhizobium genus maximum likelihood nodC based phylogeny (15 species). Tamura 3parame ter model with invariant sites was used. Legume hosts are indicated on the right-hand side. nifH (data not shown) (Laranjo et al., 2008) and nodC (Figure 3) phylogenies are congruent and evidence a close relationship among rhizobial strains nodulating the same host, as suggested before (Laguerre et al., 2001). LGT of symbiosis genes between the different species in the soil seems to be the most plausible hypothesis to explain incongruence between phylogenies based on symbiosis (e. g. nodC) and core genes (e. g. 16S rRNA). Furthermore, phylogeny of symbiosis genes is compared to host legume phylogeny (Figure 4) based on the chloroplast encoded maturase K gene (matK) (Wojciechowski et al., 2004). 13 Session I SI-P-2 100 100 Astragalus americanus Biserrula pelecinus 41 Oxytropis deflexa Cicer arietinum 68 Alhagi maurorum 100 Caragana arborescens 88 100 Glycyrrhiza lepidota Robinia pseudoacacia 100 Sesbania vesicaria 96 Anthyllis vulneraria 36 100 100 Lotus japonicus Clitoria ternatea Amorpha fruticosa Prosopis glandulosa 100 79 Acacia greggii Albizia julibrissin Oxalis tomentosa 0.02 Figure 4. Maximum likelihood legume phylogeny based on the matK gene (16 legume species). General time reversible (GTR) model with a discrete Gamma distribution was used. In conclusion, rhizobia with different chromosomal backgrounds may carry similar symbiosis genes, explaining how the same legume host is nodulated by several different rhizobium species. However, it is possible that the transfer of symbiosis genes is limited to certain donorrecipient species combinations, which would mean that certain core genome features are needed to support particular symbiovars (Laranjo et al., 2012). ACKNOWLEGEMENTS This work was supported by project (PTDC/BIA/EVF/4158/2012) from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). This work is funded by FEDER Funds through the Operational Programme for Competitiveness Factors - COMPETE and National Funds through FCT under the Strategic Project PEstC /AGR/UI0115/2011. M. Laranjo acknowledges a Post-Doc fellowship (SFRH/BPD/27008/2006) from FCT. REFERENCES Alexandre, A., et al. (2008). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 2839-2849. Ghosh, W., and Roy, P. (2006). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 91-97. Kaneko, T., et al. (2000). DNA Res. 7: 331-338. Laguerre, G., et al. (2001). Microbiology 147: 981-993. Laranjo, M., et al. (2008). FEMS Microbiol. Ecol. 66: 391-400. Laranjo, M., et al. (2012). Syst. Appl. Microbiol. 35: 359-367. Nandasena, K.G., et al. (2007). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 1041-1045. Rogel, M.A., et al. (2011). Syst. Appl. Microbiol. 34: 96-104. Sprent, J.I., (2009). Legume Nodulation: A Global Perspective. Oxford, UK: Wiley-Blackwell. Wang, E.T. et al. (1999). Int. J. Syst. Bacteriol. 49: 51-65. Wojciechowski, M.F., et al. (2004). Am. J. Bot. 91, 1846-1862. Zhang, X. X. et al. (2000). Appl. Environ. Microbiol. 66: 2988-2995. 14 Session I SI-CO-1 Diversidad de hongos micorrizógenos arbusculares bajo situaciones contrastantes de fertilización fosfatada. García, S., Rodríguez Blanco, A*, Pezzani, F. Facultad de Agronomía. Universidad de la República. Av. Garzón 780. Montevideo. Uruguay. * [email protected] RESUMEN Los pastizales de Uruguay presentan bajos niveles de P por lo que son frecuentes los mejoramientos extensivos que implican fertilización fosfatada. Este trabajo tiene como objetivo determinar el efecto de la fertilización fosfatada sobre la diversidad de hongos micorrizógenos arbusculares (HMA) asociados a dos especies de gramíneas de los pastizales de Uruguay. El trabajo se basa en un ensayo con dos niveles de fertilización a largo plazo y parcelas de pastizal natural (PN) sin fertilizar. En base a resultados de composición florística y colonización micorrícica se seleccionaron las especies nativas Paspalum dilatatum y Coelorhachis selloana para el estudio de diversidad de las comunidades de HMA utilizando la técnica Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). Se presentan resultados correspondientes al primer muestreo (invierno). Se detectaron diferencias significativas en los índices de riqueza y de diversidad entre los niveles de fertilización fosfatada en las comunidades de HMA asociadas a C. selloana. El análisis de cluster demostró una similitud entre todas las comunidades mayor al 55% y formó 2 grupos: uno incluyó las comunidades asociadas a P. dilatatum fertilizadas y sin fertilizar y a C. selloana sin fertilización, mientras que en el otro cluster se separaron las comunidades asociadas a C. selloana con fertilización fosfatada. Estos resultados evidenciarían que los efectos de la fertilización sobre la diversidad de HMA que colonizan las plantas serían dependientes de la especie vegetal. INTRODUCCIÓN Uno de los beneficios más importantes que recibe la planta por los hongos micorrizógenos arbusculares (HMA) es que estos aumentan la absorción de nutrientes, principalmente P que se encuentra poco disponible para las plantas (Smith and Read, 2008). Los pastizales de Uruguay presentan bajos niveles de P por lo que son frecuentes los “mejoramientos extensivos” de los pastizales que implican fertilización fosfatada (Hernández et al., 1995). Según un relevamiento florístico realizado en nuestro sitio de estudio, luego de 10 años de aplicada la fertilización con P, la especie Paspalum dilatatum no modificó su frecuencia relativa en la comunidad en relación al incremento de P, mientras que Coelorhachis selloana disminuyó su frecuencia relativa, viéndose aumentadas las frecuencias de especies invasoras como Cynodon dactylon y Lolium multiflorum (Pezzani et al., 2012) De acuerdo a la bibliografía, la fertilización fosfatada puede tener efectos negativos sobre la colonización micorrícica arbuscular (Covacevich et al., 1995; Aguilar et al., 2004). Para evaluar esto, durante los años 2011 y 2012, se realizaron muestreos estacionales de varias especies de plantas y suelos. Los resultados de colonización radicular por HMA muestran diferencias entre las especies nativas e invasoras. P. dilatatum presentó altos porcentajes de colonización por HMA en todos los tratamientos, aunque los mayores valores fueron observados en el PN y los menores en parcelas con fertilización alta. C. selloana presentó porcentajes menores de colonización por HMA en tratamientos con altos niveles de fertilización con P. El potencial micorrícico (esporas en el suelo) fue afectado negativamente por la fertilización fosfatada (Pezzani et al., 2012). Conocer la diversidad de los HMA en los pastizales, sería un aporte complementario al conocimiento sobre estas interacciones ya que no existen antecedentes sobre este tema en Uruguay. 15 Session I SI-CO-1 El objetivo de este trabajo es determinar el efecto de la fertilización fosfatada sobre la diversidad de hongos micorrizógenos arbusculares (HMA) asociados a dos especies de gramíneas nativas de los pastizales de Uruguay. MATERIAL Y MÉTODOS El trabajo se basa en un ensayo instalado en el año 1996 que consiste en dos niveles de fertilización (media: 30 kg ha -1 de P2O5 anuales y alta: 60 kg ha-1 de P2O5 anuales) y parcelas de pastizal natural (PN) sin fertilizar. Los tratamientos se realizaron en bloques al azar de 2 ha cada uno. Para el estudio de la diversidad de HMA que colonizan las plantas se seleccionaron las especies nativas P. dilatatum y C. selloana. Se realizaron dos muestreos de plantas (invierno y verano). Se extrajeron plantas de ambas especies de cada parcela, se formaron muestras compuestas de raíces y se extrajo el ADN. Para evaluar la diversidad se utilizó la técnica Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP) siguiendo la metodología descripta por Mummey and Rillig (2006). Se utilizaron los primers FLR3-FAM y FLR4, específicos para Glomeromycotas, y la enzima de restricción MboI. Los análisis multivariados se realizaron utilizando el programa PAST y se consideraron los picos cuya abundancia relativa fue >1%. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se presentan resultados correspondientes al primer muestreo. El número de TRFs (biotipos) en las comunidades de HMA varió entre 11 y 19. Las plantas presentaron 7 TRFs (biotipos) en común, mientras que otros TRFs fueron característicos de algunos tratamientos. En las comunidades de HMA asociadas a C. selloana se detectaron diferencias significativas entre los niveles de fertilización fosfatada tanto en el índice de riqueza como en los índices de diversidad, mientras que estas diferencias no se observaron en las comunidades asociadas a P. dilatatum. El análisis de cluster demostró una similitud entre todas las comunidades mayor al 55% y formó 2 grupos. Uno de los clusters incluyó las comunidades asociadas a plantas de P. dilatatum fertilizadas y sin fertilizar y a plantas de C. selloana sin fertilización, mientras que en el otro cluster se separaron las comunidades asociadas a C. selloana con fertilización fosfatada. Estos resultados estarían demostrando que la fertilización fosfatada en las plantas de C. selloana provocó un cambio en la estructura de las comunidades de HMA que las colonizan, mientras que ese cambio no se observó en P. dilatatum. Para profundizar y confirmar estos resultados se está analizando el segundo muestreo (verano). BIBLIOGRAFÍA Aguilar, C., et al. (2004). In: Memorias de la XX Reunión del grupo Técnico Regional del Cono Sur en el Mejoramiento y Utilización de los Recursos Forrajeros del Area Subtropical y Tropical-Grupo Campos. Salto, Uruguay. Pp. 281-282. Covacevich, F., et al. (1995). Ciencia del Suelo. 13: 47-51. Hernández, J., et al. (1995). Boletín de Investigaciones N°43. Facultad de Agronomía. Montevideo. Mummey, D.L., and Rillig, M.C. (2006). Plant Soil 288: 81-90. Pezzani F., et al. (2012). Resumen de la presentación oral en el VII Symposium Nacional y IV Reuni ón Iberoamericana de la Simbiosis Micorrízica. 27-30 mayo 2012. Xalapa. México. p. 115. Smith, S.E., Read, D.J (2008). Arbuscular Mycorrhizal. En: Mycorrhizal Simbiosis. Elsevier. 11-145 . 16 Session I SI-CO-2 Prospecting metal resistant plant-growth promoting rhizobacteria for rhizoremediation of metal contaminated estuaries using Spartina densiflora. Andrades-Moreno, L.1, del Castillo, I.2, Redondo-Gómez, S.1, Mesa, J., Caviedes, M.A.2, Pajuelo, E.2, Rodríguez-Llorente, I.D.2* 1 Departamento de Biología Vegetal y Ecología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. Sevilla , Spain. 2 Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, c/ Profesor García González 2, 41012 Sevilla, Spain. * [email protected] ABSTRACT The total bacterial population in the rhizosphere of Spartina densiflora grown on the Tinto and Piedras river estuaries, with different levels of metal contamination, was analyzed by PCR-DGGE. 22 different cultivable bacterial strains were isolated from the rhizosphere of S. densiflora grown on the Tinto river estuary. 70% of the strains showed one or more PGP properties and high resistance to Cu. A bacterial consortium with PGP properties and high multiresistance to heavy metals was selected for further experiments. This consortium has probed to increase seed germination and to protect for fungus contamination. INTRODUCTION In the salt marshes of the joint estuary of Tinto and Odiel rivers (SW Spain), one of the most polluted areas by heavy metals in the world, S. densiflora grows over sediments with high concentrations of heavy metals (Sáinz et al., 2004). Cambrollé et al. (2008) found that heavy metals accumulated at different rates in S. densiflora tissues and around its roots, concluding that these species could be used for phytoremediaton (either phytoextraction or phytostabilization) of estuarine sediments. Although the importance of the rhizosphere community for plant development in contaminated soils has been recognized, nothing is known about the bacterial population that colonizes the root of S. densiflora grown in contaminated soils. MATERIAL AND METHODS PCR-DGGE analysis. PCR-DGGE analysis was performed as described in del Castillo et al. (2012). Bacterial isolation, identification and PGP properties. Isolation, identification and evaluation of PGP properties of the isolated bacteria were done as described in Andrades-Moreno (2012). RESULTS AND DISCUSSION PCR-DGGE analysis. The biodiversity of bacteria present both in the rhizosphere of S. densiflora (rhizosediment) and in naked soil (sediment) in two estuaries was analysed by DGGE (Figure 1A). Results indicated that the highest similarity corresponded to samples coming from the estuary of the Tinto river, suggesting that soil contamination influences bacterial population in a higher extent than the presence of the plant (Figure 1B). 17 Session I SI-CO-2 Figure 1. PCR-DGGE analysis. (A) Analysis of bacterial populations present in the sediments (S) an d the rhizosediments (Rs) of S. densiflora grown in the estuaries of the Tinto (T) and Piedras (P) river s. (B) Dendrogram showing the similarity between the DGGE profiles corresponding to the four samples base d on the Dice coefficient. Bacterial identification and PGP properties. 22 different cultivable bacterial strains were isolated from the rhizosphere of Spartina densiflora grown on the Tinto river estuary. 16S rDNA was partially sequenced to determine species affiliation. Copper resistance was determined, ranging from 1 to 13 mM. 7 strains were able to fix nitrogen, 10 strains produced siderophores, 10 strains were able to solubilize phosphate and only one strain produced auxins. Based on these characteristics a bacterial consortium comprising 3 strains were selected (Table 1). Table 1. Resistance towards Cu and plant-growth promotion properties of the bacterial consortium selected from the isolated stains. Strain Pseudomonas composti SDT3 Aeromonas aquariorum SDT13 Bacillus thuringiensis SDT14 Cu (mM) 13 7 5 PGP properties Siderophores and phosphate solubilization Siderophores, phosphate and auxins Siderophores, nitrogen fixation, antifungal Increased seed germination induced by the bacterial consortium. Seeds of S. densiflora were germinated in presence or absence of the bacterial consortium. After two weeks, seed germination was observed. Percentage of germination was higher in seeds inoculated with the bacterial consortium, 62% vs 32%. In addition, fungal contamination appeared in 72% of the seeds germinated in absence of the bacteria, while 40% of the inoculated seeds showed fungal contamination. ACKNOWLEGMENTS This work was supported by project RNM07274 of the Junta de Andalucía. J. Mesa was recipient of a FPU grant by the Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. REFERENCES Andrades-Moreno, L. (2012). Ph. D. Thesis, Universidad de Sevilla. Cambrollé, J., et al. (2008). Mar. Pollut. Bull. 56: 2037-2042. del Castillo, I., et al. (2012). Water Res. 46: 1723-1734. Sáinz, X., et al. (2004). Environ. Int. 30: 556-557. 18 Session I SI-CO-3 Symbiovar loti-type genes are widely spread across different chromosomal backgrounds, corresponding to up to nine Mesorhizobium genospecies nodulating Cicer canariense. Pérez-Yépez, J.1, Armas-Capote, N.1, Martínez-Hidalgo, P.2, Velázquez, E.2, PérezGaldona, R.1, Mar tínez-Molina, E.2, León-Barrios, M.1* 1 Departamento de Microbiología y Biología Celular. Universidad de La Laguna. Tenerife. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca. * [email protected] 2 ABSTRACT The phylogeny based on nodulation genes showed that the rhizobia nodulating Cicer canariense harboured sequences belonging to three different symbiotic lineages. Most isolates showed sequences closely related to symbiovar (sv.) loti which were widely distributed among up to nine Mesorhizobium genospecies. Another two smaller groups of isolates belonged to symbiotypes more restricted to particular species. Differences in N2-fixation capability were noted between strains from different symbiotypes. INTRODUCTION Cicer canariense is a wild chickpea endemic to the Canary Islands. The rhizobia nodulating this legume are found to be highly diverse, belonging or closely related to Mesorhizobium ciceri (the typical symbiont of the domesticated C. arietinum), M. caraganae, M. opportunistum, M. australicum, M. shangrilense, M. amorphae and the M. metallidurans/M. tianshanense/M. tarimense/M. gobiense cluster. The nodC phylogeny has been shown to correlate with the legume host range. Thus, in this work we have sequenced the nodC genes from representative strains of nine mesorhizobium genospecies to build a phylogeny which reflects the symbiovars of the C. canariense symbionts. MATERIAL AND METHODS Sequencing of nodC genes. The nodC genes using the pair of primers nodCF/nodCI as described (Laguerre et al., 2001) or the pair nodCMesoF and nodCMesoR as described (Rivas et al., 2007). The PCR-amplified products were purified (Qiaquick extraction kit, Qiagen) and sequenced in an ABI3730XL (Macrogen, Inc.) or alternatively in a Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems; Servicio de Genómica, Universidad de La Laguna). Phylogenetic analyses. Sequence alignments (ClustalW) and phylogenetic analyses were conducted using the MEGA 5.0 software package (Tamura et al., 2011). The phylogenetic trees were inferred by the Neighbour-joining method (NJ) using Kimura’s 2-parameter model. Confidence levels of the tree branches were estimated with 1000 bootstrap replications. The sequences of rrs genes were compared with those of bacterial type-strains using the EzTaxon-e server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012). Infectivity tests. Sterilized and germinated seeds were inoculated with a high cell density suspension of the corresponding bacteria grown on YEM broth. Inoculated seedlings were grown in vermiculite containing a N-free nutrient solution. Non-inoculated plants were used as negative controls. Nitrogen fixation capacity was deduced from plants and nodules appearance. 19 Session I SI-CO-3 RESULTS AND DISCUSSION The phylogeny based on nodC gene sequences resolved the mesorhizobia nodulating C. canariense into three symbiotic lineages: two symbiotypes correlating with symbiovars ciceri and loti, while the third symbiotype has not been previously described. Surprisingly, most isolates carried nodC sequences highly related (95%) to reference strains from the symbiovar loti, as M. loti NZP 2213T type strain and MAFF303099. The simbiovar loti-type sequences were the most widely distributed among the isolates, since they were detected in nine chromosomal backgrounds of different Mesorhizobium species. A small number of isolates had nodC and nodA sequences identical to those of symbiovar ciceri (such as M. ciceri UPM-CaT type strain) and were only detected in isolates with an M. ciceri-chromosome. Another group of M. caraganae and M. opportunistum isolates presented sequences divergent from other previous known nodC gene sequences. This could be a specific symbiovar for C. canariense, whose closest relatives were a congruent clade of seven Mesorhizobium species (type strains of M. tianshanense, M. gobiense, M. caraganae, M. temperatum, M. septentrionale, M. shangrilense and M. tamadayense) which shared the highest similarities in the range of 84.6-87.0%. These results indicated that C. canariense is a promiscuous legume that can be nodulated by several genomic species and symbiotypes, which make it necessary to determine the combination of core and symbiotic genes producing the most effective symbiosis. Our preliminary results indicate that the isolates with symbiovar loti-type genes produced well developed plants. ACKNOWLEDGEMENTS Supported by Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Organismo Autónomo de Parques Nacionales (Ref. 111/2010). REFERENCES Jarabo-Lorenzo A., et al. (2000). Syst. Appl. Microbiol. 23: 418-425. Laguerre, et al. (2001). Microbiolgy 147: 981-993. Lorite, M.J., et al. (2010). Syst. Appl. Microbiol. 33: 282-290. Rivas, R., et al. (2007). Lett. Appl. Microbiol. 44: 412-418. Tamura, K., et al. (2011). Meth. Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739. 20 Session I SI-CO-4 Molecular phylogeny and phenotypic characterization of salt tolerant Sinorhizobia nodulating Phaseolus filiformis in Northern Mexico. Rocha, G.1, Medina, A.1, Carreño, R.1, Bustillos, R.1, Contreras, J.L.2, Villegas, M.C.3, Chaintreuil, C.4, Dreyfus, B.4, Le Queré, A.5, Munive, J.A.1* 1 Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Mexico. 2 Facultad de Arquitectura, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Mexico. 3 Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, Mexico. 4 Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes, Unité Mi xte de Recherche (113) CIRAD, IRD, Université Montpellier 2, SupAgro, USC INRA, France. 5 Laboratoire de Microbiologie et Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Mohammed V-Agdal, Rabat , Morocco. * [email protected]; [email protected] ABSTRACT The aim of the present work was to establish the phylogenetic relationships of a collection of salt tolerant sinorhizobia, nodulating P. filiformis in northern Mexico, by Multilocus Sequence Analysis (MLSA). This collection was phenotypically and genetically characterized. P.filiformis is nodulated by two groups of sinorhizobia, one of them related to S. meliloti, and the other one related to a new Sinorhizobium species, closely related to S. saheli. It was apparent that there is no strict correlation between the chromosomal genotype of a strain and its salt tolerance. INTRODUCTION The genus Phaseolus comprises around 50 species, all indigenous to the Americas. Among this, P. lunatus, P. vulgaris, P. polyanthus, P. coccineus and P. acitifolius were domesticated by prehispanic civilizations and are widely used for human consumption. Beans, like other legume plants, can establish symbiotic relationships with nitrogen fixing soil bacteria called rhizobia. These bacteria invade root tissues and induce the formation of specialized structures known as nodules, where they fix atmospheric nitrogen. Between a diversity of bean nodulating bacteria, Rhizobium etli is the predominant species in Mexico; although some other rhizobia species have been described as symbionts of Phaseolus vulgaris where bean cultures have been introduced. The number of rhizobia species capable of nodulating bean shows that this legume is a promiscuous host, with a high diversity of interactions RhizobiumPhaseolus. MATERIAL AND METHODS A number of rhizobia strains were isolated from Phaseolus filiformis, a wild bean native to the southwestern United States and northern Mexico. Its common names include slimjim bean, slender-stem bean, and Wright's phaseolus. Strains were identified by 16SrDNA sequence analysis using primers designed by Normand et al. (1991) and Sy et al. (2001). MLSA was performed by sequence analysis of housekeeping genes: recA (modified from Gaunt et al., 2001), dnaK (Stepkowsky et al., 2003), gyrB and rpoB (Martens et al., 2008), atpD and glnII (Vinuesa et al., 2005). Salt tolerance was determined using 8.5 x 10 -4, 0.4, 0.6, 0.8 and 1M of NaCl in YMA medium, and at greenhouse level. This collection was also phenotypically and genetically characterized by carbon source utilization analysis and by restriction patterns produced by ARDRA (using four endonucleases AluI, CfoI, HinfI and NheI) and REP-PCR (Versalovic et al., 1991), using the software FreeTree. 21 Session I SI-CO-4 RESULTS AND DISCUSSION Strains were identified as belonging to genus Sinorhizobium, varying in their tolerance to salt-stress. Seven strains were intolerant to 0.4M NaCl, and only two sinorhizobia strains were tolerant to high levels of salinity (1M); indicating that salt-tolerance is not related to their ecological origin. Greenhouse test showed the salt-tolerance induced in plants inoculated with the most salt-tolerant sinorhizobia strain EMM451. Genotypic characterization showed 4 different genotypes. The phylogenetic relationships of sinorhizobia collection by MLSA, using 6 chromosomal loci, showed that species P. filiformis is nodulated by two groups of sinorhizobia, one of them related to S. meliloti (S. meliloti EMM456), and the other one related to a new Sinorhizobium species, closely related to S. saheli (Figure 1). There is no strict correlation between the chromosomal genotype and the salt tolerance. Salt-tolerance determinants must reside on extrachromosomal elements that may be subject to lateral transfer and recombination. 100 100 S. meliloti S. meliloti EMM456 (P. filiformis) 78 100 S. arboris 100 51 100 60 100 100 100 88 100 87 S. kostiense S. saheli 27 99 S. medicae 100 34 S. meliloti Sinorhizobium sp. (Phaseolus filiformis) S. terangae S. fredii/S. xinjiangense S. adhaerens Rhizobium spp. 47 M loti MAFF303099 0.02 Figure 1. Maximum likelihood species tree inferred from the concatenated alignment recA-dnaK-gyrBr poB-atpD genes, showing the phylogenetic relationships of Sinorhizobium sp. (P. filiormis) strains and Sinorhizobium species. The bar represents the number of expected substitutions per site. Bootstrap values calculated for 1,000 replications are indicated. ACKNOWLEGMENTS This work was granted by ECOS-NORD M08-A02. REFERENCES Gaunt, M., et al. (2001). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 2037-2048. Normand, P., et al. (1991). Int. J. System. Bacteriol. 46: 1-9. Martens, M., et al. (2008). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 200-214. Martens, M., et al. (2007). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 489-503. Stepkowski, T., et al. (2003). Syst. Appl. Microbiol. 26: 483-494. Silva C., et al. (1999). Mol. Ecol. 8: 277-287. Sy A., et al. (2001). J. Bacteriol. 183: 214-220. Versalovic, J., et al. (1991). Nucl. Acids Res. 24: 6823-6831. Vinuesa, P., et al. (2005). Mol. Phyl. Evol. 34: 29-54. 22 Session I SI-CP-01 Phylogenetic diversity of bradyrhizobia nodulating cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) in Extremadura (Spain). Bejarano, A.1*, Ramírez-Bahena, M.H.1, 2, Velázquez, E.2, 3, Peix, A.1, 2 1 Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología, IRNASA-CSIC, Salamanca, Spain. 2 Unidad Asociada Grupo Interacción Planta-Microorganismo USAL-IRNASA-CSIC. 3 Departamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca (USAL), Spain. * [email protected] ABSTRACT Vigna unguiculata, a grain legume worldwide cultivated but poorly cropped in Spain, is a good alternative over other legumes to be included into the mediterranean diet and has a great agronomic interest by its resistance to soil acidity, drought and high temperatures. Cowpea establishes symbiosis mainly with Bradyrhizobium in most of regions, and this rhizobia-legume interaction has been studied in Asia, Africa and America. However up to date there are no data about rhizobia nodulating V. unguiculata in Europe. In this work we analysed the phylogenetic diversity of slow-growing rhizobia isolated from nodules of this legume in Extremadura through the analysis of their 16S rRNA genes and 16S-23S intergenic regions. The results showed that unlike in other continents, V. unguiculata is mainly nodulated in Spain by B. cytisi and B. canariense and by several new phylogenetic lineages within genus Bradyrhizobium. INTRODUCTION Vigna unguiculata (cowpea) is cultivated in concrete regions in Spain where the main production is located in Extremadura region. Cowpea contains high proportions of protein (20-30%), and dietary fiber (20-35%) being of great interest in human and animal nutrition (Fontenele-Urano-Carvalho et al., 2005). Therefore it is a good alternative to be included into the mediterranean diet whose beneficial effects in human health has been widely proven (Sofi et al., 2010). Moreover, this legume is agronomically very interesting since it is very resistant to soil acidity, drought and high temperatures as well as for its ability to establish nitrogen fixing symbiosis with rhizobia mostly belonging to genus Bradyrhizobium. The endosymbionts of Vigna unguiculata have been studied in Africa, Asia and America, but no data about those present in European soils are available. Therefore the main objective of this study was to analyse the phylogenetic diversity of bradyrhizobia nodulating Vigna unguiculata in a soil from Extremadura in which this legume is cultivated and to compare the Spanish cowpea nodulating strains with those isolated from other continents. MATERIAL AND METHODS Vigna unguiculata plants were used as trap plant in an acidic soil from Extremadura and the isolation of rhizobia was performed following the method of Vincent (1970) on YMA plates. RAPD patterns were obtained as was previously described using the primer M13 (Rivas et al., 2006). The mathematical analysis of the patterns was performed using BioNumerics™ software (Applied Maths, Belgium). Amplification and analysis of the 16S rRNA gene and ITS region was performed as previously described (Velázquez et al., 2010). 23 Session I SI-CP-01 RESULTS AND DISCUSSION About fifty slow-growing strains of Bradyrhizobium were isolated from Vigna unguiculata nodules which were grouped by using RAPD fingerprinting. After the mathematical analysis of the obtained patterns a representative strain from groups with similarity values lower than 80% among them was selected for 16S rRNA gene and ITS analyses. These analyses allowed the identification of several Bradyrhizobium species in V. unguiculata nodules as well as the detection of some putative novel species within this genus. The identified species were B. canariense and B. cytisi, which are reported here by the first time in V. unguiculata nodules. Some strains cluster within strain B. japonicum BGA-1, of uncertain taxonomic status since the strains from this group are divergent to that formed by the type strain of B. japonicum USDA 6T. Some other strains formed independent branches in both 16S and ITS phylogenetic trees and then they could constitute new species within genus Bradyrhizobium. A comparison with the strains nodulating Vigna in other continents showed that our Spanish strains belong to different groups than those isolated in other countries with the exception of B. canariense from which a single strain isolated in Japan has been found in nodules of V. unguiculata. Considering that V. unguiculata from tribe Phaseolae is indigenous of South Africa Transvaal region (Paludosi and Ng, 1997), these results suggest an adaptation of this legume to be nodulated by Bradyrhizobium species nodulating Genisteae species in mainland Spain (Velázquez et al., 2010). ACKNOWLEDGMENTS MHRB is recipient of a JAE-Doc researcher contract from CSIC cofinanced by ERDF. REFERENCES Fontenele-Urano-Carvalho, A. et al. (2012). J. Food Compos. Anal. 26: 81-88. Paludosi, S., and Ng, N.Q. (1997). Advances in Cowpea Research. Pp. 1-12. Edited by B.B. Singh, D. R. Mohan Raj, and K.E. Dashiell, L.E.N. Jackai. Nigeria: Copublication of International Insitute of Troplical Agriculture (IITA) and Japan International Research Center of Agricultural Siences (JIRCAS). Rivas, R., et al. (2006). Plant Soil 287: 23-33. Sofi, F., et al. (2010). Am. J. Clin. Nutr. 92: 1189-1196. Velázquez, E., et al. (2010). Antonie Van Leeuwenhoek. 97: 363-376. Vincent J.M. (1970). A Manual for the Practical Study of Root-Nodule. pp. 1-13. Edited by J.M. Vin cent. Blackwell Scientific Publications, Oxford (United Kingdom). 24 Session I SI-CP-02 MALDI-TOFF MS, a tool for diversity analysis and detection of novel rhizobial species nodulating Phaseolus vulgaris. Flores-Félix, J.D.1*, García-Fraile, P.1, Sánchez-Juanes, F.2, 3, 4, Ramírez-Bahena, M.H.5, 6, Ferreira, L.2, 3, 4, Mula, D.7, Rivas, R.1, 6, González-Andrés, F.7, Peix, A.5, 6, González-Buitrago, J.M.2, 3, 4, Velázquez, E.1, 6 1 Departamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca (USAL), Spain. 2 Unidad de Investigación. Hospital Universitario de Salamanca, Spain. 3 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Salamanca (USAL), Spain. 4 Instituto de Investigación Biomédica. Salaman ca, Spain. 5 IRNASA-CSIC, Salamanca, Spain. 6 Unidad Asociada Grupo Interacción Planta-Microorganismo USAL-IRNASA-CSIC. 7Instituto de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad de León, Spain. * [email protected] ABSTRACT In this work we analysed by MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry) a collection of endosymbionts from P. vulgaris which is nodulated by different genera and species of rhizobia. These endosymbionts were isolated in different regions from the Northwest to the Southest of Spain. The results of MALDI-TOF MS analysis showed that they belonged to Rhizobium and Ensifer but despite a 53% of strains were correctly identified, the remaining 47% of strains was not identified with any of species present in the Rhizobiaceae database. This is a frequent result when the isolates of legume nodules are analysed and grouping techniques are necessary to finish the identification schemes. After the mathematical analysis of spectra from P. vulgaris isolates the dendrogram obtained showed that the unidentified strains presented similarity values lower than 70% with respect to the groups containing the identified ones. The strains belonging to the same species presented similarity internal values higher to 70% allowing the selection of strains for housekeeping gene analysis. The combination of MALDI-TOF MS analysis and gene sequencing allowed the detection of several new species in Phaseolus vulgaris nodules in Spain. INTRODUCTION Phaseolus vulgaris, indigenous of America, is currently the most cultivated legume worldwide after soybean and establishes nitrogen-fixing symbiosis with several fast growing species of genera Rhizobium and Ensifer (Velázquez et al., 2010). Therefore the P. vulgaris-rhizobia symbiosis is a good model to evaluate the reliability of MALDI-TOF MS for the identification of rhizobia at species level as well as for the grouping of unidentified strains in order to select them for identification by gene analyses. MALDI-TOF MS is a technique based on protein analysis that has been recently proposed for differentiation of genera and species from family Rhizobiaceae (Ferreira et al., 2011). It has been previously proven that this technique is useful for identification of legume nodules isolates belonging to already described species, nevertheless frequently nodule isolates that do not belong to described species are isolated. The aim of this work was to analyze the suitability of spectra analysis to group the unidentified rhizobial strains isolated from P. vulgaris at species level in order to select strains for housekeeping gene analysis. MATERIAL AND METHODS The isolates from P. vulgaris nodules growing in different Spanish locations were obtained using the methodology described by Vincent (1970) on YMA plates. For 25 Session I SI-CP-02 MALDI-TOF MS analysis and for DNA isolation the strains were incubated on TY plates (Beringer, 1974) during 24h. The samples preparation, the performing of MALDI-TOF MS analysis and that of recA and atpD genes were performed as was previously described (Ferrerira et al., 2011). RESULTS AND DISCUSSION After comparison of spectra obtained for P. vulgaris isolates with those present in the family Rhizobiaceae database previously build in our laboratory (Ferreira et al., 2011) about 53% of strains were identified as already described species of Rhizobium, such as R. leguminosarum and R. giardinii, and Ensifer, such as E. fredii. The remaining strains although were closely related to other species of these two genera, the score values were lower than 2.0 indicating that they belong to undescribed species. The mathematical analysis of the spectra showed that the identified strains clustered with the type strains of the species in which were placed after MALDI-TOF MS analysis forming groups with internal similarities higher than 70%. The unidentified strains occupied branches or clusters with similarity values lower than 70% with respect to the described species of genera Rhizobium and Ensifer. The analysis of recA and atpD genes showed that the unidentified strains by MALDITOF MS belonged t o groups phylogenetically divergent to those from the already described species from family Rhizobiaceae. These strains were phylogenetically related to R. leguminosarum, R. vallis, R. tibeticum, R. mongolense and Ensifer fredii. Interesting, in León in soils commonly cultivated with P. vulgaris the predominant species was R. leguminosarum. In Barco de Ávila, although this legume is commonly cultivated and R. leguminosarum also was abundant, R. giardinii was frequently found. In Salamanca, in a soil commonly cultivated with Lens culinaris but where P. vulgaris is not cultivated, a new species related to R. leguminosarum was found. In Badajoz in a soil not cultivated with P. vulagris, R. giardinii was found. Finally, in Sevilla, in a soil not cultivated with P. vulgaris, we found two undescribed species related to R. mongolense and E. fredii. ACKNOWLEDGMENTS This work was funded and supported by Junta de Castilla y León project SA183A11-2. MHRB is recipient of a JAE-Doc researcher contract from CSIC, cofinanced by ERDF. REFERENCES Beringer, J.E. (1974). J. Gen. Microbiol. 84: 188-198. Ferreira, et al. (2011). PLoS One. 6: e20223. Velázquez, E., et al. (2010). Microbes for Legume Improvement. Khan, M.S., Zaidi, A., and Musarrat , J. (eds). Dordrecht, The Netherlands: Springer. pp. 1-25. Vincent J.M. (1970). A Manual for the Practical Study of Root-Nodule. pp. 1-13. Edited by J.M. Vin cent. Oxford : Blackwell Scientific Publications. 26 Session I SI-CP-03 Análisis de la biodiversidad de microorganismos en nódulos de Lotus corniculatus. Marcos-García, M.1, Menéndez, E.1, Celador-Lera, L.1, Rivera, L.P.1, Martínez- Molina, E.1, 2, Mateos, P.F.1, 2, Velázquez, E.1, 2, Rivas, R.1, 2* 1 Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca. Universidad de Salamanca (USAL)-CSIC (IRNASA). * [email protected] 2 Unidad Asociada de I+D RESUMEN Los nódulos de plantas de Lotus corniculatus procedentes de la localidad salmantina de Carbajosa de la Sagrada nos ha proporcionado una elevada biodiversidad de microorganismos, capaces de vivir en el interior de estos nichos seguros junto con el endosimbionte natural de esta planta, Mesorhizobium loti. Las cualidades fenotípicas que presentan varias de estas cepas, algunas de las cuales se encuentran dentro de los géneros Micromonospora y Lysinibacillus, las convierte en potenciales bacterias promotoras del crecimiento vegetal y susceptibles de ser utilizadas como coinoculantes. INTRODUCCIÓN La adaptabilidad a diferentes presiones ambientales que presentan las especies del género Lotus, las convierte en plantas muy importantes desde un punto de vista económico, ya que se utilizan como cultivos altamente productivos en sistemas de pastoreos en una amplia gama de paisajes, incluyendo algunos sometidos con frecuencia a ambientes y condiciones del suelo extremas. En concreto, la especie L. corniculatus se considera una de las leguminosas forrajeras más importantes después de la alfafa (Medicago sativa) y del trébol blanco (Trifolium repens), siendo su valor nutricional similar o incluso superior a la de especies como: L. uliginosus (Schkuhr.), L. tenuis (Waldst et kit.) y L. subbiflorus (Lagasca). Además, es una buena candidata para la restauración y la fitorremediación de ambientes degradados. Esta especie es, con toda probabilidad, la especie de Lotus más comúnmente empleada en restauraciones ecológicas de los suelos afectados por la deficiencia de nutrientes, la salinidad, la sequía o los contaminantes. Conocer la diversidad y la abundancia de los microorganismos que nodulan o que ocupan los nódulos en las especies de Lotus, es un enfoque valioso para una mejor selección y aplicación de las cepas como inoculantes. Estas cepas no sólo deben ser eficientes en la fijación del nitrógeno, como ocurre para las especies de los rhizobia, sino que también deben ser capaces de competir favorablemente con los microorganismos nativos de la planta y la rizosfera circundante. Los estudios realizados hasta la fecha sobre nódulos de L. corniculatus, se han centrado principalmente en las especies del género Mesorhizobium de forma aislada. Conocer la existencia de una mayor diversidad de especies en el interior de estos nichos ecológicos específicos y seguros en cuanto a la presencia de patógenos, abre un abanico de posibilidades en lo que se refiere a la búsqueda de nuevas bacterias promotoras del crecimiento vegetal en plantas no leguminosas. MATERIAL Y MÉTODOS Se obtuvieron 90 aislados que se agruparon utilizando técnicas moleculares como los TP-RAPD. Se secuenció el gen ribosómico 16S de diversos representantes, utilizando para ello los primers 27F y 1522R. El análisis de las secuencias se llevó a cabo con el programa BLASTn. Estas secuencias también se compararon con las cepas tipo utilizando el programa Eztaxon 2.0. Para el análisis filogenético se utilizaron los programas Clustal X y Mega 2.1. Para determinar la potencial capacidad de promoción 27 Session I SI-CP-03 del crecimiento vegetal de cada uno de los aislados se hicieron distintas pruebas de caracterización fenotípica. La solubilización de fosfato fue evaluada en medio YED-P de acuerdo con Peix et al. (2009). La producción de sideróforos se evaluó utilizando el medio de cultivo M9-CAS-AGAR, que es una modificación del medio utilizado por Schwyn y Neilands, donde se observan halos de distintas tonalidades. La determinación cualitativa de la producción de celulosa se llevó a cabo utilizando el medio de cultivo YMA convencional con 25mg/l de rojo congo. La detección de la actividad celulolítica, se determinó utilizando como sustrato carboximetil celulosa sódica, CMC (viscosidad media, Sigma), un compuesto soluble derivado de la celulosa, utilizado para la valoración de la actividad 1,4--glucanásica. La determinación de la formación de biofilms se llevó cabo según Fujishige et al. (2006) con algunas modificaciones. Se realizaron dos ensayos: en placas de microtitulación de poliestireno y en portaobjetos (vidrio). RESULTADOS Y DISCUSIÓN El análisis del gen ribosómico 16S nos mostró una amplia diversidad de especies, siendo las cepas mayoritarias las de la especie Mesorhizbium loti, el endosimbionte natural de L. corniculatus. Dentro del género Mesorhizobium también se aislaron tres especies más: M. australicum, M. amporhae y M. gobiense. Por otra parte, según los datos de secuenciación, aislamos especies no encontradas hasta ahora en nódulos de L. corniculatus y que pertenecen a los géneros: Micromonospora, Dermacoccus, Arthrobacter, Metylobacterium, Acinetobacter, Lysinibacillus y Paenibacillus. En este trabajo, aislamos un total de 90 cepas del interior de nódulos de Lotus corniculatus, obteniendo cepas con capacidad de solubilizar fosfato, promover la síntesis de indol acético, producir sideróforos y celulosa, tener actividad celulolítica y ser capaces de formar biofilms. Esta planta, por tanto, tiene una gran diversidad de microorganismos endofíticos asociados a ella, capaces de mantener una actividad altamente beneficiosa, influyendo de forma directa en el crecimiento de las plantas y sus funciones, no sólo en su actividad cómo planta forrajera sino también como fitorremediadora de suelos en condiciones insalubres. Podemos decir que el potencial que presenta L. corniculatus, hacen de ella una planta con nuevas y amplias posibilidades de estudio y por supuesto, el posible potencial de sus microorganismos endófitos como bacterias promotoras del crecimiento vegetal, nos plantea la posibilidad de aplicarlos a otras especies vegetales, incluidas las no leguminosas. AGRADECIMIENTOS Este trabajo está financiado por el proyecto SA183A11-2 de la Junta de Castilla y León y por el pr oyecto AGL2011-29227 del Ministerio de Ciencia e Innovación. Marta Marcos agradece a la Fundación Miguel Casado San José la financiación de su beca. BIBLIOGRAFÍA Fujishige, N.A., et al. (2006). Bot. J. Linnean Soc. 150: 79-88. Peix, A., et al. (2009). Syst. Appl. Microbiol. 32: 334-341. 28 Session I SI-CP-04 Where do PGPR interact with plants? An essential determination to develop effective agricultural inputs based on microorganisms. Mulas, R.1, Mulas, D.2*, Menéndez, E.3, Rivera, L.3, Mateos, P.3, González-Andrés, F.1 1 Instituto de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad de León, León, Spain. 2 Fertiberia S .A., Dpto de I+D+i, Huelva, Spain. 3 Universidad de Salamanca. Dpto de Microbiología y Genética, Salamanca, Spain. * [email protected] ABSTRACT Although PGPR are extensively used in agriculture, they are just becoming popular in Europe now, and this is because the strict regulations (Regulation EC 2003/2003 about fertilisers and Directive 91/414/EEC about plant protection products) and the lack of constancy in their effectiveness in some cases. Studying where they locate at a rhizospheric level can provide valuable information to design agricultural inputs based on microorganisms. This works shows how a phosphate-solubilizing Rhizobium sp strain attaches to barley roots by observing transformed cells (fluorescent) under confocal microscopy. The cells were observed on the root surface, and no endophytic evidence was found for this strain. However, several studies have shown presence of Rhizobium spp. as endophytes in cereal roots, such as rice or maize, indicating that the characteristics of the symbiosis depend on the strain and not on the taxon. INTRODUCTION Bacteria that improve plant nutritional status (PGPR) are gaining acceptance amongst farmers in Europe as an additional input, since a number of studies have shown the feasibility or their use with cereals, legumes, industrial and horticultural crops. However, little is known about the exact location of PGPR in the rhizosphere. Knowing if the bacterium act as an endophyte or stays in the rhizoplane is interesting because it can lead the strategy followed to develop products based on PGPR. Confocal microscopy was first successfully used to view Rhizobium cells in Lucerne by Gage et al. (1996), and since then it is a useful tool to determine the position of the cells in the root. This study aimed at determining the location of a PGPR (Rhizobium sp phosphatesolubilizer) w ith barley (Hordeum vulgare L.) in the rhizosphere, in order to design the best way of delivering the PGPR to this extensive winter crop. MATERIAL AND METHODS A Rhizobium strain belonging to the collection of the University of León, was transformed with the pHC60 plasmid (containing a GFP) harboured by Escherichia coli S17.1 (Simon et al., 1983) by means of biparental mating. The transformed strain was inoculated on barley plants, whose seeds had been previously surface-sterilized (ethanol 70% 1 min, NaClO 7% 7 min). First test: barley plantlets (48 h after seeding) were inoculated with 250 L of the bacterium culture (107 CFU mL-1). Ten days after inoculation (DAI), plant roots were observed by using confocal microscopy to determine the plant root colonization. Second test: barley plants were inoculated by immersion in the bacterium culture for 30 min. Ten DAI, plant roots were observed and the number of bacterial cells present within the roots was determined by the following procedure: surface-sterilized roots (ethanol 70% 1 min, NaClO 7% 5 min) were smashed and the root internal tissue was inoculated on YMA medium plates at the dilutions 10-1, 10-3 and 10-5. A control was used by placing sterile roots over YMA without smashing, which indicated the sterility of the root surface. 29 Session I SI-CP-04 Third test: barley plants were immersed (3 h) in a bacterium suspension in saline solution (108 CFU mL-1). The same observations were done as previously, but the sterilization was less aggressive (NaClO 5% 5 min) to avoid sterilization within the root tissue. With the endophytic isolates from the root that showed a colony growth similar to rhizobia, RAPD profiles were obtained using the PCR primer M-13 as described by Huey and Hall (1989). This method allowed discriminating amongst bacterial strains within the same species, thus indicating whether the isolates were the inoculated strain or not. RESULTS AND DISCUSSION The transformed Rhizobium sp was observed with confocal microscopy, showing an association with the plant roots, but it was not possible to determine whether it happened on the root surface or endophytically (Figure 1). Regarding to the root tissue, no colonies were found in the second test. However, the less aggressive sterilization of the third test, allowed bacterial growth from inside the root, although no external growth was detected. The M13-RAPD profiles indicated that the isolates were different from the inoculated Rhizobium sp, which hints the possibility for the seed to harbor other endophytic bacteria from the early stages, without evidence of endophytic rhizobia. Nonetheless, other studies have shown rhizobium-root endophytic association in nonlegume crops (i. e. Gutiérrez-Zamora and Martínez-Romero, 2001; Yanni et al., 2010; López-López et al., 2010). As a conclusion, the presence of the rhizobia inside the roots is strain-dependent and, therefore it is needed to determine the location of each bacterial strain in the rhizosphere. This information is crucial to design agricultural inputs (such as fertilizers, inoculants and other biostimulants) with efficient performance, and thus, improved nutritional status of the crops. Figure 1. Confocal microscopy images of the first (a), second (b) and third tests (c). Whereas the first test shows presence of bacteria, the second and the third tests show a higher number of bacteria in the barley root. ACKNOWLEDGEMENTS This work has been funded by Fertiberia S.A., Junta de Castilla y León (Research Projects) and the Spanish Ministry of Economy (INNPACTO project IPT-2011-1283-060000, co-funded by the EUFEDER). REFERENCES Gage, D.J., et al. (1996). J. Bacteriol. 178: 71597166. Gutiérrez-Zamora, M.L., and Martínez-Romero, E. (2001). J. Biotechnol. 91: 117-126. Huey, B., and Hall, J. (1989). J. Bacteriol. 171: 2528–2532. López-López, A., et al. (2010). Syst. Appl. Microbiol. 33: 322-327. O'Hara, G.W., et al. (1989). Appl. Environ. Microbiol. 1870-1876. Yanni, Y.G., et al. (2010). Plant Soil 336: 129-142. 30 Session I SI-CP-05 Biodiversity of endophytic bacteria and mycorrhizal fungi in roots of pepper (Capsicum annuum L.) in León province (Spain). Barquero, M.1, Velázquez, E.1, Terrón, A.2*, González-Andrés, F.2 1 Departamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca, Salamanca, Spain. 2 Instituto de Medio Ambiente y Recursos Naturales, Universidad de León, León, Spain. * [email protected] ABSTRACT Eigthy one endophytic PGPR strains and 9 AMF isolates were obtained from roots of pepper in the PGI “Fresno-Benavente”, and characterized to be used like biofertilisers. Bacteria were analysed in vitro regarding several plant growth promotion properties, in order to pre-select strains for in field selection. The identification of the bacteria is a key aspect as only safe taxa can be used. In our case an ARDRA test following TP-RAPD were carried out in order to group the strains prior to the sequentation of the gene 16S rRNA for identification. The AMF isolates belonged to the species Glomus mosseae. INTRODUCTION Second generation biofertilisers (Mulas et al. 2013) consist on mixes of different Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), which as a result of a complex mix of mechanisms have one or several of the following effects: improve plant nutrition, stimulates plant growth and overcome plant stresses (Dobbelaere et al., 2003, Singh et al., 2011). The use of biofertilisers in agriculture is an increasing practice, as they improve the efficiency in the use of the mineral nutrients from the soil, reducing nutrient losses an improving the crops yield for reduced rates of chemical fertilisers. By the other hand, rhizobacteria and AMF may play a role like microbial control agents and can be used for the replacement of chemicals according to the EC Regulation 1107/2009. One key point for the success of microorganisms like biofertilisers is the use of native isolates (Mulas et al., 2011, 2013). Castilla y León is a Spanish region with an outstanding agri-food sector. The pepper (Capsicum annuum L.) from Fresno and Benavente, is a product with high added value, labeled with a Protected Geographic Indication (PGI), and for this reason started a research project to develop biofertilisers. Here we present the results of the prospection of native microorganisms and the preliminary characterization of the biodiversity encountered, the first stage to develop an autochthonous biofertiliser. MATERIAL AND METHODS Endophitic bacteria were isolated from surface sterilized roots of pepper crops collected in the in 3 locations and 3 soils per location, inside the PGI region. Crushed roots were plated onto TSA medium and purified. Clones were discarded on the basis of the RAPD (primer M13) profiles. Pure strains were analysed for several activities in vitro: Ca3(PO3)2 solubilization; siderophore production; IAA production; ACC deaminase activity; control of Phitopthora capsicii. The identification of the isolates was based on the sequentiation of the gen 16S rRNA and comparison with the ezTaxon database (ezbiocloud.net). Previously to the sequentiation, isolates were grouped on the basis of and Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA). Each group typically consists on several taxa, so the TP-RAPD (Rivas et al., 2001) profiles within each ARDRA group were obtained in order to group the isolates by recognised taxa and to sequentiate only one strain from each group. AMF were isolated from the rhizosphere of the same plants, using leak (Allium porrum) as trap plant in sterile sand. After this first stage, from each soil 10 spores of the same morphology were used to inoculate a 31 Session I SI-CP-05 leak plant in order to produce inoculum. One spore per soil was used for DNA amplification with the primers of Lee et al. (2008), sequencing the obtained band and comparing it with databases with BLAST-N (Altschut et al., 1990). Figure 1. In vitro test for biocontrol of Phytophtora capsici by bacteria. RESULTS AND DISCUSSION Eighty one different PGPR’s strains were isolated from the locations of Fresno de la Vega, San Cristobal de Entreviñas and Micereces. None of the isolated strains was phosphate solubilizer. Regarding the IAA production, the values ranged from 1.25 µg/ml to 8.93 µg/ml. However only 12 strains from the 81 tested, produce more than 3.0 µg/ml, and half of the 81 produced less than 2.0 µg/ml. The production of IAA was medium-low, compared with the best producers isolated in tropical and subtropical areas. The production of -Ketobutirate showed a broad range from nearly 0 moles mg prot-1 h-1 up to 247, showing a continuous variation within this range. Compared to other works (i.e. Siddikee et al., 2010), the higher values observed in our collection are up to 100 time higher that the higher values of the mentioned work and the lower values are similar in both cases. About siderophores production, more than 50% of the isolates produced them. The isolates belonged to Bacillus pumilus, Bacillus amyloliquefaciens, Pesudomonas geniculata and other species were discarded like Bacillus cereus (human pathogen) and Pseudomonas corrugata (plant pathogen). Five out of the 81 strains controlled Phytophtora capsicii (Figure 1) four belonging to B. pumilus and the last to B. cereus which was discarded. All the AMF isolated belonged to Glomus mosseae (Nicol. and Gerd.) Gerd. and Trappe, in contrast to the isolates in tree crops in the same area, which usually belonged to Glomus Intraradices. The selection of the PGPR strains to be tested in microplots in field conditions was based on the level of expression of plant growth promotion properties in vitro, and in the taxonomic identification, as only safe taxa can be used for biofertilisers. AKNOWLEDGEMENTS This work has been funded by Junta de Castilla y León (Project LE029A10-2) and Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (AECID) (Project A1/035364/11). M. Barquero was granted by AECID. REFERENCES Altschul, S.F., et al. (1990). J. Mol. Biol. 215: 403-410. Lee, J., et al. (2008). FEMS Microbiol. Ecol. 65: 339-349. Mulas, D., et al. (2011). Soil Biol. Biochem. 43: 2283-2293. Mulas, D., et al. (2013). Beneficial plant-microbe interactions: Ecology and applications. CRC Pre ss. Rivas, R., et al. (2001). Electrophoresis 22: 1086-1089. Siddikee, M.A., et al. (2010). J. Microbiol. Biothechnol. 20: 1577-1584. Singh J.S., et al. (2011). Agr. Ecosyst. Environ. 140: 339-353. 32 Session I SI-CP-06 Diversidad de los rizobios que nodulan Medicago marina de regiones del Odiel y San Fernando. Alías-Villegas, C.1*, Bellogín, R.A.1, Camacho, M.2, Cubo, M.T.1, Temprano, F.2, Espuny, M.R.1 1 Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. Avda. Reina Mercedes 6, 41012-Sevilla. Spain. 2 Centro Las Torres-Tomejil (IFAPA), Apartado Oficial, Alcalá del Río, Sevil la. Spain. * [email protected] RESUMEN La diversidad de los rizobios que nodulan Medicago marina en las Marismas del Odiel y San Fernando, zonas con suelos sometidos a estrés abiótico por pH y salinidad, se ha estimado usando 14 aislamientos de plantas de San Fernando y 18 de las Marismas del Odiel. Tras eliminar redundancias de los perfiles PCR-ERIC se obtuvieron 12 aislamientos diferentes, 7 de las Marismas del Odiel y 5 de San Fernando. La secuenciación del gen ARNr 16s mostró que todas las cepas pertenecen al género Sinorhizobium, estando estrechamente relacionadas con S. meliloti LMG 6133T. Para estudiar si son distintas cepas de S. meliloti se han realizado RFLP del gen nod C y de la región ITS. Según el perfil RFLP de nod C, se han obtenido dos grupos diferenciados (I y II), con las enzimas MspI y RsaI, pero éstos no coinciden exactamente con las áreas geográficas donde se han recogido las muestras y no corrobora que todos los aislamientos sean S. meliloti, puesto que al digerir con MspI el perfil de S. meliloti coincide con el grupo II y al digerir con RsaI en perfil de S. meliloti coincide con el grupo I. Por otra parte, según el perfil RFLP de la región ITS, todos los aislamientos mostraron el mismo perfil que S. meliloti, con excepción del aislamiento ORT17 que mostró un perfil distinto con la enzima MspI. INTRODUCCIÓN La agricultura actual sufre la sobreexplotación de los recursos y el empleo masivo de fertilizantes, lo que hace preciso la recuperación de suelos que presentan algún tipo de estrés abiótico por pH o salinidad extremos que imposibilitan el cultivo. Así, se planteó la búsqueda de bacterias simbióticas fijadoras de nitrógeno atmosférico en ambientes con estos tipos de estrés, con el objetivo de introducir las parejas simbióticas rizobioleguminosa más adecuadas a los parámetros físico-químicos de los suelos a recuperar. Con este fin se ha iniciado el estudio de los simbiontes de M. marina aislada de dos zonas, las Marismas del Odiel (Huelva) y la zona dunar de San Fernando (Cádiz) Además, dada la relativa abundancia de esta leguminosa en las playas de San Fernando una vez determinados los mejores simbiontes, podría ser utilizada para la estabilización de sistemas dunares. MATERIAL Y MÉTODOS Para el aislamiento de bacterias, los extractos de los nódulos previamente desinfectados (hipoclorito de sodio al 5% durante 4 minutos) fueron sembrados sobre placas de YMA con Rojo Congo (25 mg/L). La PCR-ERIC se hizo utilizando los cebadores consenso ERIC 1R y ERIC 2, siguiendo el protocolo descrito por Versalovic et al. (1991). La amplificación del gen ARNr 16S se realizó con los cebadores 616F y 1522R. Los fragmentos del gen ARNr 16s amplificados fueron secuenciados por Stab-Vida (Portugal) usando los cebadores 519F, 907R, 616F y 1522R. La identificación de las secuencias se realizó empleando la base de datos EzTaxon-e. Para el análisis de datos, se realizaron alineamientos con el programa Clustal X (Thomson et al., 1997). Los 33 Session I SI-CP-06 análisis filogenéticos y de evolución molecular se hicieron usando el programa MEGA versión 4 (Tamura et al., 2007); con tres algoritmos diferentes para realizar el árbol, máximum-likelihood, (Felsenstein, 1981), maximum-parsimony (Kluge y Farris, 1969) y neighbour-joining (Saitou y Nei, 1987). El gen nod C se amplificó con los cebadores nodCF2 y nodCI (Laguerre et al., 2001) y el método de Laguerre et al. (1994). El producto de PCR se digirió independientemente con los enzimas MspI y RsaI. La región ITS se amplificó con FGPS1490 y FGPS132 (Laguerre et al., 1996) y según el método de Vinuesa et al. (1998). El producto de PCR se digirió independientemente con MspI y AluI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Del aislamiento de los nódulos de las plantas de M. marina se obtuvieron 32 clones que, tras el empleo de la PCR-ERIC, se agruparon en 12 perfiles distintos, 7 de las Marismas del Odiel y 5 de las Dunas de San Fernando. La secuencia del gen del ARNr 16S ha identificado todos los aislamientos como S. meliloti; la mayor parte de ellos con porcentajes de identidad que oscilan entre el 99,3 y 100%. Tan solo uno de los aislamientos de San Fernando (SF 1.2) muestra un porcentaje de identidad del 98%. Los árboles filogenéticos construidos muestran la relación de todos los aislamientos con S. meliloti y la proximidad de los diferentes aislamientos entre sí. Los perfiles RFLP con MspI y RsaI del gen nodC agrupan a los aislamientos en dos tipos de perfil no coincidentes entre ellos. Los perfiles RFLP de la región intergénica ITS muestran que todos los aislamientos presentan el mismo perfil que S. meliloti, excepto el aislamiento ORT17 al ser digerido con MspI. Los resultados obtenidos muestran que los aislamientos de M. marina, pertenecen al género Sinorhizobium y están estrechamente emparentados con S. meliloti, según nos indican los porcentajes de similitud del gen ARNr 16S y los árboles filogenéticos, pero que existen diferentes grupos de cepas que difieren de la cepa tipo de S. meliloti en el patrón de los fragmentos de restricción del gen nodC. Además, los dos perfiles obtenidos por RFLP no se corresponden con la diferente localización geográfica de los aislamientos. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el proyecto de Excelencia P10-AGR5821 de La Junta de Andalucía . Cynthia Alías Villegas disfruta una beca predoctoral del mismo programa. BIBLIOGRAFÍA Laguerre, G., et al. (1994). Appl. Environ. Microbiol. 60: 56-63. Laguerre, G., et al. (1996). Appl. Environ. Microbiol. 62: 2029-2036. Laguerre, G., et al. (2001). Microbiology 147: 981-993. Versalovic, et al. (1991). Nucl. Acids Res. 19: 6923-6831. Vinuesa, P., et al. (1998). Appl. Environ. Microbiol. 64: 2096-2104. 34 Session I SI-CP-07 Tolerancia a pH y salinidad extremos y propiedades simbióticas de aislamientos de rhizobia de Medicago marina L. Alías-Villegas, C.1, Espuny, M.R.1, Bellogín, R.A.1, Cubo, M.T.1, Camacho, M.2, Temprano, F.2* 1 Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. Avda. Reina Mercedes 6, 41012-Sevilla. España. 2 IFAPA-Centro Las Torres-Tomejil. Carretera Sevilla-Alcalá del Río km. 12, 2. 41200 Alcalá del Río (Sevilla), España. * [email protected] INTRODUCCIÓN Medicago marina L. es una leguminosa que crece en suelos arenosos o gravosos en numerosos lugares del litoral de la Península Ibérica y de la cuenca mediterránea (Castroviejo et al., 2000). Esta planta podría tener interés para fijar las dunas costeras o servir de planta pionera para facilitar la colonización posterior de los suelos por otras plantas. Es capaz, como muchas leguminosas, de formar nódulos y establecer simbiosis con bacterias del suelo para fijar nitrógeno molecular. Poco se sabe de las características de los rhizobia capaces de nodular M. marina y sería de interés conocer sus propiedades simbióticas con otras especies de Medicago o géneros afines y fisiológicas como tolerancia a pH y salinidad extremos. MATERIAL Y MÉTODOS Se aislaron rhizobia de nódulos de dos poblaciones de plantas de M. marina, una de las marismas costeras de los ríos Tinto y Odiel (37º 10´ 28,5´´ N, 6º 55´51,5 W), en la provincia de Huelva y otra de la playa de San Fernando (36º 28´52,5´´ N, 6º 15´49,4´´ W) en Cádiz. Los nódulos se esterilizaron en superficie y su contenido se sembró en placas con medio sólido de extracto de levadura manitol (ELM), según la técnica habitual (Vincent, 1970). Se realizaron mediante PCR y desarrollo en geles de agarosa perfiles ERIC de ADN para diferenciar los aislamientos (de Bruijn, 1992) tomando de cada grupo similar un aislamiento representativo. Los aislamientos ORT11, 12, 13, 15, 16, 17, 18 y 19 proceden de Huelva y ORT51, 52, 53, 54 y 55 son originarios de Cádiz. Para estudiar el crecimiento a distintos pH se utilizó medio líquido de ELM estabilizando el pH en valores entre 5 y 8,5 con tampones adecuados. Para la tolerancia a salinidad se usó el mismo medio líquido con concentraciones crecientes de cloruro sódico desde 300 mM hasta 900 mM. Los aislamientos se crecieron en tubos con 3 mL de medio, inoculando cada tubo con 50 µL de un cultivo crecido hasta fase estacionaria. Hubo tres repeticiones por cepa bacteriana. Después de 4 días de crecimiento en agitación (180 rpm, 28 ºC) se evaluó el crecimiento midiendo la D.O. de los cultivos a 600 nm. Para la comprobación de las propiedades simbióticas de los aislamientos se utilizaron semillas de M. marina, M. sativa (cv. Aragón), M. polymorpha (cv. Santiago), M. truncatula, M. murex, M. arabiga, M. minima, M. orbicularis y Melilotus indicus. Las semillas se esterilizaron previamente en superficie con etanol al 70% (30 s.) e hipoclorito sódico al 5% (6 min.) y posterior lavado (6 veces) con agua estéril. Las semillas, germinadas en agar agua (10%), se sembraron en tubos de 20 x 200 mm, con una tira de papel de filtro como soporte y 15 mL de medio de cultivo sin nitrógeno (Rigaud y Puppo, 1975). Las plantas se inocularon, a las 24 h de la siembra, con 0,1 mL de una suspensión concentrada de 108 células/mL de cada cepa bacteriana (2 repeticiones/cepa y planta). Las plantas se crecieron en invernadero entre 16 ºC (noche) y 25 ºC (día) y con un fotoperíodo de 14 h de luz. Después de 2 meses se observó la nodulación (presencia y tamaño de nódulos) y la efectividad de la fijación por comparación con los controles de las plantas no inoculadas. Como referencia se utilizaron las cepas LMG6133T de Sinorhizobium meliloti, LMG19920T o M19-1 de S. medicae e ISLU16 de Bradyrhizobium sp. (Lupinus). 35 Session I SI-CP-07 RESULTADOS Y DISCUSIÓN El crecimiento de los aislamientos de M. marina a distintos pH en el rango 5-8,5 mostró un patrón similar, entre ellos y con las cepas de referencia de S. meliloti y S. medicae. Ninguna de las cepas creció a pH 5, mientras que a pH 5,5 mostraron algo de crecimiento y a pH 7, 8 y 8,5 crecieron satisfactoriamente. La cepa ISLU16 de Bradyrhizobium sp., sin embargo, creció bien a pH 5 y también a 5,5, 7 y 8, viéndose disminuido el crecimiento a pH 8,5. La tolerancia a salinidad de los distintos aislamientos fue muy parecida y semejante a la de S. meliloti: todas las cepas crecieron bien hasta con 700 mM de NaCl, poco a 800 mM y nada a 900 mM. La cepa tipo de S. medicae no creció en medios con 800 mM de NaCl. ISLU16 fue incapaz de crecer en medios con más de 300 mM de NaCl. En la Tabla 1 se muestran los resultados de nodulación y fijación de los aislamientos con las distintas especies de medicagos y con Melilotus indicus. Su comportamiento simbiótico fue muy semejante entre ellos y muy parecido al de la especie tipo de S. meliloti y muy diferente al de S. medicae (Garau et al., 2005). Con las especies M. truncatula, M. minima y M. orbicularis la efectividad fijadora de nitrógeno de los aislamientos fue variable. Tabla 1. Nodulación y fijación de nitrógeno de aislamientos de Medicago marina con algunas especie s de Medicago y Melilotus indicus1. Bacteria 1 M. marina M.. sativa M. polymorpha M. truncatula M. murex M. arabiga M. minima M. orbicularis M. indicus ORT11 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fix+ Ab. Ab. nod+fix+ nod+fixnodORT12 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fixAb. ORT13 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fix+ nodORT15 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fixnod+fix+ Ab. ORT16 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixnodAb. nod+fixnod+fix+ Ab. ORT17 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fix+ ORT18 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fixnod+fixAb. ORT19 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fix+ Ab. Ab. nod+fixnod+fixnodORT51 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fixnodORT52 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fixAb. ORT53 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fixAb. ORT54 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fixAb. ORT55 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixnodAb. nod+fix+ nod+fixnodS. meliloti2 nod+fix+ nod+fix+ Ab. nod+fixAb. Ab. nod+fix+ nod+fixAb. S. medicae3 nod+fixnod+fix+ nod+fix+ nod+fix+ nod+fixnod+fix nod+fix+ nod+fix+ nod+fix+ nod+fix+ + T Ab.: Abultamientos blancos en las raíces. 2 Cepa LMG19920 . 3 Cepa M19-1. AGRADECIMIENTOS Este trabajo se ha realizado gracias a la financiación de los proyectos P10-AGR5821 de La Junta de Andalucía y RM2010-00014-00-00 del INIA. BIBLIOGRAFÍA Castroviejo, S., et al.(Eds.) (2000). Flora Iberica. VII(II). Real Jardín Botánico. Madrid. p. 755 . de Bruijn, F. (1992). Appl. Environ. Microbiol. 58: 2180-2187. Garau, G., et al. (2005). Plant Soil.176: 263-277. Rigaud, J., Puppo, A. (1975). J. Gen. Microbiol. 88: 223-228. Vincent, J.M. (1970). A manual for the practical study of root nodule bacteria. IBP Handbook No. 5 . Balckwell Sci. Pub. Oxford (Reino Unido) 36 Session I SI-CP-08 Estudio de la biodiversidad microbiana en suelos de las Marismas del Odiel y de las Minas de Rio Tinto. Ruíz-Carnicer, A.1, Alías-Villegas, C.2, Bellogín, R.A.2, Manyani, H.1, Temprano, F.3, Espuny, M.R.2, Camacho, M.3* 1 ResBioagro. 3ª planta Edificio Citius. Reina Mercedes, 4. Sevilla. 2 Departamento de Microbiología , Facultad de Biología, Universidad de Sevilla. Sevilla. 3 IFAPA Centro Las Torres-Tomejil. Sevilla. * [email protected] RESUMEN Se ha hecho un estudio de la diversidad microbiana presente en suelos altamente contaminados de las Marismas del Odiel y de las Minas de Río Tinto para determinar cómo afectan distintos factores (acidez y salinidad) a las poblaciones bacterianas e aislar aquellas especies mayoritarias en cada uno de ellos. De 300 aislamientos realizados, se han seleccionado aquellos que poseen alguna característica promotora del crecimiento de la planta (PGP) o alguna actividad enzimática útil en la industria. Los resultados muestran la gran biodiversidad presente en las distintas zonas, así como la selección de 28 bacterias altamente prometedoras. INTRODUCCIÓN El impacto de la actividad humana influye de forma notable en la degradación de los estuarios. Entre estos, el estuario de Huelva está considerado como uno de los más contaminados de Europa (Sainz et al., 2004; Ruiz et al., 2008) debido, por una parte al aporte altamente ácido que recibe de los Ríos Tinto y Odiel tras recorrer gran parte de la Faja Pirítica Ibérica y por otra, a los vertidos provenientes del polo industrial onubense. Hasta ahora se han hecho numerosos estudios sobre la influencia de estos vertidos sobre la flora y fauna de la zona (Mateos-Naranjo et al., 2011; Sánchez, 2006), especialmente tras los intentos de recuperación llevados a cabo en parte del estuario (Rubio et al., 2001), pero los estudios acerca de las comunidades microbianas son escasos o nulos. En este trabajo se ha comparado, mediante la técnica de la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE), las poblaciones bacterianas presentes en tres zonas diferenciadas del estuario: zona del Dique Juan Carlos (suelo básico, no salino), zona recuperada (suelo básico, salino) y zona del Rio Tinto (suelo ácido, no salino). Además, se han aislados una serie de bacterias que pueden ser en utilizadas tanto en los procesos de restauración (aplicadas como inoculantes) como en distintos procesos industriales. MATERIAL Y MÉTODOS Toma de muestras: se tomaron muestras de suelo rizosférico de varias sub-parcelas de cada zona de muestreo. Se mantuvieron en frio hasta su procesamiento. Aislamiento de bacterias y pruebas bioquímicas. Se llevaron a cabo utilizando los métodos descritos por Tsavkelova et al. (2007), con ligeras modificaciones. Extracción de ADN de suelo. Se realizó siguiendo el protocolo del kit PowerSoilTM DNA Isolation Kit. Se comprobó el resultado de la extracción en un gel de agarosa al 1%. Electroforesis en gradiente desnaturalizante (DGGE). Se hizo siguiendo el protocolo descrito por Heuer et al. (1997) con un gradiente de agentes desnaturalizantes comprendido entre el 55% y el 70%. El posterior análisis de las bandas se realizó con el programa Quantity One. 37 Session I SI-CP-08 RESULTADOS Y DISCUSIÓN De las 300 cepas aisladas se han seleccionados 28 en base a la determinación de las siguientes propiedades: Actividades enzimáticas: lipasa, proteasa, celulasa y amilasa Características como PGP: producción de ácido indol-acético, de sideróforos, solubilización de fosfatos y actividad ACC (1-aminociclopropano carboxilato) desaminasa Características fisiológicas: tolerancia a salinidad y a pH De las 28 cepas seleccionadas, 15 proceden de Rio Tinto, 12 del Dique Juan Carlos y tan solo 1 procede de la zona de recuperación, lo que parece indicar que las zonas más contaminadas son lugares más apropiados para el aislamiento de bacterias con alguna característica deseable. La mayoría de los aislamientos son capaces de crecer a concentraciones de 600 mM de NaCl, a un amplio rango de pH (de 4.5 a 9) y poseen una o dos actividades enzimáticas. Sólo uno de ellos (RBA-OR120) resultó positivo en las cuatro actividades. Respecto a las propiedades como PGP, la mayoría de las cepas exhibió al menos dos de ellas, presentando 5 de los aislamientos todas las estudiadas. En cuanto a la diversidad bacteriana de las distintas zonas, en cada punto de muestreo aparecieron entre 25-30 especies distintas, existiendo una mayor heterogeneidad entre los distintos puntos en la zona del Rio Tinto (Figura 1). Por otra parte, en términos globales, la zona que presentó una mayor diversidad bacteriana fue la zona recuperada, donde se observaron más de 70 especies distintas. Figura 1. DGGE correspondiente a la zona de Rio Tinto, con 13 puntos de muestreo. AGRADECIMIENTOS Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Excelencia P10-AGR5831 de la Junta de Andalucía y la beca del mismo programa de la Junta de Andalucía de Cynthia Alias Villegas BIBLIOGRAFÍA Heuer, H., et al. (1997). Appl. Environ. Microbiol. 63: 3233-3241. Mateos-Naranjo, E., et al. (2011). Ecotox. Environ. Safe. 74: 2040-2049. Rubio, J.C., et al. (2001). III Congreso Forestal Español. Tomo: 3CFE04-061-T4: pág. 392-395. Ruiz, F., et al. (2008). Mar. Pollut. Bull. 56: 1258-1264. Sainz, A., et al. (2004). Environ. Int. 30: 557-566. Sánchez, M., et al. (2006). Arch. Fur Hydrobiologie 166: 199-223. Tsavkelova, E.A., et al. (2007). Microbiol. Res. 162: 69-76. 38 Session I SI-CP-09 Componentes biológicos en el suelo de dos plantaciones similares de ciruelo en producción ecológica y convencional. Daza, A. *, Pérez-Romero, L.F., Arroyo, F.T., García-Galavís, P.A., Camacho, M., Santamaría, C. IFAPA Centro “Las Torres-Tomejil”, 41200-Alcalá del Río (Sevilla), España. * [email protected] RESUMEN Se han analizado la composición biológica del suelo en dos plantaciones de ciruelo japonés (Prunus salicina Lindl.), en un suelo franco limoso, una manejada en producción ecológica y la otra en producción convencional. Las poblaciones de bacterias y hongos cultivables han sido el doble en el suelo ecológico, que contuvo también poblaciones superiores de rizobios. El grado de micorrización de las raíces de ciruelo y de la herbácea Conyza bonariensis, común en ambos suelos, ha sido elevada y no ha mostrado diferencias significativas. Las poblaciones de lombrices fueron alrededor de tres veces más abundantes en el suelo ecológico. INTRODUCCIÓN La Agricultura Ecológica ha crecido exponencialmente en todo el mundo en las dos últimas décadas. Su defensa se basa tanto en aspectos relacionados con la calidad y sanidad de los productos como en los beneficios medioambientales que dicha práctica agraria conlleva. En este estudio se ofrecen datos que indican que determinados componentes vivos del suelo, claves para su sostenibilidad y fertilidad, se ven favorecidos por el manejo ecológico MATERIAL Y MÉTODOS El estudio se ha desarrollado en dos parcelas experimentales de 5500 m2 cada una de la finca experimental del IFAPA Centro “Las Torres-Tomejil” en Alcalá del Río (Sevilla). Desde su plantación, en enero de 2005, una parcela está en producción ecológica y la otra en producción convencional. La fertilización en la parcela ecológica ha sido a base de estiércol de origen animal (3-4 kg m-2) y la siembra de cubiertas vegetales conteniendo leguminosas. Las poblaciones bacterianas y fúngicas cultivables se han cuantificado en los medios sintéticos Nutrient Agar y PDA, respectivamente. Las poblaciones de rizobios se determinaron por el método del número más probable. El grado de micorrización en raíces de ciruelo (Prunus salicina Lindl.) y la especie herbácea Conyza bonariensis L. se determinó según Smith y Read (1997). Las lombrices se calcularon tomando muestras de suelo de 0,5 m2 y 40 cm de profundidad. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se ha constatado que las cubiertas vegetales de leguminosas aportaron cantidades importantes de los principales macronutrientes (Tabla 1). 39 Session I SI-CP-09 Tabla 1. Aportación bruta en materia seca y principales macroelementos de las diferentes cubiertas vegetales utilizadas en años sucesivos en la plantación ecológica de ciruelos Tipo de cubierta kg/ha Materia seca N P K Glycine max (pre-plantación) 10.060 320 34 206 Vicia faba 6.320 180 14 185 Brassica napus + Vicia sativa 2.500 70 8 75 Vegetación espontánea 2.913 56 9 75 Vicia sativa + Avena sativa 8.320 180 19 220 Vicia faba 10.353 225 24 274 Con relación a las poblaciones de bacterias y hongos, a partir del año 2008 se viene observando de forma consistente que éstas son aproximadamente dos o tres veces más abundantes en el suelo ecológico. En la Figura 1 se representa el periodo 2011-2013. Número de hongos por gramo de suelo seco Número de bacterias por gramo de suelo seco 400000 350000 120000000 100000000 300000 250000 80000000 Ecológico 60000000 Convencional 40000000 20000000 Ecológico 200000 150000 100000 Convencional 10/02/2013 10/01/2013 10/12/2012 10/11/2012 10/10/2012 10/09/2012 10/08/2012 10/07/2012 10/06/2012 10/05/2012 10/04/2012 10/03/2012 10/02/2012 10/01/2012 10/11/2011 10/02/2013 10/01/2013 10/12/2012 10/11/2012 10/10/2012 10/09/2012 10/08/2012 10/07/2012 10/06/2012 10/05/2012 10/04/2012 10/03/2012 10/02/2012 10/01/2012 10/12/2011 10/11/2011 10/12/2011 50000 0 0 Figura 1. Poblaciones de bacterias y hongos en los suelos ecológico y convencional en el periodo 2 0112013. En ocasiones se sembró también una muestra de la cubierta vegetal en la parcela convencional, para comparar la nodulación y las poblaciones de rizobios. Los datos obtenidos con Vicia faba y Vicia sativa se presentan en la Tabla 2. Tabla 2. Número y peso seco de nódulos correspondientes a 12 plantas en los suelos ecológico y convencional Especie Tratamiento Nº nódulos Peso nódulos NMP (g) (Nº rizobios/g suelo) Convencional 105 0,403 499 Vicia faba Ecológico 1094 1,888 10.429 Vicia sativa Convencional Ecológico 92 143 0,157 0,254 nd nd Se ha observado un elevado grado de micorrización (>70%) en las raíces de ciruelo y de la herbácea Conyza bonariensis, pero sin diferencia significativa entre tratamientos. Sin embargo, sí existieron claras diferencias en las poblaciones de lombrices, tres o cuatro veces más abundantes en el suelo ecológico. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen la financiación recibida del INIA (Proyecto RTA2010-00046-00-00) BIBLIOGRAFÍA Smith S.E., and Read, D.J. (1997). Mycorrhizal Symbiosis. Academic Press, San Diego. 40 Session I SI-CP-10 Relative abundance of denitrification genes and diversity of bacterial denitrifiers in sediments with different nitrate concentration. Correa-Galeote, D., Tortosa, G., Bedmar, E.J.* Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, España. Apartado Postal 419, 18080-Granada. * [email protected] INTRODUCTION Denitrification is the biological process by which nitrate is sequentially reduced to dinitrogen gas (N2) via the intermediate compounds nitrite (NO2-), nitric oxide (NO) and nitrous oxide (N2O). Respiratory nitrate reduction is catalysed by a membrane-bound (Nar) or periplasmic (Nap) nitrate reductase encoded by the narGHIJ or the napABC operon, respectively. The reduction of nitrite to nitric oxide is carried out by two structurally different, but functionally similar, enzymes, the Cu-containing and the cd1containing nitrite reductase encoded by the nirK and nirS genes, respectively. The last step of denitrification is the reduction of nitrous oxide and is catalysed by nitrous oxide reductase encoded by the nosZ gene. Denitrifiers include more than 60 genera of Bacteria, and some Archaea and Fungi, and can represent up to 5% of the total soil microbial community (Henry et al., 2006). Denitrification is one of the main branches of the global N cycle, and is responsible for the return of fixed nitrogen to the atmosphere. It also accounts for significant losses of fertilizer nitrogen from agricultural soils (Philippot et al., 2006) and contributes to modify the global atmospheric chemistry, essentially through the greenhouse effect and destruction of the Earth’s ozone layer through stratospheric nitric oxide production. Here we describe differences in the abundance and in the biodiversity of two sampling sites with contrasting nitrate content. MATERIAL AND METHODS Sampling sites. Two sites, the lagoon of el Acebrón (S1) and la Cañada creek (S2), representing the sites with the lowest (0.27 ± 0.05 mg NO3−/kg sediment) and highest (32.77 ± 1.95 mg NO3−/kg sediment) nitrate concentration along la Rocina stream, which feeds Marisma del Rocio in Doñana National Park (South West, Spain), were selected for sampling. Sediment samples were taken as indicated earlier (Tortosa et al., 2011) in April and October years 2008, 2009 and 2010. Samples were placed on ice while returned to the laboratory and then stored at -80 ºC until use. DNA extraction. DNA was extracted from 250 mg of each subsample according to Correa-Galeote et al. (2013a). Quantification of the denitrification-associated microbial community. The size of the denitrifier community was estimated by quantitative, real-time PCR (qPCR) of narG, napA, nirK, nirS and nosZ gene fragments using reaction mixtures, primers and thermal cycling conditions described previously (Correa-Galeote et al., 2013a). The total bacterial community was quantified using 16S rRNA gene as molecular marker as described by Correa-Galeote et al. (2013b). Clone library construction and DNA sequencing. nosZ amplicons from samples taken in April and October 2009 and 2010 from sites S1 and S2 were purified using the QIAquick PCR purification kit (Quiagen) and cloned in Escherichia coli JM109 using the pGEM-T Easy cloning kit. Cells were screened by PCR using the vector primers Sp6 and T7 (Invitrogen). Nucleotide sequences of clones 41 Session I SI-CP-10 containing inserts of the expected size were determined at the DNA Sequencing Service of Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, Spain. Nucleotide sequences were compared to entries in GenBank using BlastN (Altschul et al., 1990). RESULTS AND DISCUSSION Relative abundance of the denitrification genes. For the 3 years under study, regardless of the sampling dates, the relative abundance of the narG and napA genes in sediments taken at S2 was higher than that in sediments sampled at S1. Whereas the relative contributions of narG to the total eubacterial community in April and October were similar at S1, there was a significant difference between April and October at S2. However, there were no significant differences in relative abundance of the nirK gene between S1 and S2 for the three years under study. Whereas values of relative contribution of nirK were similar at S1, the contribution was higher in October than in April at S2. The percentage of the nirS gene was also higher in S2 than in S1. Despite differences in the relative contribution of the nirS gene both for years and sampling dates, the contribution of nirS to the total eubacterial community was higher in October than in April at S1 and also at S2. For the 3 years under study, the relative abundance of nosZ was higher in S2 than in S1, regardless of the sampling. Whereas no differences in the relative contribution of nosZ to the total eubacterial community were found between the months of April and October at S1, there was a statistically significant difference between April and October at S2. Taken together, our data show that relative abundance of the narG, napA, nirS, nirK and nosZ genes was 15.54%, 8.96%, 6.86%, 5.72% and 0.26%, respectively. Biodiversity of bacterial denitrifiers. For the 2 years under study, when sequences of the nosZ gene from the eight clone libraries were compared, the number of operational taxonomic units (OTUs) found in sediments from S1 were 29 for samples taken in both April 2009 and 2010, and 27 and 29 for samples taken in October 2009 and 2010, respectively. Similarly, the number of OTUs in sediments from S2 collected in April 2009 and 2010 were 25 and 26, respectively. However, the number of OTUs in sediments taken at S2 in October 2009 and 2010 were 35 and 34, respectively. Nitrate concentration in sediments from S2 was always higher in October (47 and 34 mg NO3 -/kg in years 2009 and 2010, respectively) than in April (31 and 26 mg NO3-/kg in years 2009 and 2010, respectively). Thus, it is possible that increase in the number of OTUs could be due to the higher nitrate concentration. The most abundant genera in sediments were Acidovorax, Leptothrix, Azospirillum, Paracoccus and Bradyrhizobium. ACKNOWLEDGEMENTS This work was supported by ERDF-cofinanced grants P09-RNM-4746 from Consejería de Economía, Innovación y Ciencia (Junta de Andalucía, Spain). REFERENCES Correa-Galeote, D., et al. (2013a). FEMS Microbiol. Ecol. 83: 340-351. Correa-Galeote, D., et al. (2013b). J. Metagenomics doi:10.4303/mg/235702 Henry, D., et al. (2006). Appl. Environ. Microbiol. 72: 5181-5189. Philippot, L., et al. (2006). In: Molecular Approaches to Soil, Rhizosphere and Plant Microorganis ms Analysis. Cooper JE and Rao JR, eds. CABI International, Cambridge. Pp. 146-164. Tortosa, G., et al. (2011). Ecol. Eng. 37: 539-548. 42 Session I SI-CP-11 Experimental and modelling approach to the legume-Rhizobium interaction: test of plant-host sanctions in co-inoculated plants with fixing and non-fixing strains. Marco, D.E.1*, Talbi, C.2, Bedmar, E.J.2 1 Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba and CONICET, Argentina. 2 Departmento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos, Estación Experimental del Zaidín, Agencia CSIC, Granada, Spain. * [email protected] ABSTRACT We tested the plant host sanction hypothesis using soybean plants co-inoculated with two rhizobial strains, a normally N2 fixing strain and a mutant derivative that lacks nitrogenase activity but has the same nodulation abilities. We found no evidence of functioning plant host sanctions to cheater rhizobia based on nodular rhizobia viability in co-inoculated plants. INTRODUCTION The origin and persistence in nature of symbiotic interactions is difficult to explain since the existence of exploitative, cheating' partners that could erode the interaction is common. Host sanctions against non N2 fixing, cheating symbionts have been proposed as a force stabilizing mutualism in legume-Rhizobium symbiosis (Denison, 2000). Penalizations would include decreased nodular rhizobial viability and/or early nodule senescence in nodules occupied by cheating rhizobia. We analyze the ecological and evolutionary stability of Rhizobium-legume symbiosis when "cheating" strains are present, using a combination of experiments and modelling. Co-occupation of the same nodule by strains with different fixation abilities is an important source of concern in cultivated legumes (Rolfe and Gresshoff, 1980). Effects of co-occupation of nodules by non-fixing rhizobia would be diluted by fixing rhizobia occupying the same nodule (Denison, 2000). We performed experiments with soybean plants co-inoculated with two rhizobial strains, a normally N2 fixing strain and an isogenic non-fixing, cheating mutant derivative that lacks nitrogenase activity but has the same nodulation abilities. MATERIAL AND METHODS Bacterial strains and inoculum preparation. Mutant derivatives BJD321 (nopB-lacZuidA, Zehner et al ., 2008) and A3 (nifH::Tn5, Nod+ Fix-; Hahn et al., 1984) strains derived from Bradyrhizobium japonicum USDA110 were grown in PSY medium (Regensburger and Hennecke, 1983) and used for inoculations (10 9 cells/ml). Coinocula were prepar ed by mixing bacterial solutions containing similar number of colony forming units (CFUs). Strain A3 lacks nitrogenase activity but shows similar infection and nodule formation levels respect to USDA110 and BJD321. Plant experimental setting. Seeds of soybean (Glycine max) cv. Williams were surfacesterilized, ge rminated and sowed in Leonard jar assemblies. Seedlings (2/jar) were inoculated independently with 1 ml of a bacterial suspension made from cultures of each BJD321, A3 and a mixture of each strain. Jars were periodically supplied with a sterile N2-free nutrient solution. Plants were placed in a growth chamber under 600 µEm-2 s-1 photosynthetically active radiation, at 25/18 °C day/night temperature, and 16/8 h photoperiod. Four weeks after inoculation nodules of each plant were collected. Determination of nodule occupancy and viable rhizobial counts. Collected nodules were individually surface sterilized using Cl2Hg (2.5%), manually crushed, homogenized and 43 Session I SI-CP-11 resuspended in Tris-HCL mannitol buffer containing. Each crushed nodule was smeared on PSY plates supplemented with selective antibiotics depending on the strain to determine if the nodule was occupied by BJD321, A3 or both strains. To determine rhizobial viability, appropriate serial dilutions from each nodule of another set of homogenized nodules were plated (three replicates per dilution) in PSY supplemented with selective antibiotics depending on the strain. Plates were incubated at 28 °C for a week or until no further growth was detected, and CFUs were counted. Plant dry weight and N content were determined in plants that had been heated at 60 ºC for 48 h. RESULTS AND DISCUSSION Plants with all nodules occupied by non-fixing rhizobia were not able of maintaining good vegetative conditions as plants with co-occupied or exclusively occupied nodules with fixing rhizobia, and ultimately they died due to N starvation about 5 weeks after inoculation. Thus, comparisons were performed using plants co-inoculated and plants inoculated only with strain BJD321. In co-inoculated plants nodule co-occupation did not differ (36.35 % BJD321, 33.32 % BJD321 and 27.28 % A3, 2 = 6.00, p = 0.199, n = 66). Co-inoculated plants and plants only inoculated with strain BJD321 did not differ in dry weight (Kolmogorov-Smirnov Z = 0.707, p = 0.699, n = 6). Total plant N did also not differ between treatments (Kolmogorov-Smirnov Z = 1.299, p = 0.068, n = 6). Nodule mass did not differ between co-inoculated plants and plants inoculated with BDJ321 only (2 = 1.66, p = 0.56, n = 66). Number of CFUs did not differ between cooccupied nodules and BDJ321 or A3 single-occupied nodules in co-inoculated plants (Figure 1). Figure 1. Number of CFUs in cooccupied nodules or singleoccupied nodules in co-inoculated plants. No evidence of functioning plant host sanctions to cheater rhizobia based on nodular rhizobia viability in co-inoculated plants was found. These experimental results will be incorporated to the mathematical model (Marco et al., 2009) to check for plant population persistence in presence of cheating rhizobia. ACKNOWLEDGEMENTS We thank Michael Goffert for B. japonicum BJD321 and Hans-Martin Fischer for A3 strains. DM was granted with a Sabbatical leave from the Ministry of Education of Spain. REFERENCES Denison, R.F. (2000). Amer. Nat. 156: 567-576. Hahn, M., et al. (1984). Plant Mol. Biol. 3:159-168. Marco, D.E., et al. (2009). J. Theor. Biol. 259: 423-433. Regensburger, B., and Hennecke, H. (1983). Arch. Microbiol. 135: 103-109. Rolfe, B.G., and Gresshoff, P.M., 1980. Austr. J. Biol. Sci. 33, 491-504. Zehner, S., et al. (2008). Mol. Plant Microbe Interact. 21: 1087-1093. 44 Session I SI-CP-12 Identification of rhizobial strains nodulating cultivated grain legumes in Egypt. Zahran, H.H.1*, Chahboune, R.2, Bedmar, E.J.2, Abdel-Fattah, M.1, Yasser, M.M.1, Mahmoud, A.M1. 1 Department of Botany and Microbiology, Faculty of Science, University of Beni-Suef, Beni-Suef 6251 1, Egypt. 2 Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín, Agencia Estatal Consejo Superior de Investigaciones Científicas (EEZ-CSIC). Apartado Postal 419, 18080-Granada, Spain. * [email protected] INTRODUCTION Members of the Leguminosae (Fabaceae), comprising 17,000 to 19,000 species, play an important ecological role, with representatives in nearly every terrestrial biome on Earth. These plants are best characterized by their ability to establish N2-fixing symbiotic associations with Alphaproteobacteria of the genus Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and Ensifer (for reviews see Rivas et al., 2009; Velázquez et al., 2010) collectively referred to as rhizobia. Other non-rhizobial genera have been shown to nodulate legumes (for a review see Velázquez et al., 2010), and they can also be nodulated by Betaproteobacteria of the genus Burkholderia (for reviews see Angus et al., 2010; Bontemps et al., 2010; Gyaneshwar et al., 2011). During the infection process, an exchange of molecular signals occurs between the two partners, leading to the formation of root nodules, where nitrogen fixation takes place. In Egypt, the grain legumes chickpea (Cicer arietinum), lentil (Lentils esculentus), common bean (Phaseolus vulgaris), pea (Pisum sativum) and broad bean (Vicia faba) are widely used for people consumption. Cultivated all along the River Nile, no data exist on the bacterial diversity within nodules formed on those legume crops. In this regard, a culture collection of more than 50 rhizobial-like strains isolated from root nodules of those legumes were obtained whose phenotypic characteristics and nodulation capacity have been published (Zahran et al., 2012). Our research had the aim of identifying the strains isolated from nodules formed on agriculturally-grown chickpeas, lentils, common beans, peas and broad beans, and to identify them on the basis of their 16S rRNA gene phylogenies. MATERIAL AND METHODS Isolation of bacteria from nodules and culture conditions Nodules (10-12/plant) were collected from roots of healthy C. arietinum, L. esculentus, P. vulgaris, P. sativum and V. faba plants agriculturally-grown in the Beni-Suef Governorate (Egypt). They were surface-sterilized and crushed in a drop of sterile water. The resulting suspension was streaked onto Petri dishes containing yeast extractmannitol (Y EM) medium supplemented with 0.025 g/l Congo Red. Colonies forming units were selected as indicated earlier (Chahboune et al., 2011). DNA extraction and PCR amplifications For DNA extraction and PCR amplifications, genomic DNA was isolated as described previously (Chahboune et al., 2011). Repetitive extragenic palindromic (REP)polymerase chain react ions (PCR) were performed using primers REPIR-I and REP2-I according to de Bruijn (1992). PCR amplifications of 16S rRNA gene fragments were carried out using the two opposing primers 41f and 1488r as previously reported (Chahboune et al., 2011). Amplification products were purified and subjected to cycle sequencing using the same primers as for PCR amplification. The obtained sequences 45 Session I SI-CP-12 were compared to the GenBank database using the BLAST program and also with the sequences held in EzTaxon-e server (Kim et al., 2012). Phylogenetic trees were prepared as indicated earlier (Chahboune et al., 2011). Nitrogenase activity was determined as acetylene-dependent ethylene production as described previously (Zahran et al., 2012). RESULTS AND DISCUSSION A total of 54 bacterial strains, 12 from P. sativum, 11 from each C. arietinum and V. faba, and 10 from each L. esculentum and P. vulgaris, respectively, were isolated from extracts of nodules from healthy, agriculturally-grown plants in Beni-Suef Governorate (Egypt). According to the results, the 54 isolates showed 15 different REP-PCR patterns. The nearly complete sequence of the 16S rRNA gene from a representative strain of each REP pattern revealed they all were members of the family Rhizobiaceae of the Alphaproteobacteria. Of all the 15 strains, 12 were classified into the genus Rhizobium and 3 into the Mesorhizobium group. The maximum likelihood phylogenetic tree and EzTaxon-e analysis inferred from the 16S rRNA genes sequences indicated that strains BSPV2, BSPV7, BSPS4, BSVF2, BSVF5, BSVF9, BSLE4 and BSLE10 clustered with R. leguminosarum USDA 2370T with identity values higher than 99.6%, and that strains BSPS7, BSPS10 and BSPV9 grouped with R. pisi DSM 30132T, R. etli CFN 42T and R. mesosinicum CCBAU 25010T, respectively, each of them with identity values higher than 99.8%. Also, the strain BSCA1 clustered with M. amorphae ACCC 19665T, and strains BSCA8 and BSCA9 did with M. robiniae CCNWYC 115T, the all three strains with 100% identity for the 16S rRNA gene sequences of their corresponding type strains. The 15 rhizobial strains identified in this study nodulated their original host plants. Nodules fixed N2, with values of nitrogenase activity, determined as acetylene-dependent ethylene production, varying from 51 nmol C2H4 plant-1 h-1 in C. arietinum nodulated by strain BSCA8 to 480 nmol C2H4 plant-1 h-1 in P. vulgaris inoculated with strain BSPV2. ACKNOWLEDGEMENTS This study was supported by ERDF-cofinanced grant RNM4746 from Consejería de Economía, Innovación y Ciencia (Junta de Andalucía, Spain). A. M. Mahmoud thanks the Egyptian Government for a Partnership and Ownership Initiative (PAROWN) grant to support his stay at Department of Microbiology and Symbiotic Systems, Estación Experimental del Zaidín, Agencia Estatal CSIC, Granad a, Spain. REFERENCES Angus, A.A., et al. (2010). Mol. Ecol. 19: 28-23 Bontemps, C., et al., (2010). Mol. Ecol. 19: 44-52. Chahboune, R., et al. (2011). Syst. Appl. Microbiol. 34: 440-445 De Bruijn, F.J. (1992). Appl. Environ. Microbiol. 58: 2180-2187. Gyaneshwar, P., et al. (2011). Mol. Plant Microbe Interact. 24: 1276-1288. Kim, O.S., et al. (2012). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 62: 716-721. Rivas, R., et al. (2009). Rev. Microbiol. Insight, 2: 251-269. Velázquez, E., et al. (2010). In: Proteobacteria: Phylogeny, metabolic diversity and ecological ef fects. Sezenna, M.L. (ed). Nova Science Publishers Inc. New York, USA, pp37-56. Zahran, H.H., et al. (2012). Aust. J. Basic Appl. Sci., 6: 571-583. 46 Session I SI-CP-13 Genetic diversity and biogeography of rhizobial genospecies nodulating wild chickpea Cicer canariense on La Palma (Canary Is.). Armas-Capote, N.1, Pérez-Yepez, J.1, Martínez-Hidalgo, P.2, Garzón-Machado, V.3, del Arco-Aguilar, M.3, Velázquez, E.2, León-Barrios, M.1* 1 Departamento de Microbiología y Biología Celular. 2 Departamento de Microbiología y Genética, Universidad de Salamanca. 3 Departamento de Biología Vegetal (Botánica). Universidad de La Laguna. Tenerife. Spain. * [email protected] ABSTRACT We have characterized a collection of one hundred and thirteen rhizobial strains that nodulate Cicer canariense and show the distribution of the bacterial genotypes at ten locations on the island of La Palma (six inside Caldera de Taburiente National Park and four in areas to the northwest and south of the Park). Analysis of the 16S rRNA gene classified these isolates within the genus Mesorhizobium and distinguished nine genotypes. The five predominant genotypes belonged or were close to reference strains of M. caraganae (32 isolates), M. tianshanense/M. metallidurans/M. gobiense (29 isolates), M. opportunistum (14 isolates) M. ciceri (12 isolates) and M. tamadayense (11 isolates). M. tamadayense isolates were exclusive at one location outside the Park. The M. tianshanense and M. ciceri groups predominated in planted plots and showed scarce genetic diversity at infraspecific level. The M. caraganae and M. opportunistum groups were widely distributed inside and outside the Park, though they predominated in natural populations, and were genetically diverse. INTRODUCTION Cicer canariense is a perennial wild chickpea endemic to the Canary Islands, the only native Cicer species in the archipelago. It is found almost exclusively on La Palma, in the dry mesocanarian bioclimatic belt characteristic of pine woodland (Pinus canariensis). Natural populations of C. canariense are fragmented and contain a low number of individuals, and currently it is catalogued as “endangered” (EN) in the Red List of the Spanish Vascular Flora (Moreno, 2008), according to the IUCN (2001) criteria. Herbivores have probably been the most important threat for C. canariense (mouflons and rabbits on Tenerife, and Barbary sheep, goats and rabbits on La Palma) (Garzón-Machado et al., 2010). In this study we investigated for the first time the genetic diversity of the rhizobia nodulating C. canariense in natural and reinforced populations on La Palma (Canary Islands). MATERIAL AND METHODS Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) fingerprints were obtained as previously described (Ramírez-Bahena et al., 2012). Restriction Fragment Length Polymorphism of PCR-amplified 16S rRNA (rrs) genes (16S-RFPL). The rrs genes were amplified, restricted and analysed as described (Jarabo-Lorenzo et al., 2000). Sequencing of rrs genes. The rrs genes were amplified as above described and the purified products (Qiaquick extraction kit, Qiagen) were sequenced in an ABI3730XL (Macrogen, Inc.) or in a Genetic Analyzer 3500 (Servicio de Genómica, ULL). Phylogenetic analyses were conducted as described (Lorite et al., 2011). The sequences of rrs genes were compared with those of bacterial type strains using the EzTaxon-e server (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012). 47 Session I SI-CP-13 RESULTS AND DISCUSSION A collection of one hundred and thirteen rhizobia that nodulate C. canariense were characterized. Isolations were done from populations at ten sampling sites on La Palma, which included six locations with natural and planted populations within the Caldera de Taburiente National Park and another four localities with natural populations outside the Park. The genetic diversity and phylogeny were estimated by RAPD profiles, 16S-RFLP analysis and sequencing of the 16S rRNA genes. 16S-RFLP classified the isolates within the genus Mesorhizobium and distinguished nine different ribotypes. Four branches were minority genotypes (3-5 isolates), whereas another five contained the predominant genotypes that clustered with reference strains M. tianshanense/M. metallidurans/M. gobiense (M. tianshanense-group) M. caraganae, M. opportunistum, M. ciceri and M. tamadayense. The 16S sequences confirmed homogeneity for M. ciceri, M. opportunistum and M. tamadayense RFLP-groupings. They also resolved further internal divergence within the two larger groups (M. caraganae and M. metallidurans) outlining two novel Mesorhizobium species. RAPD fingerprints were used to estimate the genetic diversity at infraspecies level, showing that highly similar isolates belonged to the same RFLP group and were in general recovered from the same location. The geographical distribution of these genotypes varied among the different locations. Some genotypes predominated or were restricted to a single location, whereas others were widely distributed. Isolates from the M. tianshanense-group were detected at six locations, although 23 out of 29 isolates were recovered from the same single location. The M. ciceri-genotype isolates were detected at four sampling sites but predominated at two neighbouring locations. The M. tamadayense genotype showed infraspecific diversity, despite being exclusive to a single location outside the Park. Isolates from the M. caraganae and M. opportunistum groups were widely distributed inside and outside the Park, although they predominated in natural populations and were genetically diverse. ACKNOWLEGMENTS Supported by the Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, Organismo Autónomo de Parques Nacionales (Ref. 111/2010). REFERENCES Garzón-Machado, V., et al. (2010). Biol. Conserv. 143: 2685-2694. Jarabo-Lorenzo, A., et al. (2000). Syst. Appl. Microbiol. 23: 418-425. Lorite, M.J., et al. (2010). Syst. Appl. Microbiol. 33: 282-290. Moreno, J.C. coord. (2008). Lista Roja 2008 de la flora vascular española. Ministerio de Medio Amb iente y Medio Rural y Marino, y Sociedad Española de Biología de la Conservación de Plantas, Madrid. 86 pp. Ramírez-Bahena, M.H., et al. (2012). Syst. Appl. Microbiol. 35: 334-341. 48 Session I SI-CP-14 Identificación de dos bacterias diazótrofas asociadas a una Brassicaceae (Lepidium meyeni Walp.) de suelos altoandinos del Perú. Chumpitaz, C. *, Ogata, K., Santos, R., Zúñiga, D. Laboratorio de Ecología Microbiana y Biotecnología Marino Tabusso, Dpto. Biología, Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima12, Perú. www.lamolina.edu.pe/lmt * [email protected] RESUMEN Se amplificó el gen nifH de la dinitrogenasa reductasa en dos cepas, LMTZ064-109 y LMTZ064-119, asociadas a la rizosfera de Lepidium meyenii Walp. Los aislados pertenecen a los géneros Stenotrophomonas y Rahnella, respectivamente, siendo ambas Gram negativas, cocobacilos y oxidasa negativa. La aparición de un producto de aproximadamente 370 pb perteneciente al gen nifH confirmó la capacidad fijadora de nitrógeno molecular de ambas cepas. INTRODUCCIÓN La maca (L. meyenii Walp.) es una Brassicaceae que habita en regiones altoandinas del Perú entre los 3700-4500 msnm. Es muy apreciada por sus cualidades nutricionales y medicinales (Tovar, 2001). Al ser un cultivo muy extractivo genera un empobrecimiento de los suelos, disminuyendo los rendimientos (Zúñiga, 2009). Los diazótrofos, por otro lado, son un grupo de microorganismos capaces de fijar N 2 a formas más asimilables en diferentes ambientes. El gen nifH de la Fe-proteína de la nitrogenasa (enzima responsable del proceso de fijación) es usado como un indicador determinante de esta capacidad (Zehr et al., 2003). El objetivo de este estudio fue identificar la capacidad fijadora de N2 de los aislados bacterianos asociados al cultivo de maca. MATERIAL Y MÉTODOS Reactivación y caracterización morfológica y bioquímica de bacterias conservados. Amplificación BOX PCR de acuerdo a Versalovic et al. (1991). Amplificación del gen nifH de acuerdo a Barua et al. (2011). Análisis filogenético por medio del gen ARN ribosomal 16S según Weisburg et al. (1991), usando la base de datos del Genbank (NCBI). RESULTADOS Y DISCUSION Un total de siete bacterias (LMTZ064-21, LMTZ064-30, LMTZ064-94, LMTZ064-95, LMTZ064-109, LMTZ064-119 y LMTZ064-120) fueron seleccionadas de la colección de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (186 cepas) aisladas de suelos de cultivo L. meyenni (Garcia, 2011). Estas cepas fueron caracterizadas morfológicamente de acuerdo a su crecimiento en medio mineral sin nitrógeno (MMN-) por 48 horas a 28 °C. Las colonias tuvieron formas convexas, incoloras, de borde liso, mucosas y diámetro entre 0.5-2 mm. Todas resultaron ser Gram negativas, cocobacilos y oxidasa negativa. De acuerdo al análisis BOX PCR se obtuvieron cinco perfiles distintos (Figura 1A), a los cuales se les evaluó su capacidad fijadora de nitrógeno por medio de la amplificación del gen nifH de la dinitrogenasa reductasa (Fe-proteína). Solo dos aislados (LMTZ064-109 y LMTZ064-119) resultaron ser nifH positivos (Figura 1B). 49 Session I SI-CP-14 A B A B C C D E E A B C D E nifH 370pb Figura 1. A) Perfiles BOX A1R, A (21), B (30), C (94, 95), D (109) y E (119, 120). M: marcador 1 kb (fermentas). B) PCR nifH de perfiles BOX diferentes. Cepas nifH+: LMTZ064-109 y LMTZ064-119. CIAT899 Rizhobium tropici (control+). M: marcador 100 pb (Axygen). Figura 2. Árbol filogenético en base al gen del ARNr 16S mostrando la localización de los aislados LMTZ064-109 y LMTZ064-119. Se realizó un análisis Neighbor-joining con un valor bootstrap calculado para 1.000 réplicas. Escala: 2% de secuencias divergentes. De acuerdo al análisis filogenético realizado (Figura 2), se encontró que la cepa LMTZ064-109 está relacionada a S. maltophila ATCC 13637T con 98%. Stenotrophomonas spp. es un habitante común de suelos y plantas (Ryan et al., 2009), especies de este género pueden actuar como promotores de crecimiento vegetal mediante diferentes mecanismos como la fijación de nitrógeno y producción de fitohormonas (Liba et al., 2006). Por otro lado, la cepa LMTZ064-119 tuvo un 100% de similitud con Rahnella aquatilis HX2. Esta especie se reportó por primera vez como una enterobacteria fijadora de nitrógeno presente en rizosferas de cultivos de maíz y trigo (Berge et al., 1991) y su capacidad como PGPR en rizosfera de cultivos de soja y papa (Kim et al., 1997; Kohashikawa, 2010) al producir fitohormonas y solubilizar sales fosfato. En este trabajo se pudo determinar que las dos bacterias aisladas del cultivo de maca fueron capaces de fijar nitrógeno molecular. Este parámetro es importante a tener en cuenta para la producción de inoculantes bacterianos, ya que además de reducir el uso de fertilizantes químicos, promueve el crecimiento de cultivos de importancia económica dentro de una agricultura sustentable; mejorando a su vez la calidad del suelo. AGRADECIMIENTOS Perú biodiverso GTZ-CONCYTEC, 2009. Procyt 309-2009-CONCYTEC. FDA Biol.111-UNALM. BIBLIOGRAFÍA Barua, M.S., et al. (2012). Microbiol. Res. 167: 95-102. Berge, O., et al. (1991). Can. J. Microbiol. 37: 195-203. Garcia, F. (2011). Tesis Doctoral. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima, Perú. Kim, K,Y., et al. (1997). FEMS Microbiol. Lett. 153: 273-277. Kohashikawa, N. (2010). Tesis Doctoral. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima, Perú. Liba, C.M., et al. (2006). J. Appl. Microbiol. 101: 1076-1086. Ryan, R.P., et al. (2009). Nature Rev. Microbiol. 7: 514-525. Tovar, O. (2001). Publicación CONCYTEC. Lima 144 pp. Versalovic, J., et al. (1991). Nucl. Acids Res. 19: 6823-6831. Weisburg, W.G., et al. (1991). J. Bacteriol. 173: 697-703. Zehr, J.P., et al. (2003). Environ. Microbiol. 5: 539-554. Zúñiga, D. (2009). Perú biodiverso GTZ-Concytec. Lima, Perú. 50 Session I SI-CP-15 Análisis de la presencia natural de micorrizas en cultivos de algodón inoculados con Bacillus sp. y/o Bradyrhizobium sp. Valencia, C.1*, Toro, M.2, Zúñiga, D.1 1 Laboratorio de Ecología Microbiana y Biotecnología Marino Tabusso. Dpto. de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Agraria La Molina, La Molina, Lima, Perú. Web: www.lamolina.edu.pe/lmt. 2 Laboratorio de Estudios Ambientales, Instituto de Zoología y Ecología Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. * [email protected] RESUMEN Para el presente estudio, se extrajeron las raíces de cultivos de algodón (Gossypium barbadense L.) inoculados con Bacillus sp. (B) y/o Bradyrhizobium sp. (Br), B + Br (I), y los controles N+ (Nitrato de Potasio) y N- (Sin inocular). Para la tinción se realizó una modificación optimizada del protocolo propuesto por Phillips & Hayman. Una vez teñidas las raíces se calculó el porcentaje de Longitud de Raíz Colonizada (%LRC) para determinar la influencia de las diferentes bacterias sobre la presencia natural de micorrizas arbusculares (MA). Se observó que el %LRC (28.77%) disminuye cuando el cultivo es fertilizado con nitrato de potasio, mientras que la colonización micorrícica se promueve cuando las plantas son inoculadas con Bacillus sp., alcanzando en promedio un 70.98%. INTRODUCCIÓN Las bacterias promotoras de crecimiento (PGPRs) están asociadas con la rizósfera de las plantas y son capaces de ejercer un efecto benéfico en el crecimiento de plantas. Bajo ciertas condiciones, estas bacterias son capaces de promover la germinación de esporas de hongos y la elongación del tubo germinativo o incluso aumentar la densidad de la colonización micorricica (Jaizme et al., 2006) Las MA son asociaciones ecológicamente mutualistas que se establecen entre un selecto grupo de hongos (Glomeromycota) y la gran mayoría de las plantas. Aproximadamente un 80% de las familias de plantas existentes tienen la potencialidad de formar este tipo de asociación (Cuenca et al., 2007). La distribución de micorrizas en el suelo puede ser afectada directamente por el pH obteniéndose una buena germinación de esporas de MA en un intervalo amplio de pH que va de 5 a 8 (Alvarado et al., 2004). MATERIAL Y MÉTODOS Las muestras fueron tomadas de un cultivo de algodón cosechado a los 180 días, el cual había sido inoculado con B, Br y la interacción de ambos (I) en diferentes momentos: a la siembra (M1), en la aparición del hipocotilo (M2) y en ambos momentos (M12) (Zúñiga, 2011). El ensayo fue a nivel de invernadero y el sustrato utilizado para las plantas fue una mezcla de suelo agrícola y arena (2:1). Las raíces fueron extraídas y lavadas; para la tinción de raíces se utilizó el protocolo de Phillips y Hayman (1970) con las modificaciones propuestas por Chávez et al. (2013). Las observaciones se realizaron con un lente objetivo de 4x y se contaron los campos colonizados (Sieverding, 1983). Los datos del %LRC se analizaron con el software estadístico Statgraphics centurión. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El protocolo optimizado previamente para la tinción (Datos no mostrados) permitió visualizar las características morfológicas de las MA (vesículas y arbúsculos) en raíces de algodón (Figura 1). El análisis de varianza multifactorial (ANOVA) mostró que el 51 Session I SI-CP-15 factor “tipo de inóculo” tuvo un efecto altamente significativo sobre el %LRC (p = 0.0000), mas no el factor “momento de inoculación”. Mediante la prueba de rangos múltiples LSD, el tratamiento N+ afectó negativa y significativamente (28.77%) la infección natural de los hongos micorrícicos, reportados por primera vez en el cultivo de algodón en nuestro país (Figura 2). De acuerdo a lo indicado por Cornejo (2008), ello podría deberse a la reducción del pH del suelo causada por la producción de H+ generado en el proceso de nitrificación. A su vez el control sin inocular N- presentó un %LRC significativamente menor (53.81%) que las raíces inoculadas con B (70.98%), se resalta que el porcentaje de infección en condiciones naturales es un indicador de que el algodón es sensible a la infección por micorrizas. Sin embargo, cuando es inoculado con la cepa de Bacillus sp. el %LRC se incrementa, esto es posible gracias a que las PGPRs y las MA comparten la misma zona de infección y pueden crear una interacción que favorece tanto el crecimiento de la planta como el aumento de la biomasa del hongo, en contraste, otros autores señalan que no existe una interacción positiva entre las PGPRs y las MA (Jaizme et al. 2006). B A A Porcentaje de colonización Figura 1. Infección micorrícica en raíces de algodón inoculadas con Bradyrhizobium sp. A: Vesícula s, B: Hifas. Aumento 10X (Izquierda) y 4X (Derecha). 100 80 60 M1 40 M2 M12 20 0 B Br I Tratamientos N+ NFigura 2. Porcentaje de colonización para los tratamientos usados en la inoculación (B: Bacillus s p., Br: Bradyrhizobium sp., I: Bacillus sp., + Bradyrhizobium sp. y dos controles N+: Con Nitrógeno y N-: Sin Nitrógeno). Las series representan los momentos en los que se realizó la inoculación: a la siembra (M1), aparición del hipocotilo (M2) y en ambos momentos (M12). Las barras señaladas con las mismas letra s no difieren significativamente (p ≤ 0.05). AGRADECIMIENTOS Protec-CONCYTEC-OAI N° 278-2009. FDA Biol. 111-UNALM. BIBLIOGRAFÍA Alvarado, A., et al. (2004). Agronomía Costarricense, 28: 89-100. Chávez-Bárcenas, A.T., et al. (2013). African J. Microbiology Res. En prensa. Cornejo, P., et al. (2008). Chilean J. Agric. Res. 68: 119-127. Cuenca, G., et al. (2007). Interciencia, 32: 23-29. Jaizme Vega, M., et al. (2006). Fruits, 61: 1-7. Sieverding, E. (1983). Manual CIAT, Cali, 123 pp. Zuñiga, D. (2011). Informe final Proyecto Protec-CONCYTEC, 2009. 52 Session I SI-CP-16 Poblaciones microbianas con potencial PGPR en la rizósfera de cultivos de papas nativas amargas del altiplano peruano. Ramos, E.1*, Santos, R.1, Velezmoro, C.2, Zúñiga, D.1 1 Laboratorio de Ecología Microbiana y Biotecnología Marino Tabusso. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima 12, Perú. 2 Facultad de Industrias Alimentarias. Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima 12, Perú. * [email protected] RESUMEN Se evaluaron las poblaciones microbianas de la rizosfera de papas nativas amargas de las variedades locka (Solanum juzepczukii) y occucuri blanco (S. curtilobum) cultivadas en Ilave - Puno (Perú), entre las coordenadas geográficas 16º06´00” y 69º38´00” de latitud sur y oeste respectivamente y 3860 m.s.n.m. INTRODUCCIÓN Alrededor del 65% de la población andina económicamente activa se dedica a la agricultura y la papa es el principal alimento básico, no gramíneo, de la dieta de sus pobladores. Las papas nativas amargas (Solanum juzepczukii y S. curtilobum) pueden crecer a altitudes de hasta 4200 m.s.n.m., donde los riesgos de pérdida de cosechas debido a heladas son mucho mayores para papas de variedad “dulce”. De acuerdo a la Dirección de Información Agraria de Puno, en la campaña 2010-2011, este departamento cultivó alrededor de 46 966 ha de papa, con rendimientos promedio de 9 641 kg/ha. Las estadísticas oficiales no diferencian áreas específicas para papas dulces y amargas, sin embargo puede inferirse que alrededor del 26% son papas amargas, obtenidas principalmente por producción orgánica. Algunas poblaciones microbianas de papas han sido caracterizadas, sin embargo, a pesar de la importancia de los cultivos de papas amargas en el Altiplano, pocos estudios se han realizado al respecto. Así, el presente estudio pretende evaluar las poblaciones microbianas de papas nativas amargas cultivadas en Ilave (Puno, Perú). MATERIAL Y MÉTODOS La zona de estudio se situó en la cuenca del río Ilave, de la provincia de El Collao, al sur del departamento de Puno, con temperaturas que oscilan entre 1-15 °C y con precipitación media anual de 620 mm. Se eligieron las comunidades andinas de Jallamilla y Concahui. Se tomaron muestras de suelo rizosférico (franco arenoso, pH 5.1-5.5) de papas amargas de las variedades locka y occucuri blanco en 3 periodos de evaluación: floración, tuberización y cosecha, en los meses de enero, abril y mayo del 2009 de manera respectiva. También se tomaron muestras de suelo no rizosférico. Poblaciones microbianas de la rizosfera de papas amargas. Se llevó a cabo la cuantificación de bacterias esporulantes mesófilas aerobias y anaerobias (EMA y EMANA) y psicrófilas aerobias y anaerobias (EPA y EPANA), mediante el método de APHA (1998). Los aerobios mesófilos viables (AMV), Pseudomonas (PS), mohos y levaduras (MYL) fueron analizados según la ICMSF (2000). Los diazotrofos (DIAZO) se ensayaron de acuerdo a Zapater (1975). Los datos fueron sometidos al análisis comparativo de medias (prueba de Duncan, p≤0.05) utilizando el programa R. Caracterización molecular de los microorganismos aislados. Se realizó mediante perfiles de amplificación BOX-PCR y secuenciamiento del gen ARNr 16S, según las técnicas descritas por Versalovic et al. (1991). 53 Session I SI-CP-16 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se observaron diferencias significativas en los grupos microbianos de las poblaciones de EMA, EMANA, EPA, EPANA y DIAZO, según la época de muestreo, no encontrándose diferencias según la comunidad ni variedad cultivada. La influencia rizosférica solo se evidenció en las poblaciones de DIAZO de vida libre y PS. Así, durante la floración, en los suelos cultivados, se registraron poblaciones de 10 5 NMP/g PS, 107 NMP/g DIAZO y 105 UFC/g EMA (Figura 1). Tabla 1.Clasificación filogenética de las cepas aisladas de la rizosfera de papas amargas. Figura 1. Poblaciones microbianas de la rizosfera de papas amargas en tres estados fenológicos del cultivo Se observaron 25 diferentes perfiles de amplificación BOX-PCR entre los aislados provenientes de la rizosfera de papas nativas amargas. Se identificó B. simplex NBRC 15720T, reportado en la literatura como secretor de auxinas y B. safensis FO-036bT, de esporas altamente resistentes (Tabla 1). Otras cepas estuvieron relacionadas con B. pumilus ATCC 7061T, conocido promotor de crecimiento vegetal, Brevibacillus laterosporus DSM 25T, de uso potencial como controlador biológico y Lysinibacillus parviboronicapiens BAM-582T. Se encontró además la presencia de cepas del género Pseudomonas relacionadas a P. fragi ATCC 4973T que promueve la movilización de fósforo, P. gessardii CIP 105469T que produce enzimas de gran resistencia al frío y P. azotoformans IAM1603T de demostrada capacidad de fijación de nitrógeno. Las cepas anteriormente mencionadas vienen siendo ensayadas para la evaluación de sus propiedades PGPR. AGRADECIMIENTOS Proyecto PROCOM 255-2008-CONCYTEC-OAJ, Consorcio de productores de tunta “Los Aymaras”, FDA Biol.111- UNALM. BIBLIOGRAFÍA APHA, AWWA, WPCF (1998). Standard Methods for Examination of Water and Waste Water. 20 ed. ICMSF (2000). Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis microbiológicos. 2 a ed. Versalovic, J., et al. (1991). Nucl. Acids Res. 19: 6823-6831. Zapater, J. (1975). Anales científicos de la UNALM 13: 45-57. 54 Session I SI-CP-17 Capacidad PGPR de cepas de Bacillus y Pseudomonas aisladas de la rizosfera de aguaymanto (Physalis peruviana L.). Cumpa, A. *, Flores, L., Chumpitaz, C., Ogata, K., Zúñiga, D. Laboratorio de Ecología Microbiana y Biotecnología Marino Tabusso, Dpto. Biología, Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima-Perú. www.lamolina.edu.pe/lmt. * [email protected] RESUMEN 176 cepas, tanto de Bacillus como de Pseudomonas fueron aisladas del suelo y la rizosfera del cultivo de aguaymanto (Physalis peruviana L.) proveniente de las regiones de Lima y Junín en el Perú. Se realizaron dos pruebas de caracterización PGPR: solubilización de fosfatos y antagonismos contra hongos. Además se realizó una prueba de emergencia en semillas de aguaymanto. Las cepas Ba60 y Pa15 promovieron de forma significativa la emergencia de las semillas de aguaymanto y la cepa Ba53 demostró una alto porcentaje de inhibición (59%) del hongo Fusarium sp. INTRODUCCIÓN Las bacterias promotoras de crecimiento vegetal o PGPR (por sus siglas en inglés) otorgan múltiples beneficios a las plantas con las que interactúan, tales como el incremento de la germinación, colonización de raíces, estimulación del crecimiento de las plantas, control biológico, inducción de la resistencia a patógenos y mejoramiento en la asimilación de agua y nutrientes (Barka et al., 2000). El objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad PGPR de las bacterias aisladas y determinar su efecto en la emergencia de semillas de aguaymanto. MATERIAL Y MÉTODOS Producción de ácido indol acético (Gordon y Webber, 1951) Solubilización de fosfatos bicálcico y tricálcico (Nautiyal, 1999) Pruebas de antagonismo (Ahmed et al., 2007 modificado). Prueba de emergencia (Zúñiga, 2012) RESULTADOS Y DISCUSIÓN Producción de ácido indol acético Se evaluaron en total 176 cepas: 71 cepas de Bacillus sp. y 105 cepas de Pseudomonas spp. aisladas de la rizosfera de aguaymanto. De todas las cepas, 86 (81.9%) Pseudomonas spp. y 58 (81%) Bacillus sp. produjeron AIA. La producción más alta la registraron las cepas Pa87 y Ba64, con valores de 54.31 y 44.56 ppm de ácido indol acético respectivamente. 55 Session I SI-CP-17 Solubilización de fosfatos bicálcico y tricálcico. Tabla 1. Porcentaje de cepas analizadas, distribuidas por género y según su capacidad para solubil izar fosfato Solubilización de fosfatos Medio Cepas No solubiliza Bajaa Mediab Altac Muy altad Bicálcico Tricálcico Pseudomonas 40% 27.62% 12.38% 20% 0% Bacillus 92.96% 7.04% 0% 0% 0% Pseudomonas 70.48% 24.77% 2.86% 0% 0% Bacillus 74.65% 23.94% 1.41% 0% 0% a b c d h: halo de solubilización medido en cm; h