Francielle Tramontini Gomes de Sousa Cardozo CARACTERIZAÇÃO [PDF]

Francielle Tramontini Gomes de Sousa Cardozo

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTI-HERPÉTICA E CITOTÓXICA DE POLISSACARÍDEOS DO FUNGO Agaricus brasiliensis Wasser

Tese submetida ao Programa de PósGraduação em Biotecnologia e Biociências da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito parcial para obtenção do título de Doutor e Biotecnologia e Biociências. Orientadora: Profa. Dra. Cláudia Maria Oliveira Simões

Florianópolis 2012

AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus que me permitiu a vida e me deu equilíbrio e força na realização de mais esta etapa. A todos os meus familiares do plano espiritual e terreno pelo incentivo, admiração e amor incondicionais. Ao meu esposo Luiz Fernando pelo amor e paciência. Aos professores Dr. Márcio Rossi e à professora Dra. Margarida Matos de Mendonça, orientadores da Dra. Carla Maísa Camelini, do Laboratório de Bioprocessos, pela importantíssima colaboração. Obrigada por gentilmente cederem as amostras estudadas neste trabalho. Ao professor Dr. Ricardo Nunes, à Dra Alessandra Mascarello e ao mestrando Marlon Cordeiro, da Central Analítica do Departamento de Química da UFSC, pela sulfatação e análises espectrométricas, termogravimétricas e elementar das amostras. Ao professor Dr. Flávio Henrique Reginatto, do Laboratório de Farmacognosia, CIF, CCS, UFSC, pelo auxílio nas análises de cromatografia líquida. À professora Dra. Lilian Sibelle Bernardes, do Laboratório de Química Farmacêutica, CIF, CCS, UFSC, pela ajuda na realização das cromatografias de camada delgada. Ao professor Dr. Fernão Castro Braga e à mestranda Bruna Gomes Malagoli, do Laboratório de Fitoquímica da UFMG, pelo auxílio nas análises químicas das amostras. À professora Dra Cláudia Simões, pelos ensinamentos e orientação. Aos meus amigos do Laboratório de Virologia Aplicada, por estarem sempre unidos ampliando a força do trabalho de cada um. Ao CNPq pela concessão das bolsas de doutorado e de estágio no exterior.

I would especially like to thank Dr Curtis Brandt for being supportive and encouraging and for his knowledgeable lessons. I am also thankful to all my colleagues from the Brandt’ Lab, especially to Inna Larsen for her valuable help and patience. A todos que contribuíram para o meu crescimento pessoal e profissional, cujos nomes não foram mencionados, meu sincero agradecimento. Francielle Tramontini Gomes de Sousa Cardozo

Tentei achar epígrafe mais adequada, mas esta continua sendo a minha predileta: “Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o sino que tine. Mesmo que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse amor, nada seria.” I Coríntios, 13.

Esta tese foi realizada no Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC, coordenado pela Profa. Dra. Cláudia Maria Oliveira Simões, com bolsa de doutorado do CNPq (Processo n° 143226/2008-8) e no Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Wisconsin, School of Medicine and Public Health, Madison, EUA, coordenado pelo Prof. Dr. Curtis R. Brandt, com bolsa de estágio sanduíche também do CNPq (Processo n°201264/2011-0).

RESUMO Agaricus brasiliensis (syn A. subrufescens) é um fungo basidiomiceto nativo no Brasil, que apresenta paredes celulares ricas em polissacarídeos, tais como β-(1→6)-(1→3)-glicanas nos corpos de frutificação e β-(1→2)-glico-β-(1→3)-mananas no micélio. Neste trabalho, estes polissacarídeos foram isolados e modificados quimicamente gerando seus respectivos derivados sulfatados. Os polissacarídeos nativos (FR e MI) e sulfatados (FR-S e-MI-S) foram caracterizados quimicamente e avaliados quanto as suas atividades citotóxica e anti-herpética in vitro. Uma vez que FR-S e MI-S apresentaram uma promissora ação anti-HSV-1 (cepas KOS e 29-R) e anti-HSV-2 (cepa 333), seu mecanismo de ação foi determinado. A atividade anti-herpética in vivo do MI-S também foi testada utilizandose modelos murinos de infecção ocular, cutânea e genital. FR-S e MI-S apresentaram duas novas bandas de absorção no espectro de infravermelho em 1253 e 810 cm-1, relacionados aos grupamentos C-S-O e S=O, respectivamente. A massa molecular do FR e MI foram estimados em 609 e 310 kDa, respectivamente. FR-S (127 kDa) e MI-S (86 kDa) apresentaram massas reduzidas provavelmente devido a hidrólise ocorrida durante a reação de sulfatação. FR-S e MI-S apresentaram ~14% de enxofre na análise elementar. Análise de RMN de 1H e 13C confirmaram as estruturas mencionadas anteriormente para FR e MI, sendo o FR-S totalmente sulfatado em C-4 e C-6, enquanto o MI-S parcialmente sulfatado em C-2, C-3, C-4 e C-6. Embora FR e MI não terem apresentado atividade, FR-S e MI-S exibiram promissora ação anti-HSV, com índices de seletividade (SI=CC50/EC50) superiores a 208. FR-S e MI-S não tiveram efeito virucida, mas significativamente inibiram a adsorção e penetração, provavelmente por interagir com glicoproteínas virais. Estudos de combinação revelaram que FR-S e MI-S atuam de forma sinérgica com o aciclovir. Além disso, MI-S inibiu a expressão das proteínas virais ICP27, UL42, gB e gD. Não foi observada toxicidade nos grupos de animais não infectados e tratados com MI-S. O tratamento tópico e oral com MI-S não foi efetivo na redução da doença ocular. A aplicação tópica de MI-S nas lesões cutâneas também não foi efetiva, mas os animais infectados cutaneamente e tratados oralmente com MI-S mostraram redução significativa dos escores da doença e cura acelerada das lesões pelo HSV-1 após o nono dia. A administração vaginal de MI-S (500 µg), 20 min antes do desafio viral, significantemente reduziu os escores da doença (dias 5 a 9), títulos virais (dias 1 e 3) e mortalidade em

comparação aos grupos controles. A sulfatação aumentou em 5X o efeito citotóxico do FR contra células tumorais A549, enquanto foi essencial para a atividade do MI. A combinação de fatores como o alto grau de substituição e a massa molecular relativamente menor teve impacto positivo sobre a atividade citotóxica do FR-S e MI-S. Os resultados mostram que o MI-S tem potencial a ser utilizado na redução da severidade das lesões cutâneas pelo HSV-1 e principalmente como um microbicida evitando a transmissão sexual das infecções genitais pelo HSV-2. Ainda, os resultados promissores obtidos na triagem preliminar estimulam novos estudos para avaliação do mecanismo da atividade citotóxica do MI-S e FR-S. Palavras-chave: Agaricus brasiliensis; polissacarídeos sulfatados; análise química; atividade anti-HSV in vitro; Herpes simplex virus; mecanismo de ação; atividade anti-HSV in vivo; atividade citotóxica; células tumorais A549.

ABSTRACT Agaricus brasiliensis (syn A. subrufescens) is a basidiomycete fungus native to Brazil, which presents cell-wall rich polysaccharides, such as β-(1→6)-(1→3)-glucans in the fruiting bodies and β-(1→2)-gluco-β(1→3)-mannan in the mycelia. Herein, these polysaccharides were isolated and chemically modified to produce their sulfated derivatives. The native (FR and MI) and sulfated polysaccharides (FR-S and MI-S) were chemically characterized and had their in vitro antiherpetic and cytotoxic activities evaluated. Since FR-S and MI-S presented promising anti-HSV-1 (KOS and 29-R strain) and anti-HSV-2 (strain 333) activities, their mechanism of action was determined. MI-S was also tested for its in vivo antiherpetic activity in the ocular, cutaneous, and genital murine models. FR-S and MI-S presented two new absorption bands at 1 253 and 810 cm-1, related to S=O and C-S-O sulfate groups, respectively, in the infrared spectra. The molecular weight (Mw) of FR and MI was estimated to be 609 and 310 kDa, respectively. FR-S (127 kDa) and MI-S (86 kDa) presented lower Mw, probably due to hydrolysis occurred during the sulfation reaction. FR-S and MI-S presented ~14% of sulfur content in elemental analysis. 1H and 13C NMR analysis confirmed the aforementioned structures for FR and MI, being FR-S fully sulfated at C-4 and C-6 while MI-S partially sulfated at C-2, C-3, C-4, and C-6. Although FR and MI were not active, FR-S and MI-S presented promising anti-HSV activity with with selectivity indices (SI = CC50/EC50) higher than 208. FR-S and MI-S had no virucidal effect, but significantly inhibited viral attachment and penetration, probably by interacting with viral glycoproteins. Combination studies revealed that FR-S and MI-S act synergistically with acyclovir. MI-S was also shown to inhibit the expression of ICP27, UL42, gB, and gD viral proteins. No toxicity was observed in the uninfected groups of animals treated with MI-S. The MI-S topical and oral treatments were not effective in reducing ocular disease. Topical application of MI-S on skin lesions was also not effective, but cutaneously infected mice treated orally with MI-S showed significantly reduced disease scores and accelerated healing of HSV-1 lesions after day 9. Single vaginal administration of 500 µg of MI-S 20 min before viral challenge, significantly reduced the mean disease scores (days 5 to 9), viral titers (days 1 and 3), and mortality in comparison to the control groups. Sulfation enhanced FR cytotoxic effect against A549 tumour cell by five times while was essential for the MI activity. Combination of high degree of substitution and relatively low molecular weight had a

positive impact on the cytotoxic activity of FR-S and MI-S. These results show that MI-S may be potentially useful as an oral agent to reduce the severity of HSV-1 cutaneous lesions and more importantly as a microbicide to block sexual transmission of HSV-2 genital infections. Still, the promising results in the preliminary screening stimulate further studies regarding the mechanism of the cytotoxic activity of MI-S and FR-S. Keywords: Agaricus brasiliensis; sulfated polysaccharides; chemical analysis; in vitro anti-HSV activity; Herpes simplex virus; mechanism of action; in vivo anti-HSV activity; cytotoxic activity; A549 tumor cells.

LISTA DE QUADROS Quadro 1: Descrição de sinergismo e antagonismo em estudos de combinação de substâncias, através do método de determinação do Índice Combinatório (IC), de acordo com Chou (2006)...................... 35

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Morfologia do herpesvirus. (Esquerda) Reconstrução de um capsídeo do Herpes simplex virus (HSV-1) gerado a partir de imagens de microscópio crio-eletrônico, com hexons mostrados em azul e pentons em vermelho e o triplex em verde. (Centro) Representação esquemática de um vírion com diâmetros em nm. (G) genoma, (C) capsídeo, (T) tegumento e (E) envelope. (Direita) Imagem de microscópio crio-eletrônico de um virion do HSV-1. Fonte: (KING, 2009........................................................................................................26 Figura 2: A) Corpos de frutificação e B) micélio em meio líquido do fungo de Agaricus brasiliensis Autora: Carla Maísa Camelini..............38 Figura 3: Diagrama mostrando as diferenças morfológicas entre os enterócitos e células M. O transporte transepitelial de compostos de baixa massa molecular através dos enterócito e de alta massa molecular através das células M também está representado. (Fonte: adapatado de Liang et al., (2001)..................................................................................42 Figura 4: Estrutura do FR (A), uma β-(1→6)-(1→3)-glicana, e seu derivado sulfatado FR-S (B). Em azul e vermelho os sítios de substituição total e parcial, respectivamente........................................152 Figura 5: Estrutura do MI (A), uma β-(1→2)-glico-β-(1→3)-manana, e seu derivado sulfatado MI-S (B). Em azul e vermelho os sítios de substituição total e parcial, respectivamente........................................153

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A549: linhagem de células de tumor pulmonar humano AIDS: síndrome da imunodeficiência adquirida ATCC: American Type Culture Collection CC50: concentração citotóxica a 50%, concentração que reduz a viabilidade celular em 50% CCD: cromatografia de camada delgada CE50, EC50: concentração efetiva a 50% CIF: Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFSC) CLAE-UV: cromatografia líquida de alta eficiência com detector por ultravioleta D2O: água deuterada Da: Dalton(s) DEX-S: sulfato de dextrana DMSO: dimetilsulfóxido DS: grau de substituição (do inglês, degree of substitution) dsDNA: DNA dupla fita (do inglês, double-stranded DNA) DST: doença sexualmente transmissível DTGA: Análise Termogravimétrica Diferencial (do inglês, Differential Thermogravimetric Analysis) FDA: Food and Drug Administration (Estados Unidos) FR: polissacarídeo obtido da frutificação de A. brasiliensis FR-S: derivado sulfatado do polissacarídeo obtido da frutificação do A. brasiliensis GAG(s): glicosaminoglicana(s) gB, gC, gD, gH, gI, gJ, gK, gL, gM, gN: glicoproteína B, C, D, H, I, J, K, L, M e N, respectivamente. GS: grau de substituição HEP: heparina HIV: vírus da imunodeficiência humana HSV: Herpes simplex virus HSV-1: Herpes simplex virus tipo 1 HSV-2: Herpes simplex virus tipo 2 HVEM: Herpesvirus Entry Mediator, mediador da entrada dos herpesvírus IC: índice combinatório ICP: Infected cell protein(s), proteínas expressas em células infectadas por HSV. IS ou SI: índice de seletividade kDa: kilo Dalton(s)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS (cont.) kpb: kilo pares de base LCME: Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (UFSC) MEM: Meio Essencial Mínimo, Minimal Essential Medium MEV: microscopia eletrônica de varredura, scanning electron microscopy MI: polissacarídeo obtido do micélio do Agaricus brasiliensis MI-S: derivado sulfatado do polissacarídeo miceliano do Agaricus brasiliensis MIP: Departamento de Microbiologia Imunologia e Parasitologia MM: massa molecular MTT: brometo de [3 (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difenil tetrazólio], sal de tetrazólio Mw: molecular weight, massa molecular nm: nanômetro(s) NMR: Nuclear Magnetic Resonance p.i.: pós-infecção, post-infection PBS: Phosphate-buffered saline, solução de tampão fosfato PSA: mistura de penicilina, estreptomicina e anfotericina B RMN: Ressonância Magnética Nuclear SEM: scanning electron microscopy, microscopia eletrônica de varredura SDS: dodecil sulfato de sódio, do inglês Sodium Dodecyl Sulfate SDS-PAGE: gel de eletroforese de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (do inglês, Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis SFB, BFS: soro fetal bovino, bovine fetal serum TG: Termogravimetria TGA: Análise Termogravimétrica (do inglês, Thermogravimetric Analysis) Tmax: temperatura(s) máxima(s) de degradação UFP/ml: unidades formadoras de placas por mililitros UFP, PFU: unidades formadoras de placas, plaque forming units VERO: linhagem celular de fibroblastos de rins do macaco verde da África (Cercopithecus aethiops) VP: virion polypeptides, polipeptídeos virais X g: gravidade(s), medida da força de uma centrífuga

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................ 23 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................ 25 2.1 Herpes vírus .................................................................................... 25 2.2 Infecção herpética ........................................................................... 26 2.3 Dados epidemiológicos................................................................... 27 2.4 Herpes e HIV .................................................................................. 28 2.5 Ciclo de multiplicação dos HSV..................................................... 29 2.6 Desenvolvimento de fármacos antivirais ........................................ 32 2.6.1 Avaliação da atividade antiviral in vitro ....................................... 33 2.6.2 Sinergismo .................................................................................... 34 2.7 Fungos que produzem cogumelos .................................................. 35 2.8 Agaricus brasiliensis ...................................................................... 37 2.9 Polissacarídeos ............................................................................... 39 2.9.1 Absorção intestinal de macromoléculas ........................................ 41 2.9.2 Glicanas ........................................................................................ 42 2.10 Câncer ........................................................................................... 43 2.10.1 Cancer de pulmão........................................................................ 43 2.10.2 Avaliação do potencial anticâncer .............................................. 44 2.10.3 Polissacarídeos com atividade citotóxica ................................... 45 3. OBJETIVOS..................................................................................... 47 3.1 Objetivo geral .................................................................................. 47 3.2 Objetivos específicos ....................................................................... 47 CAPÍTULO I: CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE POLISSACARÍDEOS DO FUNGO Agaricus brasiliensis ............................................................. 49 1. APRESENTAÇÃO ............................................................................ 51 2. ARTIGO SUBMETIDO PARA AVALIAÇÃO AO INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES ........................................................................ 53

CAPÍTULO II: AVALIAÇÃO DO MECANISMO DA ATIVIDADE ANTI-HERPÉTICA DO DERIVADO SULFATADO DO POLISSACARÍDEO OBTIDO DOS CORPOS DE FRUTIFICAÇÃO DO FUNGO Agaricus brasiliensis .......................83 1. APRESENTAÇÃO.............................................................................85 2. ARTIGO A SER SUBMETIDO PARA AVALIAÇÃO AO PERIODICO LETTERS OF APPLIED MICROBIOLOGY .................87 CAPÍTULO III: AVALIAÇÃO DO MECANISMO DA ATIVIDADE ANTI-HERPÉTICA DO DERIVADO SULFATADO DO POLISSACARÍDEO MICELIANO DO FUNGO Agaricus brasiliensis ...........................................................................................109 1. APRESENTAÇÃO...........................................................................111 2. ARTIGO PUBLICADO NO PERIÓDICO ANTIVIRAL RESEARCH .........................................................................................113 CAPÍTULO IV: AVALIAÇÃO IN VIVO DA ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA DO DERIVADO SULFATADO DO POLISSACARÍDEO MICELIANO DO FUNGO Agaricus brasiliensis ...........................................................................................121 1. APRESENTAÇÃO...........................................................................123 2. ARTIGO A SER SUBMETIDO PARA AVALIAÇÃO AO PERIÓDICO ANTIVIRAL RESEARCH ...............................................125 4. DISCUSSÃO GERAL ....................................................................149 5. CONCLUSÃO.................................................................................161 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS .........................................................163 REFERÊNCIAS .................................................................................165 APÊNDICE A - OUTROS ARTIGOS CORRESPONDENTES ÀS ATIVIDADES REALIZADAS NO PERÍODO

Introdução 23

1. INTRODUÇÃO As fontes naturais continuam sendo a principal base para o desenvolvimento de fármacos para o tratamento de várias doenças humanas. Por exemplo, 74,9% dos fármacos utilizados no tratamento do câncer, disponibilizados no mercado entre os anos de 1981 a 2010, foram derivados ou inspirados em produtos naturais. De 270 fármacos anti-infecciosos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDAEUA), entre os anos de 1981 e 2010, 109 são antivirais, dos quais 53 foram desenvolvidos com base em protótipos naturais. Alguns deles (4) foram modificados sinteticamente para melhorar suas atividades farmacológicas e/ou sua biodisponibilidade (NEWMAN; CRAGG, 2012). Estes dados mostram que os estudos envolvendo tais fontes, aliados à tecnologia de modificação química de biomoléculas, devem ser incentivados. Dentre mais de 1 milhão de espécies de fungos existentes na natureza, 14 mil estão entre os que produzem cogumelos durante o seu ciclo de vida. Muitas de suas atividades farmacológicas são atribuídas aos polissacarídeos, principais componentes da parede celular do micélio, do escleródio (ambos da fase vegetativa) e da frutificação (fase reprodutiva), exercendo funções estruturais e protetoras (LINDEQUIST et al., 2005). Estes carboidratos podem ser constituídos por um único tipo de açúcar, sendo denominados homopolímeros, como as β-glicanas, ou por diferentes monômeros, denominados heteropolímeros, como as glicomananas. Tais compostos apresentam estruturas altamente diversas cuja variabilidade se dá pela constituição monossacarídica, estereoquímica e posição das ligações glicosídicas, ramificações, massa molecular (MM) e substituintes. Sabe-se que diferenças estruturais estão relacionadas com ações farmacológicas distintas (DA SILVA et al., 2006) e, sendo assim, a caracterização química destes compostos é importante para o entendimento das suas relações estrutura-atividade. Os vírus herpéticos dos tipos 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) são neurotrópicos e causam infecções latentes crônicas que podem ter episódios de recorrência. Estes fatores, além da disseminação e gravidade da doença em pacientes imunocomprometidos e os efeitos adversos dos fármacos atualmente disponíveis, têm limitado a cura e a eficácia do tratamento do herpes. Consequentemente, a busca por novos agentes anti-herpéticos eficazes, de baixa toxicidade e com características químicas e mecanismo de ação diferenciado dos antivirais atuais, é necessária e relevante (BRADY; BERNSTEIN, 2004).

24 Introdução

A atividade antiviral contra vírus humanos e animais tem sido bastante descrita para diversos polissacarídeos sulfatados de origem semissintética ou de ocorrência natural, obtidos de diferentes espécies de algas marinhas, bactérias, fungos e animais (GHOSH et al., 2009). Particularmente, glicanas obtidas de fungos foram sulfatadas quimicamente para aumentar a sua solubilidade e modificar suas propriedades farmacológicas, incluindo a ação antiviral (ZHANG et al., 2004). Agaricus brasiliensis Wasser (syn A. subrufescens Kerrigan), popularmente conhecido como cogumelo-de-deus, cogumelo-do-sol e himematsutake, é nativo do Brasil e distribuído nas Américas. Muitas das atividades farmacológicas relatadas para esta espécie, tais como imunomodulatória (KIM et al., 2005), antitumoral (NIU et al., 2009), antigenotóxica (ANGELI et al., 2009) e antiviral (CARDOZO et al., 2011), têm sido relacionadas à presença de polissacarídeos. Sendo os polissacarídeos metabólitos primários de fungos, a sua utilização depende da produção em larga escala de biomassa que pode ser obtida das frutificações ou do micélio. Neste contexto, a produção de micélio em substrato líquido em biorreator constitui uma alternativa ao cultivo dos corpos de frutificação, pois permite um maior controle do processo e o aumento da escala produtiva do fungo, além da redução do tempo para obtenção de biomassa (CRUEGER; CRUEGER, 1990). A produção de biomassa miceliana e o isolamento de polissacarídeos, tanto dos cogumelos quanto do micélio de A. brasiliensis, têm sido realizados pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Bioprocessos, MIP, CCB, UFSC1. Tendo em vista a necessidade de estudos complementares que verifiquem a potencial aplicabilidade farmacêutica destes compostos, o objetivo desta tese foi realizar a caracterização química e a avaliação das atividades citotóxica e anti-herpética in vitro e in vivo de polissacarídeos obtidos da frutificação e do micélio deste fungo, bem como de seus derivados sulfatados.

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O material de estudo desta tese foi gentilmente cedido pela Dra Carla Maísa Camelini, sob a orientação da Profa. Dra. Margarida Matos de Mendonça e do Prof. Dr. Márcio José Rossi (Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências da UFSC), a quem agradecemos esta frutífera colaboração.

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2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Herpes vírus Os Herpes simplex virus (HSV) pertencentes à ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae incluem dois sorotipos: o Herpesvirus humano 12 (HHV-1) ou Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) e o Herpesvirus humano 22 (HHV-2) ou Herpes simplex tipo 2 (HSV-2) (DAVISON, 2010). Os vírions ou partículas infecciosas dos HSV possuem 120-200 nm de diâmetro e são compostos por núcleo, capsídeo, tegumento e envelope (Figura 1). O núcleo consiste de genoma viral empacotado como uma molécula única de DNA dupla fita (dsDNA) linear, embalado em uma matriz de líquido cristalino que preenche todo o volume interno do nucleocapsídeo ou core. O capsídeo, arranjado em simetria icosaédrica com número de triangulação (T=16) e diâmetro externo de aproximadamente 125 nm, é formado por 162 capsômeros (150 hexâmeros e 12 pentâmeros). O tegumento, um conjunto amorfo de diferentes proteínas que podem variar em abundância, apresenta simetria apenas na região imediatamente adjacente ao capsídeo. O envelope ou membrana viral é formado por uma bicamada lipídica, na qual glicoproteínas de superfície estão ancoradas desempenhando funções importantes nas diversas etapas da infecção viral. Os genomas do HSV-1 (152 kpb) e do HSV-2 (155 Kpb) codificam no mínimo 84 polipeptídios diferentes e compartilham, aproximadamente, 84% de homologia da sequencia genômica. Estes dois tipos virais podem ser distinguidos pela composição do DNA; no entanto, diversidades antigênicas e propriedades biológicas também servem como métodos de diferenciação (FLINT et al., 2000; GUPTA et al., 2007; KING, 2009; LUPI et al., 2000; ROIZMAN et al., 2007; WHITE; FENNER, 1994; WHITLEY; ROIZMAN, 2001).

2 Esta é a nomenclatura taxonômica formal para a espécie do vírus, porém a designação Herpes simplex virus é a mais comumente usada.

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Figura 1: Morfologia do herpesvirus. (Esquerda) Reconstrução de um capsídeo do Herpes simplex virus (HSV-1) gerado a partir de imagens de microscópio crio-eletrônico, com hexons mostrados em azul e pentons em vermelho e o triplex em verde. (Centro) Representação esquemática de um vírion com diâmetros em nm. (G) genoma, (C) capsídeo, (T) tegumento e (E) envelope. (Direita) Imagem de microscópio crio-eletrônico de um virion do HSV-1. Fonte: (KING, 2009) 2.2 Infecção herpética Os HSV causam desde infecções assintomáticas ou com lesões brandas de pele e mucosas (herpes labial, gengivomastite e herpes genital) até doenças graves, tais como a queratite herpética e aquelas com comprometimento do sistema nervoso central (SNC), como a encefalite aguda e a meningite necrosante, além de produzir infecções fatais em pacientes com deficiências imunes (LUPI et al., 2000; WHITE; FENNER, 1994). Apesar de serem transmitidos por diferentes rotas e usualmente envolverem áreas diferentes do corpo, há uma sobreposição na epidemiologia e manifestações clínicas destes vírus. Excluindo-se os casos resultantes da auto inoculação, transmissão vertical ou contato oro-genital, a transmissão dos HSV depende do contato pessoal direto entre um indivíduo soronegativo susceptível e um indivíduo soropositivo, que excreta o vírus sintomaticamente ou assintomaticamente na saliva ou em outras secreções muco cutâneas (genital, anal ou ocular). Um indivíduo naturalmente infectado pode ainda ser reinfectado, superinfectado ou auto inoculado através de uma infecção assintomática ou ativa (FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; HYLAND; LAMEY, 1999). O HSV-1 afeta principalmente a boca, lábios, olhos e locais acima da cintura em 75% dos casos. Em geral, a infecção oral causada

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pelo HSV-1 é mais frequente do que pelo HSV-2; já a infecção genital pelo HSV-2 ocorre com maior constância do que pelo HSV-1 (HYLAND; LAMEY, 1999; LUPI et al., 2000). Porém, este padrão está mudando nos últimos anos, conforme alguns estudos que apontam o HSV-1 como maior causador em infecções herpéticas genitais do que o HSV-2 (BUXBAUM et al., 2003; PEÑA et al., 2010; PEREIRA et al., 2012; ROBERTS et al., 2003). Para a maioria dos pacientes imunocompetentes infectados (aproximadamente 90%), as infecções pelos HSV são assintomáticas ou os sintomas são brandos. Contudo, as lesões genitais e a infiltração local de linfócitos, provocada pela infecção herpética, aumentam em três vezes o risco de adquirir o vírus da imunodeficiência humana (HIV) numa relação sexual. O herpes está entre as mais frequentes infecções virais em pacientes com AIDS. Além disso, indivíduos imunocomprometidos e neonatos são os que apresentam maior incidência de quadros clínicos severos, com morbidade e mortalidade significativas (FATAHZADEH; SCHWARTZ, 2007; GUPTA et al., 2007; VAN DE PERRE et al., 2008). 2.3 Dados epidemiológicos O herpes genital é umas das DSTs mais frequentes em todo o mundo, sendo a causa mais comum de ulcerações da genitália de origem infecciosa, com estimativa de 640 mil novos casos diagnosticados anualmente. Estudos epidemiológicos indicam a idade, sexo, etnia, status socioeconômico, nível educacional, uso de preservativo, número de parceiros sexuais e histórico de DSTs prévias como os principais parâmetros que podem estar relacionados ao risco de aquisição da doença (LUPI, 2011; PEREIRA et al., 2012). Um estudo transversal realizado no Brasil entre 1996 e 1997 com 1.090 indivíduos da população geral com idade entre um e 40 anos mostrou soroprevalência de 67,2% e 11,3% para HSV-1 e HSV-2, respectivamente. Este estudo também revelou que não houve diferença quanto ao sexo e as soroprevalências aumentaram com a idade, sendo que para o HSV-2 o maior aumento ocorreu na adolescência e entre adultos jovens. Indivíduos soropositivos para HSV-1 apresentaram maior risco de serem positivos para HSV-2 (15,7%), quando comparados com os negativos para HSV-1 (4,7%). Além disso, o histórico de doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) aumentou significativamente a probabilidade de soropositividade para HSV-2 (CLEMENS; FARHAT, 2010).

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A exposição ao HSV-1 ocorre de maneira precoce, conforme o estudo realizado por Cowan e colaboradores (2003), no qual a idade média em que a soroprevalência atingiu 50% da população infantil brasileira avaliada foi de sete anos. O mesmo estudo mostrou que o Brasil apresentou 2,4% de soroprevalência para o HSV-2 em crianças, semelhante à da Índia com 2,2%. 2.4 Herpes e HIV O herpes genital é frequentemente associado com a infecção pelo HIV. Mecanismos moleculares, através da indução da replicação do HIV, celulares, pelo recrutamento de linfócitos T ativados para o local na resposta imunológica à infecção herpética, e teciduais, pelo rompimento do epitélio devido às ulcerações genitais, são descritos como facilitadores da transmissão do HIV. Adicionalmente, observa-se que os pacientes HSV-2/HIV coinfectados apresentam sinais clínicos mais severos com aumento da morbidade e mortalidade (REYNOLDS; QUINN, 2005). A avaliação de anticorpos anti-HSV-2 em populações de todo o mundo mostram uma alta soroprevalência em pacientes com HIV, com valores de 63–77% nos Estados Unidos, 81% no Reino Unido e 88% na China (LUPI, 2011). Uma análise soroepidemiológica, realizada no Brasil, em cem pacientes HIV positivos, demonstrou a soroprevalência de 73% para o HSV-2. Este estudo também evidenciou que uma população de comportamento sexual promíscuo, soronegativa para o HIV, teve 41,9% de prevalência para este vírus. Outro estudo realizado entre 2001-2002, em Niterói-RJ, de pacientes HIV-positivos revelou uma soroprevalência para o HSV-2 de 53%, dos quais 21,8% apresentaram histórico da doença (herpes genital) (SANTOS et al., 2006). Já um estudo realizado no Rio de Janeiro, durante o ano de 1994, demonstrou que uma população de doadores de sangue voluntários, de comportamento sexual não promíscuo, apresentou soroprevalência para o HSV-2 de 29,1% (LUPI et al., 2000; SANTOS et al., 1996). Desta maneira, a multiplicidade de parceiros sexuais e a co-infecção com o HIV estão correlacionadas com o aumento na soroprevalência do HSV-2 (LUPI et al., 2000). Vale ainda ressaltar que o herpes é considerado uma epidemia silenciosa, pois, apesar de apresentar alta soroprevalência, as manifestações clínicas das doenças relacionadas tem baixa incidência e são pouco diagnosticadas. Considerando o total de pacientes

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sintomáticos e assintomáticos HSV-2 positivos, estima-se que as chances de adquirir HIV aumentam em cinco vezes, sendo a infecção subclínica pelo HSV-2 também um importante fator para o aumento da suscetibilidade à infecção pelo HIV (REYNOLDS; QUINN, 2005). 2.5 Ciclo de multiplicação dos HSV Estudos realizados com virions purificados de HSV-1 e HSV-2 sugeriram que eles contêm mais de 30 proteínas distintas, as quais são designadas de polipeptídeos virais (VP, do inglês virion polypeptides). Destas, estão descritas 12 glicoproteínas de superfície (gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL, gM e gN), que estão ancoradas na membrana dos vírus ou presentes no citoplasma das células infectadas, e desempenham funções importantes nas diversas etapas da infecção viral. Por exemplo, as gC, gB, gD, gH, e gL são responsáveis pela adsorção do vírus às membranas celulares, e as quatro últimas são exigidas na fusão. Além disso, as glicoproteínas são capazes de induzir a resposta imune no hospedeiro infectado, sendo duas delas (gB ou gD, ou ambas) usadas na pesquisa de vacinas (HELDWEIN et al., 2006; ROIZMAN et al., 2007). O ciclo de multiplicação viral acontece em várias etapas. Primeiramente, as partículas virais interagem com as membranas celulares, adsorvendo e posteriormente penetrando nas células. Uma vez no citoplasma, seguem-se as etapas de transcrição, tradução e replicação do genoma viral, que culminam com a formação de novas partículas que serão liberadas ao espaço intercelular e infectarão as células adjacentes (FLINT et al., 2000). Entrada ou penetração: é um processo complexo, envolvendo cinco das 12 glicoproteínas de superfície. Pode ser dividido em três fases: adsorção, ligação e fusão. O contato inicial do HSV com uma célula se inicia pela interação do virion com as cadeias de glicosaminoglicanas (GAG) das proteoglicanas de superfície celular. Na adsorção, o sulfato de heparana é preferencialmente a molécula que interage com as glicoproteínas virais gC e/ou gB. Apesar desta interação aumentar significativamente a eficiência da infecção por HSV, ela não é absolutamente essencial e irreversível, ao menos pelo que foi observado in vitro, pois mutantes que não expressam a gC não perderam a capacidade de infectar células em cultura (BENDER et al., 2005). O sulfato de heparana é um tipo de GAG expressa na maioria das células fixadas em tecidos, diferentemente do que ocorre nas células circulantes, como as do sistema imune. É uma molécula composta por dissacarídeos de unidades repetidas de N-acetil-glicosamina ligada ao

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ácido glicurônico e modificada, em algumas regiões específicas da cadeia, por uma sequência de reações enzimáticas, incluindo acetilação de glicosaminas, sulfatação de grupamentos amino, epimerização do ácido glicurônico a ácido idurônico, e O-sulfatação da hidroxila na posição 2 do ácido idurônico e das hidroxilas nas posições 6 e 3 do amino açúcar. Estas reações geram sítios de ligação a proteínas (aproximadamente 6-12 resíduos) com maior especificidade. O sítio de ligação para a gD, por exemplo, é gerado pela ação de 3-Osulfotransferases. Os sítios de ligação à gB ou gC ainda não foram determinados; no entanto, sabe-se que gB e gC se ligam em diferentes estruturas e que a ligação de gC é divergente entre os tipos 1 e 2 do HSV, sendo que a gC é a principal mediadora da adsorção do HSV-1, enquanto a gB é preponderante na adsorção do HSV-2 (AGUILAR et al., 2006; SPEAR, 2004). Após a adsorção dos HSV nas células, ocorre a etapa de ligação, envolvendo a interação da gD com um dos seus receptores, que incluem nectina-1 e nectina-2, o mediador específico da entrada dos herpesvírus [Herpesvirus Entry Mediator (HVEM)], ou o sulfato de heparana, especificamente modificado (BENDER et al., 2005; HELDWEIN et al., 2006). O HVEM é considerado um membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral. Também conhecido como HveA, ATAR, TR2 ou TNFRSF-14, é expresso em uma variedade de tecidos, incluindo linfócitos T e B, outros leucócitos, células epiteliais, endoteliais e fibroblastos e, provavelmente, não está presente em neurônios (SPEAR, 2004). Entre as cinco glicoproteínas que atuam na penetração, somente a gD é capaz de ligar-se a esse receptor, permitindo a entrada do vírus em células nas quais ele é expresso (WHITBECK et al., 1997). As nectinas-1 e 2 são membros da superfamília de receptores de imunoglobulinas, sendo expressas em vários tecidos e tipos celulares, incluindo células epiteliais, fibroblastos e neurônios. São moléculas de adesão colocalizadas com caderinas, junções aderentes e outras estruturas de adesão, que dimerizadas na membrana de uma célula, irão interagir com outro dímero de nectinas da célula vizinha ou com a gD do HSV (SPEAR, 2004). O HSV-1 e o HSV-2 divergem na preferência pelos receptores, apesar do HVEM e da nectina-1 serem importantes receptores de entrada para ambos os sorotipos. A nectina-2 é inativa para HSV-1 e tem uma fraca atividade na entrada do HSV-2; a recíproca acontece para o sulfato de heparana modificado (SPEAR, 2004).

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A ligação da gD a um dos seus receptores é mais estável e provoca uma mudança conformacional na sua cadeia polipeptídica, liberando o segmento carboxi-terminal. Este, por sua vez, pode interagir com a gB, ou com o complexo gH/gL, desencadeando rearranjos moleculares e, finalmente, a fusão. Os mecanismos de atuação da gB e da gH/gL são desconhecidos. Suas estruturas são conservadas entre todos os membros da família dos herpesvírus, ao contrário da gC e da gD, conservadas apenas entre os α- herpesvírus. Tanto a gB quanto o heterodímero gH/gL são necessários para a entrada do vírus na célula, e qualquer um ou ambos, presumivelmente, recebem o sinal da gD e sofrem alterações conformacionais (HELDWEIN et al., 2006; SPEAR, 2004). Um estudo realizado por Bender et al. (2005) mostrou que mutantes que não expressam a gC exibem redução na adsorção, porém a infecciosidade viral é mantida. Já os vírus privados da gB não são capazes de penetrar nas células-alvo. Por isso, a gC é considerada uma glicoproteína não essencial de entrada, ao contrário da gB, que é essencial. Após a fusão do envelope viral com a membrana celular ocorre a liberação do nucleocapsídeo e proteínas do tegumento no citoplasma da célula hospedeira (ROIZMAN et al., 2007). Após entrar na célula, o nucleocapsídeo é transportado via microtúbulos até as proximidades do núcleo, onde o capsídeo vazio é deixado no citoplasma. Em seguida, o DNA penetra no núcleo, através dos poros nucleares, onde irá ocorrer a transcrição, replicação e montagem de novos capsídeos (MIRANDA, 2002). Dependendo do tipo de célula, a rota de entrada dos HSV pode variar. Uma segunda forma de entrada, menos comum, chamada de forma secundária, envolvendo a endocitose do capsídeo envelopado, foi relatada para os HSV (NICOLA; STRAUS, 2004). Transcrição, tradução e replicação: o processo de transcrição, no qual a RNA polimerase celular sintetiza RNAm a partir do DNA viral, e a síntese proteica acontecem de forma coordenada, em três fases: imediata, precoce, e tardia. Após a ativação da maquinaria transcricional pelas proteínas da fase imediata inicia-se a fase precoce. Nesta fase, são sintetizadas as enzimas necessárias para a replicação do genoma viral, sendo a DNA polimerase a principal delas. Com o acúmulo de DNA viral, ocorre a sinalização para que os genes tardios sejam transcritos, gerando proteínas estruturais do capsídeo e do tegumento, e as glicoproteínas do envelope viral (BOEHMER; LEHMAN, 1997; ROIZMAN et al., 2007).

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Sabe-se que durante a infecção produtiva ocasionada pelos vírus herpéticos, mais de 84 diferentes proteínas são expressas de uma forma coordenada e regulada em três fases sequenciais (COLBERE, 1975; ROIZMAN et al., 2007), a saber: • Fase imediata (α): indutores transcricionais cruciais na indução e regulação do ciclo de replicação viral, sendo sintetizadas em torno de 2 - 3 h pós-infecção (p.i.). Exemplos das proteínas α: Infected cell proteins (ICPs) 0, 4, 22, 27, 47 e US1.5; • Fase precoce (β): proteínas que promovem a replicação do DNA viral e a ativação da fase γ, com pico de expressão entre 5 - 7 h p.i. As proteínas de fase β incluem as enzimas que são requeridas para a síntese do genoma viral: DNA polimerase viral, proteína de ligação de DNA fita simples (ICP8), DNA helicase-primase, proteína UL9 e as enzimas necessárias para o metabolismo do ácido nucléico viral (ribonucleotídeo redutase, timidina quinase, dUTPase, uracil DNA glicosilase, etc); • Fase tardia (γ): proteínas estruturais do nucleocapsídeo e todas as outras que formarão os vírions, como as glicoproteínas do envelope, com pico de expressão em torno de 12 h p.i. Exemplo das proteínas γ: gB, gC, gD e gE. Montagem e liberação dos vírions: as proteínas do capsídeo são transportadas para o núcleo, onde são reunidas em pró-capsídeos vazios ou preenchidos com DNA viral. Os nucleocapsídeos ligam-se em porções modificadas da membrana nuclear interna, que contém glicoproteínas virais, e são temporariamente envelopados e liberados no espaço nuclear intermembranário. Posteriormente, eles são conduzidos ao citoplasma, onde ocorre a adição das proteínas do tegumento e sua introdução em vesículas derivadas do complexo de Golgi, nas quais também há glicoproteínas virais inseridas. Após o envelopamento, os vírions infecciosos migram para a superfície celular, fundem-se com a membrana citoplasmática e, finalmente, são liberados no espaço extracelular (JOHNSON; HUBERT, 2002; METTENLEITER, 2002; ROIZMAN et al., 2007). 2.6 Desenvolvimento de fármacos antivirais O desenvolvimento de fármacos antivirais teve início na década de 50. Entre as principais razões das dificuldades encontradas nesta área

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específica está a natureza intrínseca dos vírus, os quais são totalmente dependentes da maquinaria das células infectadas para sua multiplicação e sobrevivência. Dessa maneira, fármacos que inibem a replicação viral ou provocam a inativação das partículas infecciosas virais, causam também toxicidade às células hospedeiras. O compromisso com a especificidade pelas células infectadas, a eficácia e um baixo nível de toxicidade são, portanto, critérios indispensáveis para a seleção de novos agentes antivirais (JONES, 1998; WHITE; FENNER, 1994). Posteriormente, o entendimento da replicação viral em nível molecular conduziu ao desenvolvimento de novos fármacos, que interferem em etapas específicas do ciclo de multiplicação dos vírus. Um ótimo exemplo desse tipo de atuação foi a introdução na terapêutica, no final da década de 70, do aciclovir, que atua de forma seletiva sobre os HSV, sendo ativado por uma enzima, a timidina quinase, que é essencial para a sua replicação (ELION et al., 1977). O atual arsenal quimioterápico para infecções virais consiste em aproximadamente 50 fármacos licenciados pelas autoridades governamentais. A maioria foi aprovada nos últimos anos, sendo que metade deles é utilizada para o tratamento da infecção pelo HIV. Os demais antivirais são utilizados contra os vírus das hepatites B e C, vírus influenza, e vírus herpéticos, incluindo nesse último grupo o vírus da varicela zoster, o citomegalovírus e os vírus herpes simplex (DE CLERCQ, 2010; ROTTINGHAUS; WHITLEY, 2007). Os fármacos com atividades clinicamente relevantes e aprovados pelo FDA para o tratamento de infecções pelos HSV são: aciclovir, valaciclovir, penciclovir, fanciclovir, idoxuridina, trifluridina, brivudina, vidarabina, cidofovir e foscarnet, que inibem a replicação viral; e docosanol, que é um inibidor de entrada dos vírions nas células, porém. Contudo, eles apresentam efeitos adversos e toxicidade, além de já existirem cepas virais resistentes (MAMIDYALA; FIRESTINE, 2006; ROTTINGHAUS; WHITLEY, 2007). Portanto, a pesquisa de novos agentes anti-herpéticos eficazes, com mecanismos de ação diferenciados e com efeitos deletérios mínimos, é muito importante e deve ser incentivada. 2.6.1.1 Avaliação da atividade antiviral in vitro A citotoxicidade foi definida por Nardone (1977) como sendo o conjunto de alterações da homeostase celular, levando a uma série de modificações que interferem na capacidade adaptativa das células, bem como na sua sobrevivência, reprodução e realização de suas funções metabólicas. Os programas de pesquisa e desenvolvimento de fármacos

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envolvem, além da pesquisa das atividades farmacológicas, o estudo da citotoxicidade dos mesmos, pois ambos são importantes para caracterizar sua eficácia terapêutica e segurança (WILSON, 2000). É importante salientar que qualquer efeito biológico de um composto ou extrato frente a um microrganismo deve ser diferenciado da sua citotoxicidade, que necessita ser avaliada previamente ou em paralelo. Assim, o componente intrínseco da avaliação da atividade antiviral de uma amostra é a determinação do seu índice de seletividade (IS), que é a razão entre a concentração que causa 50 ou 90% de citotoxicidade (CC50 ou CC90) e a concentração que inibe a multiplicação viral na mesma proporção (CI50 ou CI90) (COS et al., 2006). Teoricamente, uma amostra com propriedades antivirais pode proteger as células de várias maneiras: inativando diretamente os vírions ou interferindo em etapas do ciclo de multiplicação viral. A inativação direta ou atividade virucida pode ser causada por desintegração total dos vírions, solubilização do envelope viral ou por modificação química, degradação ou interação com proteínas essenciais do envelope (ZHU et al., 2004). Além da polimerase viral, proteínas que funcionam durante as múltiplas etapas da multiplicação viral podem fornecer alvos úteis para novos agentes terapêuticos. Moléculas que atuam na adsorção e penetração dos vírus têm as vantagens de prevenir a infecção, impedindo a produção de proteínas virais citotóxicas, além de não exigirem a sua entrada na célula para produzir o efeito. Estudos estão sendo realizados nesse sentido e já se conhecem algumas moléculas, a exemplo da heparina, que se ligam à glicoproteínas do envelope viral (COEN; SCHAFFER, 2003). O docosanol, entre outros mecanismos, é um inibidor de entrada e já está à disposição em alguns países para o tratamento do herpes labial (BARBARASH, 2001). Este panorama, aliado à disponibilidade de técnicas para o estudo das interações específicas de moléculas com componentes da partícula viral, incentiva a busca por novos agentes mais eficazes e com mecanismos de ação diferenciados. 2.6.1.2 Sinergismo O uso de fármacos combinados pode ser efetivo contra múltiplos alvos, subpopulações ou doenças, simultaneamente. O uso de uma combinação de fármacos com diferentes mecanismos de ação pode ter efeito sinérgico no tratamento de uma doença, por aumentar a eficácia do efeito terapêutico, permitir a diminuição da dose diminuindo a

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toxicidade, diminuir o desenvolvimento de resistência, e melhorar a farmacodinâmica e a farmacocinética dos mesmos. A terapia combinada, conhecida popularmente como coquetel, é amplamente usada e compõe o tratamento de escolha para doenças graves como câncer e AIDS (CHOU, 2006). Chou (2006) definiu o sinergismo como um efeito maior do que simplesmente o efeito aditivo, ou seja, o somatório dos dois efeitos isoladamente, e o antagonismo com um efeito menor do que o aditivo. Chou e Talalay (1981, 1983, 1984) deduziram um modelo matemático para calcular o denominado índice combinatório (IC, em inglês CI, combination index), que quantifica o sinergismo ou antagonismo entre duas substâncias. Neste teorema, valores de IC < 1, =1 e >1 indicam sinergismo, efeito aditivo e antagonismo, respectivamente. De acordo com os valores de IC, diferentes graus de sinergismo ou antagonismo podem ser determinados, conforme mostra o Quadro 1 a seguir. Quadro 1: Descrição de sinergismo e antagonismo em estudos de combinação de substâncias, através do método de determinação do Índice Combinatório (IC), de acordo com Chou (2006). Faixa do IC

Interpretação

Símbolo

< 0,10 0,10-0,30 0,30-0,70 0,70-0,85 0,85-0,90 0,90-1,10 1,10-1,20 1,20-1,45 1,45-3,30 3,30-10,00 >10,00

Sinergismo muito forte Sinergismo forte Sinergismo Sinergismo moderado Sinergismo fraco Aditivo Antagonismo fraco Antagonismo moderado Antagonismo Antagonismo forte Antagonismo muito forte

+++++ ++++ +++ ++ + +/-----------

2.7 Fungos que produzem cogumelos O termo cogumelo é sinônimo de corpo de frutificação e corresponde a estruturas aéreas em forma de guarda-chuva, suficientemente grandes para serem coletadas e vistas a olho nu. Estas

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estruturas fazem parte de ciclo reprodutivo de macrofungos distribuídos principalmente na classe dos Basidiomicetos, mas também em algumas espécies na classe dos Ascomicetos (LINDEQUIST et al., 2005). Os cogumelos medicinais têm uma história estabelecida de uso em terapias orientais tradicionais. A título ilustrativo pode-se citar Ganoderma lucidum (reishi), Lentinus edodes (shiitake), Inonotus obliquus (chaga), Grifola frondosa (maitake), Flammulina velutipes (winter) e Pleurotus ostreatus (hiratake), que são usados há centenas de anos na Coréia, China, Japão e Rússia (CHANG; BUSWELL, 1996; COHEN et al., 2002; LULL et al., 2005; WASSER, 2002b). Estes fungos representam uma grande e pouco estudada fonte de potenciais agentes terapêuticos. O número de diferentes espécies no planeta é estimado em 140.000, sendo apenas 10% conhecidas. Dessas 14.000 espécies, aproximadamente 50% são consideradas potencialmente comestíveis, mais de 2.000 são seguras para o consumo humano, e em torno de 700 apresentam alguma propriedade farmacológica (LINDEQUIST et al., 2005; MATTILA et al., 2000). O interesse no uso de cogumelos com propriedades terapêuticas tem aumentado nos últimos anos. Além do amplo número de espécies existentes, os fungos apresentam metabólitos primários e secundários diferenciados dos das plantas, com efeitos farmacológicos em diferentes alvos celulares e moleculares, com comprovada eficiência no tratamento de inúmeras doenças. Entre as atividades farmacológicas estudadas estão: antitumoral, antialérgica, anti-inflamatória, antioxidante, antidiabética, anti-hipertensiva, anti-hiperlipêmica, antitrombótica, imunomoduladora, hepatoprotetora, antibacteriana, antifúngica, antiparasitária e antiviral (FAN et al., 2006; LINDEQUIST et al., 2005; POUCHERET et al., 2006; WASSER, 2002a; ZAIDMAN et al., 2005). Na revisão feita por Stamets (2002), foram descritos entre outras atividades a ação antiviral de várias espécies de cogumelos, como por exemplo, Agaricus brasiliensis, Fomes fomentarius, Grifola frondosa, Ganoderma lucidum, Inonotus obliquus, Lentinula edodes, Coriolus versicolor e Trametes versicolor. Os efeitos antivirais dos cogumelos são descritos não só para os extratos totais como também para compostos deles isolados. Tais efeitos podem ser causados pelo efeito virucida direto, por inibição das enzimas virais, da síntese dos ácidos nucléicos virais, da adsorção e/ou da penetração viral nas células do hospedeiro. Efeitos indiretos resultantes da atividade imunoestimulante também são descritos para polissacarídeos isolados ou complexados com outras moléculas (LINDEQUIST et al., 2005).

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Há inúmeros exemplos de compostos isolados de fungos produtores de cogumelos que apresentaram atividade antiviral. Entre elas, a ação anti-HIV foi verificada para os triterpenos (ganoderiol, ganodermanontriol e ácido ganodérico) da espécie Ganoderma lucidum, para as ligninas do Inonotus obliquus, e para as ligninas e lentinanas sulfatadas do Lentinula edodes. A ação anti-influenza foi relatada para os terpenos (ganodermadiol e lucidadiol) isolados do Ganoderma pfeifferi e para polissacarídeos do Lentinula edodes e para a hispidina do Inonotus hispidus. A ação anticitomegalovírus foi descrita para os polissacarídeos do Trametes versicolor. A ação anti-HSV foi relatada para as proteínas do Rozites caperata e Grifola frondosa e para a iludina S, um sesquiterpeno extraído do Omphalotus illudens (ALI et al., 2003; BRANDT; PIRAINO, 2000; FAN et al., 2006; GU et al., 2007; PIRAINO, 1999). Aliado a isso, muitas pesquisas relatam que extratos e metabólitos isolados de cogumelos estimulam ou suprimem componentes específicos do sistema imune, apresentando efeito imunomodulador. Esses extratos ou compostos podem ser eficazes na prevenção e tratamento de doenças infecciosas, atuando como agentes terapêuticos principais ou em combinação com outros fármacos, ou ainda, como adjuvantes de vacinas (LULL et al., 2005). 2.8 Agaricus brasiliensis O objeto de estudo desta tese é conhecido popularmente no Brasil como cogumelo-do-sol, e no Japão como himematsutake, sendo amplamente utilizado como alimento e na medicina tradicional (LAKHANPAL; RANA, 2005). No entanto, sua classificação taxonômica é bastante controversa e merece especial atenção. Taxonomicamente, este fungo pertence à classe dos Basidiomicetos, ordem Agaricales, família Agaricomycetideae, tribo Agariceae, seção Arvenses e gênero Agaricus. A denominação da espécie de estirpes brasileiras é denominada, mais comumente, de Agaricus brasiliensis Wasser.

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B

Figura 2: A) Corpos de frutificação e B) micélio em meio líquido do fungo de Agaricus brasiliensis Autora: Carla Maísa Camelini.

Este cogumelo é nativo no sudeste do Brasil, tendo sido descoberto na cidade de Piedade, São Paulo, em 1960, pelo produtor e pesquisador japonês, Takatoshi Furumoto, que o enviou ao Japão para ser investigado. Sua primeira identificação como A. blazei Murrill sucedeu-se sete anos depois pelo botânico belga Heinemann. Com a morte de Furumoto, o cultivo deste cogumelo foi abandonado, e o interesse pela espécie só retornou em 1990. Em seguimento, ocorreu um intenso cultivo e ampla utilização desta espécie na culinária e na medicina tradicional, atuando contra o estresse físico e mental, estimulando o sistema imune, aumentando a qualidade de vida de diabéticos, reduzindo o colesterol e auxiliando no tratamento do câncer. Tais usos têm sido fortemente explorados do ponto de vista publicitário, somente com fins comerciais, sem que haja estudos toxicológicos e farmacológicos pré-clínicos e clínicos suficientes que comprovem sua segurança e eficácia (DIAS et al., 2004; FIRENZUOLI et al., 2008). Em 2002, (Wasser) e colaboradores publicaram uma análise histórico-botânica e concluíram que A. blazei ss. Murrill difere em alguns aspectos do A. blazei ss. Heinemann, devendo ser consideradas duas espécies distintas. Eles propuseram para as linhagens identificadas por Heinemann, que incluem as brasileiras, uma nova denominação, Agaricus brasiliensis. No entanto, Colauto e colaboradores (2002) verificaram pouca variabilidade genética entre espécimes de Agaricus comercializadas no Brasil. Além disso, Fukuda et al. (2003) compararam sete estirpes cultivadas no Japão e uma brasileira, e verificaram que a espécime do Brasil não foi compatível com as japonesas. Já Kerrigan (2005) afirmou que os cogumelos originados do Brasil e do Japão são biologicamente e filogeneticamente idênticos à espécie norte-americana (Agaricus subrufescens). Como a discussão ainda permanece (DIAS et al., 2008; KERRIGAN, 2005, 2007;

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WASSER, 2007, 2010; WASSER et al., 2005), a determinação desta espécie é considerada controversa até que um consenso internacional oficial seja obtido. No presente trabalho, a denominação A. brasiliensis será utilizada, visto que é a mais frequentemente empregada para as estirpes brasileiras. No dia 09 de agosto de 2012, foi realizada uma busca na base de dados Scopus (http://www.scopus.com) com o termo Agaricus blazei, e obtiveram-se 384 artigos, entre os quais estão relatadas as atividades: antitumoral (60) imunomoduladora (33), antimutagênica (15), antioxidante (14), citotóxica (6), antidiabética (4), anti-inflamatória (3), antibacteriana (2), antiviral (2), anti-hipertensiva (2), antilipêmica (4), hepatoprotetora (3), antialérgica (3), antiparasitária (2) e antitrombótica (1). Utilizando-se o termo Agaricus brasiliensis obtiveram-se 21 artigos, e dentre as ações farmacológicas estudadas estão as atividades: antiviral (3), antitumoral (2), imunoestimulante (2), antimutagênica (1), antidiabética (1), e antioxidante (1). Para o termo Agaricus subrufescens, foram detectados quatro artigos: um relata a atividade antioxidante e os outros três discutem a denominação da espécie e seus sinônimos. Este levantamento mostrou que, embora alguns usos populares deste fungo tenham sido confirmados, a sua atividade antiviral foi pouco pesquisada. Entre os trabalhos anteriores, foi demonstrada a inibição in vitro da multiplicação do vírus da encefalite equina (SORIMACHI et al., 2001), do HSV-1 (BRUGGEMANN et al., 2006), do herpes bovino tipo 1 (BRUGGEMANN et al., 2006; MINARI et al., 2011) e do poliovírus tipo 1 (FACCIN et al., 2007). Além disso, um estudo realizado com camundongos, que receberam uma vacina de DNA recombinante contra o vírus da hepatite B, e também extratos deste cogumelo, detectou um aumento de 3-4 vezes na produção de anticorpos específicos contra o vírus (anti-HBc), em relação aos controles (CHEN et al., 2004). 2.9 Polissacarídeos Polissacarídeos são macromoléculas naturais encontradas em todos os organismos vivos, constituindo um grupo abundante e importante da biosfera, tais como a celulose e o amido das plantas, o glicogênio dos animais e as glicanas dos fungos. Esses polímeros são constituídos de unidades monossacarídicas, unidas por ligações glicosídicas, diferindo entre si na unidade e no grau de ramificação destas, no tipo de ligações que as unem e no comprimento de suas

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cadeias, apresentando diferentes composições e funções (DA SILVA et al., 2006). Com relação à sua utilização terapêutica, os polissacarídeos são compostos de baixa toxicidade para mamíferos e apresentam inúmeras propriedades farmacológicas, entre as quais, a atividade antiviral que foi mostrada em vários estudos utilizando diversas fontes, como plantas (JASSIM; NAJI, 2003), líquens (OLAFSDOTTIR; INGÓLFSDOTTIR, 2001), bactérias (MATSUDA et al., 1999), algas marinhas (SMIT, 2004) e fungos (EO et al., 2000). Nos fungos, estas moléculas representam um importante constituinte da biomassa. A parede da célula fúngica, por exemplo, pode conter mais de 75% de polissacarídeos, predominantemente glicanas e mananas e, em menor quantidade, quitina. Além de atuarem como elemento de suporte para as hifas, alguns polissacarídeos formam uma capa extracelular ao redor do micélio, proporcionando um suporte para adesão das enzimas excretadas e participando na degradação da lignina, como uma fonte indireta de peróxido de hidrogênio. Sua contribuição é importante também para proteger as células da desidratação e regular a concentração de glicose extracelular (DA SILVA et al., 2006; GOMPERTZ et al., 2002). Os polissacarídeos representam uma classe de macromoléculas com grande variabilidade estrutural. A polimerização dos monossacarídeos pode ocorrer em diferentes posições da molécula de açúcar, gerando uma ampla variedade de estruturas lineares ou ramificadas. A estrutura secundária da molécula também pode variar, dependendo da conformação dos seus componentes, da sua massa molecular e das interações inter e intracadeias (PAULSEN, 2002). Contribuindo também para esta diversidade, existem processos de modificação de polissacarídeos, como a sulfatação, que é verificada em organismos marinhos e na matriz extracelular de vertebrados (KIRKWOOD, 1974). Diversos estudos já relataram a atividade antiviral de polissacarídeos contra alguns vírus, tais como HSV-1 e HSV-2 (EO et al., 2000; LIU et al., 2004), HIV (JASSIM; NAJI, 2003), vírus da hepatite B (LEE et al., 2002), citomegalovírus e vírus influenza (KANEKIYO et al., 2005) e coxsackie virus B3 (LEE et al., 2010). Para alguns polissacarídeos naturalmente sulfatados ou produzidos por semisíntese foram relatadas atividades frente aos vírus: HSV-1 e HSV-2 (LIU et al., 2004; TALARICO et al., 2004; ZHU et al., 2004), Vírus Herpes Humano tipo 6 (NAESENS et al., 2006), vírus da dengue (QIU et al., 2007), HIV (TALYSHINSKY et al., 2002), citomegalovírus, vírus

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respiratório sincicial, vírus influenza, adenovírus, entre outros (WITVROUW; DE CLERCQ, 1997). Além disso, em uma revisão realizado por Ghosh et al., (2009) foi verificado que muitos dos polissacarídeos avaliados nos últimos 20 anos apresentam atividade contra mais de uma espécie de vírus, demostrando que estes compostos geralmente apresentam amplo espectro de atividade antiviral. O principal modo de ação antiviral dos polissacarídeos sulfatados relaciona-se às suas características aniônicas, o que lhes permite interagir com as cargas positivas presentes no envelope viral ou na superfície celular, inibindo a adsorção, fusão e penetração dos vírus nas células do hospedeiro (EO et al., 2000). Todavia, o efeito antiviral indireto in vivo, através do estímulo da resposta imune inata e adaptativa também já foi verificado (HAYASHI et al., 2008). 2.9.1.1 Absorção intestinal de macromoléculas A superfície interna do intestino delgado é revestida por uma camada única formada por dois tipos de células especializadas: os enterócitos, correspondendo ao tipo celular majoritário, e as células M, que estão presentes nas Placas de Peyer e compõem menos de 0,1% do total de células. Ambos os tipos celulares entram em contato com as células adjacentes através de interdigitações que são junções protéicas que interligam as membranas celulares. No entanto, células M e enterócitos diferem entre si em muitos aspectos como mostra a Figura 3. Os microvilos das células M são mais curtos e estão em menor número do que nos enterócitos. A membrana basolateral das células M é geralmente bastante invaginada, formando um bolso intra-epitelial, ocupado por macrófagos e linfócitos B e T. Além disso, as células M também são ausentes de glicocálice, muco e secreção de anticorpos IgA e têm níveis muito baixos de lisossomos e secreção de enzimas na borda em escova. As macromoléculas com MM > 1.000 Da penetram na barreira da mucosa intestinal por endocitose, através das células M, podendo ser absorvidas sem uma degradação significativa. Estas células M são responsáveis pela captação e checagem de polissacarídeos, proteínas e microorganismos no tecido linfóide associado à mucosa intestinal, regulando a resposta imune no local. No entanto, devido ao fato destas células serem pouco abundantes e não possuirem marcadores específicos, pouco se sabe sobre a cinética e o mecanismo de absorção de macromoléculas nestas células (COOPER et al., 2002; LIANG et al., 2001).

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Figura 3: Diagrama mostrando as diferenças morfológicas entre os enterócitos e células M. O transporte transepitelial de compostos de baixa massa molecular através dos enterócito e de alta massa molecular através das células M também está representado. (Fonte: adapatado de Liang et al., (2001).

2.10

Glicanas

As glicanas são um extenso grupo de polímeros de D-glicose unidas por ligações glicosídicas. Entre elas, as mais comumente encontradas na parede celular de fungos são as de configuração β. Como a glicose é um açúcar de seis carbonos, a ligação pode ocorrer entre qualquer combinação das seis posições. Assim, quando um polissacarídeo é referido como (1→6)-β-D-glicana, a ligação β-glicosídica está entre a posição 1 (carbono 1) em uma molécula de glicose e a hidroxila localizada na posição 6 (carbono 6) da próxima molécula. Ramificações laterais também podem ocorrer em alguns pontos particulares da molécula, tal como as ramificações (1→3)-β- na cadeia principal (1→6)-β-D-glicana, sendo esta a configuração predominante das glicanas presentes nas frutificações de A. brasiliensis (MCGINNIS, 1996; CAMELINI, 2005). Os polissacarídeos de cadeia longa, tais como as β-glicanas, não são produzidos pelo corpo humano e podem ser obtidos a partir de fungos e também de plantas. Sabe-se que certos cogumelos são as fontes mais ricas de β-glicanas já conhecidas, que se apresentam como componentes menores do citosol e da parede celular, e como polissacarídeos excretados no meio (DA SILVA et al., 2006).

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2.11

Câncer

O termo câncer refere-se à neoplasia, especificamente aos tumores malignos. O câncer é uma doença complexa, caracterizada pela proliferação descontrolada de células transformadas devido à ativação de oncogenes e/ou desativação de supressores de tumor. Existem aproximandamente 200 tipos de cânceres diferentes, correspondentes às diferentes linhagens de células do corpo, os quais se distinguem pela capacidade de invadir tecidos e órgãos, vizinhos ou distantes (ALY, 2012; DE ALMEIDA et al., 2005). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), 7.6 milhões de pessoas morreram de câncer no mundo em 2008 e há projeção de aumento para 13 milhões em 2030 (WHO, 2008). No Brasil, estima-se a ocorrência de mais de 518 mil novos casos de câncer para o biênio de 2012-2013, sendo os tipos mais incidentes os cânceres de pele não melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto e estômago no sexo masculino; e os cânceres de pele não melanoma, mama, colo do útero, cólon e reto e glândula tireoide para o sexo feminino (INCA/MS, 2011). 2.12

Cancer de pulmão

Os cânceres de traquéia, brônquios e pulmão são a causa mais importante de morte por câncer no mundo, sendo responsáveis por 1,39 milhões de mortes em 2008, com uma razão mortalidade/incidência de aproximadamente 86%. A mais recente estimativa mundial apontou uma incidência de 1,61 milhão de casos novos de câncer do pulmão para o ano de 2008, representando 12,7% de todos os novos casos de câncer. Na maioria das populações, os casos de câncer do pulmão tabacorelacionados representam 80% ou mais dos casos, pois o tabagismo é responsável pelo aumento de cerca de 20 a 30 vezes do risco de desenvolver câncer pulmonar. Outros importantes fatores de risco conhecidos para o câncer do pulmão incluem exposição à carcinógenos ocupacionais e ambientais, tais como amianto, arsênio, radônio, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e queima de carvão. Além desses, repetidas infecções pulmonares, tuberculose, deficiência ou excesso de vitamina A e história familiar também são considerados fatores de risco para o desenvolvimento desse tipo de neoplasia (INCA/MS, 2011). No Brasil, foram estimados para o ano de 2012, 17.210 casos novos de câncer de pulmão em homens e 10.110 em mulheres. Esses valores correspondem a um risco estimado de 18 novos casos a cada 100 mil homens e 10 a cada 100 mil mulheres. Sem considerar os tumores da

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pele não melanoma, o câncer do pulmão em homens é o segundo mais frequente nas regiões Sul (37/100 mil) e Centro-Oeste (17/100 mil), ocupando a terceira posição nas regiões Sudeste (20/100 mil), Nordeste (8/100 mil) e Norte (8/100 mil). Para as mulheres, é o terceiro mais frequente na região Sul (19/100 mil), o quarto na região Centro-Oeste (9/100 mil) e o quinto nas regiões Sudeste (11/100 mil), Nordeste (6/100 mil) e Norte (5/100 mil) (INCA/MS, 2011). Devido às diferenças de tratamento e prognóstico, o câncer pulmonar é classificado em duas formas: carcinoma de pequenas células e carcinoma de não pequenas células. O carcinoma de pequenas células caracteriza-se pelo crescimento rápido, alta probabilidade de metástase e uma boa responsividade ao tratamento com quimioterapia e radioterapia. O carcinoma de não pequenas células é responsável por mais de 75% dos cânceres e inclui três tipos de tumores: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas também denominado carcinoma epidermóide, e carcinoma de células grandes (CERSOSIMO, 2002). 2.13

Avaliação do potencial anticâncer

As alternativas disponíveis para o tratamento do câncer incluem a cirurgia, para remoção do tumor, a radioterapia, que consiste na administração de raios-X, e a quimioterapia, com a utilização de agentes antineoplásicos. Todas elas são associadas a efeitos colaterais com eficácia e especificidade ainda insuficientes (ALY, 2012). Sendo assim, a pequisa de novos agentes anticâncer á bastante importante e se inicia com a avaliação in vitro das amostras disponíveis ou selecionadas através de ensaios de citotoxicidade em linhagens celulares tumorais. Segundo o National Cancer Institute (NCI-EUA), os termos citotóxico, antiproliferativo, antitumoral e anticâncer são diferentemente definidos. O termo citotóxico é utilizado para agentes tóxicos para células tumorais in vitro, podendo causar morte celular por diferentes mecanismos. A atividade antitumoral é determinada por ensaios in vivo em modelos animais. Já o termo anticâncer é reservado a agentes que apresentam atividade em humanos (Developmental Therapeutics Program NCI/NIH, 2012). Este Instituto realiza, desde 1955, o mais importante programa de triagem de compostos com atividade citotóxica. Atualmente, no âmbito desse programa, os compostos são testados quanto às atividades citotóxica e antiproliferativa através de um painel de 60 diferentes linhagens celulares, originadas de sete diferentes tipos de tumores (cerebral, cólon, leucemia, pulmão, melanoma, ovário e renal) e

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incluindo também linhagens resistentes a fármacos (SUGGITT; BIBBY, 2005). Os procedimentos realizados pelo programa incluem uma triagem inicial com apenas uma concentração da amostra e, posteriormente, outra triagem com cinco concentrações das amostras mais promissoras. A metodologia inclui a utilização do ensaio colorimétrico da sulforrodamina B, com tratamento das células por 48 h, e a fixação das cavidades controle no tempo zero (antes do tratamento). Utilizando controles do tempo zero podem-se corrigir os valores de absorbância obtidos no tempo final (48 h) e diferenciar a atividade citotóxica da citostática. Três parâmetros de concentração-resposta são calculados a partir dos dados obtidos:
GI50= (Growth Inhibition of 50%), que corresponde à concentração que causa 50% de inibição do crescimento celular em relação ao controle não tratado.
TGI= (Total Growth Inhibition), que corresponde à concentação que inibe totalmente o crescimento celular, ou seja, a concentração na qual o número de células nas cavidades que receberam o tratamento é igual ao número de células nas cavidades controle (tempo zero).
LC50= (Lethal Concentration at 50%), que corresponde à concentração que resulta em 50% de redução do número de células em comparação ao tempo inicial. Desta forma, uma amostra só é considerada citotóxica se o número total de células diminuir em relação ao tempo zero, ou seja, tiver menos células que inicialmente. Se a amostra somente reduzir o número de células em relação ao controle celular é considerada citostática, pois reduz a proliferação celular (Developmental Therapeutics Program NCI/NIH, 2012) 2.14

Polissacarídeos com atividade citotóxica

O primeiro importante estudo de avaliação da atividade citotóxica de substâncias obtidas de fungos foi realizado por Gregory, em 1966, que isolou substâncias ativas de mais de 200 espécies de Basidiomicetos e mostrou que polissacarídeos de 22 espécies de cogumelos apresentaram efeito inibitório contra células tumorais (ZHANG et al., 2007). Diferentes mecanismos de ação foram descritos para polissacarídeos sulfatados com atividade citotóxica. Entre eles, a inibição da metástase e proliferação de células tumorais por ligação a moléculas de adesão celular e fatores de crescimento, por exemplo,

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inibindo a heparinase, enzima responsável pela clivagem das cadeias de sulfato de heparana das proteoglicanas e a liberação de fatores de crescimento tumoral, ou por ligação direta a fatores de crescimento. Alguns polissacarídeos sulfatados também foram relatados como indutores da apoptose e diferenciação de células tumorais (NIE et al., 2006). Esta classe de compostos pode ainda atuar melhorando a resposta imune inata e adaptativa às células tumorais. Mais especificamente, polissacarídeos sulfatados estimulam a resposta inata pelo aumento da atividade tumoricida de macrófagos e células natural killer. A resposta adaptativa é aumentada pelo aumento da produção de citocinas, como interleucina-1 beta e TNF-alfa, que por sua vez estimulam as células T citotóxicas, as quais atuam diretamente sobre as células tumorais. Estes compostos também podem reconhecer estruturas de adesão celular como as CD2, CD3 e CD4 e aumentar a proliferação de linfócitos T (WU; CHEN, 2006). Apesar do Agaricus blazei, espécie relacionada ao Agaricus brasiliensis, estar entre as 28 espécies de fungos mais avaliadas quanto à atividade antitumoral/citotóxica de seus polissacarídeos, a atividade de seus derivados sulfatados não foi ainda estudada. Sendo assim, foi incluída nos objetivos deste trabalho a avaliação da atividade citotóxica dos polissacarídeos nativos e derivados sulfatados, obtidos tanto do cogumelo quanto do micélio de A. brasiliensis.

Objetivos 47

3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral Realizar a caracterização química e a avaliação das atividades citotóxica e anti-herpética de polissacarídeos obtidos do fungo Agaricus brasiliensis e de seus derivados sulfatados. 3.2 Objetivos específicos
Realizar a caracterização química, físico-química e morfológica dos polissacarídeos obtidos dos corpos de frutificação (FR) e do micélio (MI) de A. brasiliensis, bem como de seus respectivos derivados sulfatados, FR-S e MI-S;
Avaliar in vitro o efeito citotóxico das amostras frente à linhagem de células tumorais A549;
Avaliar in vitro a citotoxicidade frente às células Vero e a atividade anti-herpética das amostras frente à diferentes cepas dos Herpes simplex virus;
Avaliar in vitro o mecanismo da atividade anti-herpética das amostras sulfatadas, em diferentes etapas do ciclo de replicação viral;
Avaliar in vitro o sinergismo da atividade anti-herpética das amostras sulfatadas com o fármaco aciclovir;
Avaliar in vivo a atividade anti-herpética do MI-S utilizando diferentes modelos murinos de infecção.

CAPÍTULO I: CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE POLISSACARÍDEOS DO FUNGO Agaricus brasiliensis

Capítulo I: Apresentação 51

1. APRESENTAÇÃO A caracterização das quatro amostras obtidas (FR, MI, FR-S e MI-S) foi uma das estratégias deste trabalho, permitindo o conhecimento das estruturas nativas e das modificações ocorridas no processo de sulfatação, contribuindo para a qualidade dos resultados e para um melhor entendimento das relações estrutura-atividade dos compostos testados. Sendo assim, através de diferentes metodologias foram realizadas análises químicas, físico-químicas e morfológicas das amostras, a fim de caracterizá-las e compará-las entre si. Os dados obtidos foram compilados em um artigo, que constitui o primeiro capítulo desta tese. Nele também foram incluídos os resultados da avaliação da atividade citotóxica.

Capítulo I: Artigo relacionado 53

2. ARTIGO SUBMETIDO PARA INTERNATIONAL JOURNAL MACROMOLECULES

AVALIAÇÃO AO OF BIOLOGICAL

Characterization and cytotoxic activity of sulfated derivatives of polysaccharides from Agaricus brasiliensis Cardozo, F. T. G. S.a; Camelini, C. M.a; Cordeiro, M. N. S.b; Mascarello, A.b; Malagoli, B. G.d; Larsen, I.e;Rossi, M. J.a; Nunes,R. J.b; Braga, F. C.d; Brandt, C.R.e; Simões, C. M. O.c* a

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia; Departamento de Química; cDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis-SC, 88.040-900, Brazil. d Departamento de Produtos Farmacêuticos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte-MG, 31270-901, Brazil. e Departments of Ophthalmology and Visual Sciences and Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, Madison-WI, 53706, United States. b

*Corresponding author address: Laboratório de Virologia Aplicada, Departamento de Ciências Farmacêuticas, CCS, UFSC, CEP 88.040900, Florianópolis, SC, Brasil. Tel.: +55-48-3721-5207; fax: +55-48-3721-9258. e-mail address: [email protected]

54 Capítulo I: Artigo relacionado

Abstract Agaricus brasiliensis cell-wall polysaccharides isolated from fruiting body (FR) and mycelium (MI) and their respective sulfated derivatives (FR-S and MI-S) were chemically characterized and had their cytotoxic activity evaluated against A549 tumor cells. FR-S was characterized as a (1→6)-(1→3)-β-glucan fully sulfated at C-6 and partially substituted at C-4. MI-S was shown to be a (1→3)-βD-gluco-(1→2)-β-D-mannan, partially sulfated at C-2, C-3, C-4, and C-6. The combination of high degree of sulfation and low molecular weight was correlated with the increased cytotoxic activity of both FR-S (EC50=605.6 µg/mL) and MI-S (EC50=342.1 µg/mL) compared to the non-sulfated polysaccharides FR and MI (EC50>1500 µg/mL). Keywords: Agaricus brasiliensis; sulfated polysaccharide; chemical characterization; cytotoxic activity.

Capítulo I: Artigo relacionado 55

1. Introduction Agaricus brasiliensis is an edible Basidiomycete fungus belonging to the Brazilian biota and has traditionally been used to treat cancer and other diseases. In the last few decades, numerous studies have reported the cytotoxic and antitumor properties of A. brasiliensis polysaccharides, which mainly act through immunomodulatory mechanisms, but also by direct cytotoxic effects on tumor cells [1]. The species found in Brazil was originally named Agaricus blazei Murrill sensu Heinemann. Since 2005, this binominal nomenclature has been considered incorrect and replaced by two botanical names: Agaricus subrufescens Peck or Agaricus brasiliensis Wasser, with the latter being adopted for the fungus cultivated in Brazil [2-5]. Polysaccharides are a structurally diverse class of macromolecules for which physicochemical and biological properties are dependent on a combination of factors such as sugar composition, molecular weight, and chain conformation. For sulfated polysaccharides, the degree of substitution and position of sulfated groups are also important [6]. There are many reports demonstrating that sulfation improves the biological activity of polysaccharides, including anticoagulant [7], antiviral [8], immunostimulant [9], hypoglycemic [10], anti-oxidant [11], cytotoxic [12, 13], and antitumor [14] properties. In our previous work [15], we evaluated the anti-herpetic activity of an A. brasiliensis mycelial polysaccharide (MI) and its sulfated derivative (MI-S) and found that sulfation of MI significantly improved its antiviral activity. In this paper, MI and MI-S as well as A. brasiliensis fruiting body polysaccharide (FR) and its sulfated derivative (FR-S) were chemically characterized and had their cytotoxic activity evaluated. To the best of our knowledge, this is the first report on the cytotoxic activity of sulfated derivatives of polysaccharides from this species. 2. Materials and methods 2.1 Fungal materials The fruiting bodies of Agaricus brasiliensis Wasser (syn A. subrufescens Peck) were collected in Biguaçu, Santa Catarina state, Brazil, and designed as strain UFSC 51. A voucher specimen is deposited in the FLOR Herbarium at UFSC (FLOR 11797) and at Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria CBMAI/UNICAMP (code number: 1449, available at http://webdrm.cpqba.unicamp.br/catalogo/pycat/index.py).

56 Capítulo I: Artigo relacionado

The A. brasiliensis mycelium was isolated and cultivated as previously described [15]. 2.2 Isolation of mycelial and fruiting body polysaccharides A. brasiliensis polysaccharides were isolated as previously described [15, 16], with minor modifications. Briefly, 50 g of dried fruiting bodies or mycelial biomass from the submerge-cultivated state were blended twice with 0.5 L of distilled water, refluxed at 100°C for 3 h and filtered through a Whatman filter paper no. 42. The extracts were precipitated with three volumes of 95% ethanol and recovered by centrifugation (2000 x g, 15 min) to obtain the crude mycelial (cMI) and fruiting body (cFR) polysaccharide fractions. Finally, the higher molecular weight polysaccharides from the mycelium and fruiting body were obtained through dialysis (5 kDa cutoff membrane - Spectrum Laboratories, New Brunswick, USA) and, after lyophilization, were designated as MI and FR, respectively. Both polysaccharides were chemically sulfated using the chlorosulfonic acid/pyridine method as described by Zhang et al. [17], generating their respective sulfated derivatives MI-S and FR-S. 2.3 Sample characterization 2.3.1 Scanning electron microscopy (SEM) The surface morphology of gold coated samples was analyzed by the scanning electron microscope (JSM-6390 LV, Jeol, Japan). 2.3.2 Thermogravimetry combined with differential thermogravimetric analysis (TGA-DTGA) Thermograms of samples (1 mg) were obtained in a thermogravimetric analyzer (TGA-50, Shimadzu) from room temperature up to 900°C, at a scan rate of 10°C per min. 2.3.3 High-performance gel permeation chromatography (HPGPC) The molecular weight (Mw) determination was carried out by HPGPC using a Perkin-Elmer series 200 instrument (USA) equipped with a refractive index detector and a gel filtration column (TSK-Gel 5000 PW 7.8 × 300 mm connected to a TSK PWH 5 × 75 mm guard column; Tosoh, Japan). Samples were eluted with 0.2 M NaCl mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The Mw was estimated by reference to

Capítulo I: Artigo relacionado 57

the calibration curves of standard dextrans (5, 12, 50, 150, 410, and 670 kDa; Sigma, USA). 2.3.4 Analytical methods Total sugar content was determined using the phenol-sulfuric acid method [18] adapted to a 96 well microassay plate [19] using glucose as standard. The Bradford method [20] was used to determine the protein content using calibration curves built with bovine serum albumin. The sulfate content was determined by the BaCl2 method [21]. All reagents were purchased from Sigma. Results, determined from calibration curves obtained in three different days, are expressed as mean ± standard deviation (% w/w ± s.d.). 2.3.5 Elemental analysis Elemental analysis (carbon, hydrogen, nitrogen, and sulfur) was performed with a Perkin Elmer 2400 series II elemental analyzer. The percentage of sulfur (% S) and carbon (% C) were used to calculate the degree of substitution (DS) according to the formula: DS= 2.25 × % S / % C [22]. 2.3.6 Monosaccharide composition analysis The qualitative monosaccharide composition of MI and FR was evaluated by thin layer chromatography (TLC) using xylose, arabinose, mannose, glucose, and galactose as reference compounds. Briefly, the samples were hydrolyzed with 3M trifluoroacetic acid (TFA) for 4 h and analyzed on PEI-cellulose sheets (Merck, Germany), developed with n-butanol/ethyl acetate/pyridine/water (6:1:5:4). The chromatograms were visualized after spraying aniline-o-phthalic acid reagent followed by heating [23]. Quantification of monosaccharides was performed using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) in a Perkin-Elmer series 200 instrument equipped with an UV detector, at 250 nm, according to Lv et al. [24]. Briefly, hydrolyzed samples (4 M TFA, 2 h) were derivatized with 1-phenil-3-methyl-5-pyrazolone (PMP). Calibration curves, constructed with PMP-labeled standard monomers (mannose, glucose, galactose, and glucuronic acid), were used for determining the sugar concentrations of the samples. Arabinose was employed as internal standard. Analyses were undertaken at room temperature (25 ºC) on a C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 µm, Perkin-Elmer,

58 Capítulo I: Artigo relacionado

USA) using a gradient elution of 0.045% KH2PO4 - 0.05% triethylamine buffer (A) / acetonitrile (B) as follows: 10% to 14% B over 40 min, at a flow rate of 1.0 mL/min. 2.3.7 Fourier transformation infrared (FT-IR) spectroscopy The FT-IR spectrum was recorded on a Perkin-Elmer Spectrum One spectrometer in the region between 650 and 4.000 cm-1. 2.3.8 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) analysis The spectra were recorded at room temperature for samples (60 mg/mL) dissolved in D2O in a Bruker Avance III 500 NMR instrument, operating at 500 MHz for 1H and 125 MHz for 13C. Chemical shifts were expressed in ppm relative to internal acetone (= 32 ppm). 2.4 Cytotoxic activity evaluation 2.4.1. Cell lines Human lung adenocarcinoma (A549, ATCC, CCL-185) and Vero cells (ATCC, CCL-81) were grown in Minimal Essential Medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin G, 100 µg/mL streptomycin and 25 µg/mL amphotericin B in a humidified 5% CO2 atmosphere at 37°C. 2.4.2 MTT assay The effect on cell proliferation was assessed by the 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) cellular viability assay [25]. In brief, 1 × 104 cells/well were grown in 96-well microplates for 24 h. Cells were then treated with different concentrations of the samples for 48 or 72 h. Negative controls were treated with medium only. After the exposure period, the culture medium was replaced by MTT solution (1 mg/mL) and plates were further incubated for 4 h. Formazan crystals were dissolved by addition of DMSO (Merk, Germany) and the optical densities were read at 540 nm (Infinite 1200 TECAN, Austria). The 50% effective concentration (EC50) was defined as the concentration that reduced cell proliferation by 50% when compared to untreated controls. Paclitaxel (Glenmark, Brazil) was used as positive control.

Capítulo I: Artigo relacionado 59

2.4.3 Sulforhodamine assay The sulforhodamine assay [26] was also used to evaluate the cytotoxicity of selected samples. Briefly, A549 or VERO (ATCC: CCL 81) cells, cultured in 96-well plates, at a density of 1 × 104 cells/well, were exposed to eight concentrations of samples for 48 h. After subtracting the absorbance values of the initial cell cultures (time zero cell control), the GI50 (50% growth inhibitory activity), TGI (total growth inhibition, cytostatic activity), and LC50 (50% lethal concentration, cytotoxic activity) values were calculated. 2.5 Statistical analysis GraphPad Prism 5 Software was used to calculate EC50 values and their 95% confidence intervals through a nonlinear fit- curve (log of compound concentration versus normalized response - variable slope). GI50, TGI, and LC50 values were calculated using linear fit- curves in the same program. 3

Results and Discussion

Since the introduction of sulfate groups with an appropriate degree of substitution can improve the bioactivity of polysaccharides, the goal of this study was to modify polysaccharides isolated from A. brasiliensis fruiting body and mycelium and evaluate their physicochemical properties and cytotoxic activity. Analysis of surface morphology by scanning electron microscopy (SEM) is a qualitative tool to characterize fungal polysaccharides, comparing with standards and assessing morphological differences of modified derivatives. Microstructural irregularities observed in SEMs presented in Fig. 1 show that A. brasiliensis polysaccharides are an amorphous solid. The FR polysaccharide (Fig. 1 A,) showed a rough appearance with no porosity that may be due to high molecular packing as a result of inter and intramolecular hydrogen bonds. Following sulfation, FR-S (Fig. 1 C, D) displayed a smoother surface with an internal porous structure, suggesting that the sulfate groups expanded intermolecular spaces. The MI polysaccharide (Fig. 1 E, F) consisted of flakes that were smaller in size than those of FR and FR-S. MI-S (Fig. 1 G, H) presented particles of variable size with smoother surfaces and rounded shapes. Porous structures were also observed in the MI-S preparation. These particle structures are consistent with previous results. For example, an A. brasiliensis mycelial exopolysaccharide was

60 Capítulo I: Artigo relacionado

previously reported to be an amorphous solid by Lima et al. [27]. In contrast, Hong and Choi [28] described a spherical shape for an A. blazei protein-polysaccharide complex, prepared by spray-drying process. This variation on morphology may be related to the different methods used for fungus cultivation, sample extraction and drying.

Fig. 1: Agaricus brasiliensis polysaccharides observed under scan electron microscopy. Lyophilized samples were gold coated and analyzed by a JSM6390 LV microscope. A and B: FR, A. brasiliensis fruiting body polysaccharide; C and D: FR-S, sulfated derivative of A. brasiliensis fruiting body polysaccharide; E and F: MI, A. brasiliensis mycelial polysaccharide; G and H: MI-S, sulfated derivative of A. brasiliensis mycelial polysaccharide.

Capítulo I: Artigo relacionado 61

Data from thermal analysis performed by TGA-DTGA are compiled in Table 1 and thermograms are available in Supplementary Fig. 1. According to the thermograms, polysaccharide decomposition occurred in three steps. The small initial drop in mass represents the loss of water. The second stage of decomposition began above 266°C for the non-modified compounds (FR and MI) and above 218°C for the sulfated derivatives (FR-S and MI-S). The temperature peak (Tmax) recorded in the DTGA curve is characteristic of an endothermic reaction and can be attributed to thermal decomposition of the polysaccharides [29]. The Tmax obtained for FR and MI was around 300°C. Hong and Choi [28] found a similar profile for a polysaccharide-protein complex isolated from A. blazei fruiting body. A similar behavior has been described for other polysaccharides such as chitosan [30] and galactomannan [31]. The sulfation reduced the temperature of degradation range to 225250°C, demonstrating the molecular change. Jayakumar et al. [32] also reported a slight decrease in the thermostability of chitin after sulfation. Table 1: Thermal analysis of Agaricus brasiliensis polysaccharides TGAa

DTGAb

Range of temperature (°C)

Tf-Ti

Mass loss (%)

Tmax (°C)

FR

272.68 – 343.72

71.04

51.59

313.92

FR-S

224.96 – 277.36

52.40

39.09

248.89

MI

266.12 – 343.98

77.86

44.83

301.33

MI-S

217.21 – 260.30

43.09

27.23

236.32

Sample

FR and FR-S, A. brasiliensis fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, A. brasiliensis mycelial polysaccharide and its sulfated derivative. a Thermogravimetric analysis; (Tf - Ti)= range of reaction (final temperature - initial temperature); b Differential thermogravimetric analysis; Tmax= maximal temperature of degradation.

62 Capítulo I: Artigo relacionado

Supplementary Fig. 1: Thermograms of Agaricus brasiliensis polysaccharides obtained by TGA-DTGA thermal analysis. FR and FR-S, fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, mycelial polysaccharide and its sulfated derivative.

Capítulo I: Artigo relacionado 63

Supplementary Fig. 1 (cont.): Thermograms of Agaricus brasiliensis polysaccharides obtained by TGA-DTGA thermal analysis. FR and FR-S, fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, mycelial polysaccharide and its sulfated derivative.

64 Capítulo I: Artigo relacionado

The data on the apparent molecular weights of A. brasiliensis polysaccharides are presented in Table 2. The polysaccharide isolated from the A. brasiliensis fruiting body (FR) was found to have a Mw of 609 kDa, which falls within the wide range (390 kDa and 2000 KDa) previously described for similar preparations [33-36]. The molecular weight of 310 kDa determined for the mycelial polysaccharide (MI) showed good correspondence with the values reported by Fujimiya et al. (380 kDa) [37] and Lin and Yang (274 kDa) [38]. The sulfation process carried out in acid medium at high temperature probably induced hydrolysis of the polymers, thus accounting for the lower Mw of the sulfated derivatives (127 and 86 kDa for FR-S and MI-S, respectively). This effect has been previously described by Lanteri [39].

Capítulo I: Artigo relacionado 65

Table 2: Molecular weights and chemical composition of Agaricus brasiliensis polysaccharides Sample

Molecular Weight (kDa) 617.93 ± 12.01 and 17.88 ± 0.98

Monosaccharides (%)

Content mean ± SD [% (w/w)]

Glucose

Mannose

Galactose

Total sugar

Protein

Sulfate

60.19 ± 2.12

8.86 ± 3.46

0.94 ± 0.03

n.t.

n.t.

n.t.

608.73 ± 4.11

63.67 ± 4.08

1.76 ± 0.13

4.55 ± 1.44

78.97 ± 7.52

1.76 ± 0.22

n.d.

FR-S

127.20 ± 6.95

68.98 ± 1.26

1.16 ± 0.34

2.86 ± 1.31

65.91 ± 9.39

n.d. (< 0.16)

40.25 ± 1.78

cMI

309.89 ± 2.22 and 30.20 ± 9.22

65.05 ± 5.12

9.95 ± 0.21

n.d.

n.t.

n.t.

n.t.

MI

310.11 ± 1.08

19.35 ± 3.12

58.65 ± 2.74

n.d.

1.06 ± 0.06

n.d.

MI-S

85.52 ± 5.33

24.72 ± 4.12

55.28 ± 3.12

n.d.

0.97 ± 0.09

36.07 ± 2.74

DEX

410

n.t.

n.t.

n.t.

n.d. (< 0.16)

n.d.

DEX-S

>500

n.t.

n.t.

n.t.

n.d. (< 0.16)

48.67 ± 1.40

cFR FR

77.33 ± 10.41 76.60 ± 12.66 75.11 ± 12.07 70.70 ± 10.90

cFR and cMI, A. brasiliensis fruiting body and mycelial crude polysaccharide fractions, respectively. FR and FR-S, A. brasiliensis fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative. MI and MI-S, A. brasiliensis mycelial polysaccharide and its sulfated derivative. DEX and DEX-S, dextran and dextran sulfate, purchased from Sigma (USA ). n.d., not detected or the concentration is below the detection limit between parentheses. n.t. not tested.

66 Capítulo I: Artigo relacionado

The monosaccharide composition of cFR and cMI was initially accessed by TLC analysis (Supplementary Fig. 2). cFR was found to contain primarily glucose while cMI had predominantly glucose, with minor amounts of other sugars.

Supplementary Fig 2: TLC chromatogram obtained for the crude polysaccharide fractions of Agaricus brasiliensis. cFR: crude fruiting body polysaccharide fraction; cMI: crude mycelial polysaccharide fraction.

The quantitative carbohydrate composition was assayed by HPLC-UV analysis of PMP derivatized samples. As shown in Table 2, the major sugar found in FR was glucose (63.67%), while MI contained predominantly mannose (58.65%), but also had significant amounts of glucose (19.35%), which is characteristic of a heteropolymer glucomannan. Uronic acids were not detected in the analyzed samples. The total carbohydrate content varied from 66% to 79%, similar to the concentrations (80-95%) previously reported for A. blazei polysaccharides purified by anion exchange chromatography [33, 35]. Similarly, the low percentage of protein (1-1.8%) was comparable to values obtained previously [16, 27]. The low percentage of nitrogen (Table 3) was in agreement with the results of protein determination by the Bradford assay (Table 2). According to Fernandes et al. [40] the temperature, solvent, and pH used for the extraction and drying procedures can break peptide bonds thereby reducing the protein content. Therefore, different extraction and drying procedures may explain the higher protein levels reported by some groups for polysaccharides obtained from A. brasiliensis and A. blazei fruiting body [28, 35, 41, 42] and mycelium [43]. Sulfate analysis (Table 2) confirmed that the parental polysaccharides have no detectable sulfate content, whereas the derivatized samples contain over 35% sulfate. These results were also confirmed by data from elemental analysis (Table 3).

Capítulo I: Artigo relacionado 67

Table 3: Elemental analysis of polysaccharides from Agaricus brasiliensis Elements (% w/w) Sample

Carbon

Hydrogen

Nitrogen

Sulfur

DSa

FR

34.42

5.56

2.50

0

0

FR-S

17.15

3.52

1.62

14.37

1.88

MI

32.07

4.36

1.63

0

0

MI-S

21.10

3.60

1.80

14.77

1.58

DEX-S

14.90

3.10

0

10.72

1.62

FR and FR-S, A. brasiliensis fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, A. brasiliensis mycelial polysaccharide and its sulfated derivative. DEX-S, dextran sulfate, purchased from Sigma. a Degree of substitution DS= 2.25 x (S% /C %)

The IR spectra recorded for the samples (Supplementary Fig. 3) confirmed their polysaccharide constitution, disclosed by the intense stretching bands between 3200-3470 cm-1 (ν O-H) and 1075 cm-1 (ν CO) [44]. A reduction in the intensity of the bands, observed for the derivatives, was related to the sulfation of the hydroxyl groups [45]. The absence of uronic acids was confirmed by the lack of carbonyl bands around 1700 cm-1 [16]. Polysaccharides can easily be hydrated due to their affinity for water and this is consistent with the presence of the water absorption bands at 1623-1636 cm-1. The small peaks at 13701540 cm-1 confirmed that the preparations contained low amounts of protein. The weak absorption bands present in all the A. brasiliensis polysaccharides spectra at 876-898 cm-1 are indicative of β stereochemistry [6]. The sulfation was confirmed by the appearance of two new absorption bands around 1200 and 800 cm-1 in FR-S and MI-S spectra, characteristic of asymmetric (S=O) and symmetric (C-O-S) vibrations, respectively [17].

68 Capítulo I: Artigo relacionado

Supplementary Fig. 3: FT-IR spectra of Agaricus brasiliensis polysaccharides. FR and FR-S, fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, mycelial polysaccharide and its sulfated derivative.

The attribution of the chemical shifts from the 13C and 1H NMR spectra (Supplementary Figs. 4 and 5, respectively) obtained for the native polysaccharides and the sulfated derivatives are listed in Table 4.

Capítulo I: Artigo relacionado 69

Supplementary Fig 4: 13C NMR spectra of Agaricus brasiliensis polysaccharides. FR and FR-S, fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, mycelial polysaccharide and its sulfated derivative.

70 Capítulo I: Artigo relacionado

Supplementary Fig 5: 1H NMR spectra of Agaricus brasiliensis polysaccharides. FR and FR-S, fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, mycelial polysaccharide and its sulfated derivative.

Capítulo I: Artigo relacionado 71 Table 4: 13C and 1H NMR spectroscopic data of Agaricus brasiliensis polysaccharides and its sulfated derivatives Chemical shift (ppm) Sample

Residue

C/H-1

C/H-2

C/H-3

C/H-4 b

C/H-5

C/H-6

75.03 3.88

69.60 (4.06-4.13)

C/H-6 termc 63.34 (4.30-4.46)

FR

β-(1→6)-Dglucose

103.14 (4.60-4.73)

73.18 3.47

75.71 3.75

(70.92, 68.97) 3.68

FR-S

β-(1→6)-Dglucose

103.14 (4.72-4.78)

73.18 3.50

75.71 (3.70-3.88)

n.d. (76.07) a, 68.95b n.d. (4.65)a

75.03 (4.00-4.22)

69.60 4.39

n.d. (71.59)a n.d. (5.32)a

FR

β-(1→3)-Dglucose

103.14 (4.96, 4.94)

73.18 3.86

n.d. (3.94, 3.96)

69.35 3.79

75.71 3.77

60.69 (3.90, 3.91)

63.34 (4.20-4.29)

FR-S

β-(1→3)-Dglucose

103.14 (4.85, 4.90)

73.18 (3.70-3.88)

n.d. 4.58

n.d. (74.25)a n.d. (4.59)a

75.71 (3.70-3.88)

60.69 n.d. (5.07)a

n.d. (71.59)a n.d. (5.27)a

MI

β-(1→2)-Dmannose

104.88, 98.55 5.30

78.59 (3.20-4.00)

74.11 (3.20-4.00)

72.26 (3.20-4.00)

78.40 (3.20-4.00)

63.25, 3.40 (3.20-4.00)

60.08 (3.20-4.00)

MI-S

β-(1→2)-Dmannose

105.71, 98.48 5.35

78.63 (3.80-4.10)

74.00 (78.91-79.69)a 3.70 (4.30)a

72.05 (77.64)a 3.60 (4.20)a

78.33 3.37

MI

β-(1→3)-Dglucose

102.56, 94.74 (4.60-4.90)

75.40 (3.20-4.00)

n.d. (3.20-4.00)

72.00 (3.20-4.00)

76.79 (3.20-4.00)

MI-S

β-(1→3)-Dglucose

102.27, 94.60 (4.60-4.90)

75.59 (80.87-80.93)a 3.60 (4.20)a

86.71 (3.80-4.10)

71.25 (77.28)a 3.48 (4.13)a

76.72 3.37

FR and FR-S, A. brasiliensis fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative. MI and MI-S, A. brasiliensis mycelial polysaccharide and its sulfated derivative. a Assignments corresponding to the respective sulfation sites are shown in bold font between parentheses. b Assignment for the C4 of β-(1→6)-D-glucose linked to the side chain in C3. C term.: corresponding to the terminal sugar residues. n.d.: not detected. Chemical shifts were assigned using the CASPER program [60] and according to previously published data [16, 35, 42, 50]..

n.d. (69.10)a 63.21 (70.43)a a a (3.80-4.10) (5.92) (3.80-4.10) (5.46) 63.40 (3.20-4.00)

60.08 (3.20-4.00)

n.d. (69.10)a 63.41 (70.55)a a a (3.80-4.10) (5.92) (3.80-4.10) (5.85)

72 Capítulo I: Artigo relacionado FR was characterized as a pure glucan, showing a major component with β-(1→6) linkages, and a minor amount of (1→3)-βlinkages. The β-(1→3)-linked H-1 of the side chain appeared as one resolved doublet centered at 4.95 ppm (J= 8.28 Hz), whose coupling constant value allowed to define its β-configuration. Although the signal around 86 ppm ascribed to C-3 of (1→3)-β-linkage was not detected in the FR spectrum, as reported by Ohno et al. [46], the remaining signals indicate the presence of (1→3)-β-glucan component. These results show that FR consists of a backbone (1→6)-β-glucan with (1→3)-β-glucan side chains attached to C-3, as previously described for the polysaccharides isolated from A. brasiliensis [16, 42] and A. blazei [35] fruiting body. The sulfation of hydroxyl groups results in downfield shift of the carbons bearing sulfates and the protons linked to them by about 7-10 ppm and 0.5-2 ppm, respectively [47]. Hence, the 13C and 1H NMR spectra of FR-S showed downfield shifts of signals at 70.92/3.68 ppm and 63.34/4.30-4.46 ppm respectively to 76.08/4.65 and 71.59/5.32 ppm, indicating that the (1→6)-β-glucan portion was fully sulfated at C-4 and C-6 of the terminal residues. Similarly, the hydroxyl groups of (1→3)-β-glucan moiety in FR-S appear to have been fully sulfated at positions 4 and 6 of the terminal residues. The signal at 60.69 assigned to C-6 in the 1,3-β-chain increased in FR-S 13C NMR spectrum in comparison to the one found for FR. However, the corresponding H-6 signal was not detected in 1H NMR spectrum of FR-S, which most likely indicates the partial sulfation of C-6 hydroxyl groups. The low reactivity of other carbon positions could be attributed to steric hindrance [48]. As expected, the signals of the hydrogens linked to carbons bearing sulfate groups experienced downfield shifts from 0.60 to 2.03 ppm with respect to the unsubstituted polysaccharides in the 1H NMR spectra of sulfated derivatives. Minor changes in chemical shifts were also observed on protons located in the vicinity of sulfation sites [49]. According to 13C and 1H NMR data, MI was characterized as a (1→3)-β-D-gluco-(1→2)-β-D-mannan, as previously described [15, 50]. The signal at 65.86 ppm probably results from the branching in C6 of the main chain. With regard to MI-S, sulfation at C-6 position of the terminal residue was nearly complete, both in the main and side chains, disclosed by the downfield shift of C-6 to a broad peak at 69.10 ppm. Partial sulfation was observed at C-3, C-4, and C-6 positions of the (1→2)-β-D-mannan moiety, as well as at C-2, C-4, and C-6 sites of the (1→3)-β-D-glucan side chain. A splitting pattern of C-3 signal (74.00

Capítulo I: Artigo relacionado 73

ppm) from (1→2)-β-D-mannan and C-2 (75.59 ppm) from (1→3)-β-Dglucan moiety can be attributed to the sulfation of adjacent carbons. It is well known that sulfation of polysaccharides is responsible for changes in the original chain conformation usually resulting in alterations in their biological actions, including antiviral, cytotoxic, and antitumor activities [13, 51-57]. The inhibitory effects on A549 cell proliferation were concentration- and time-dependent and the results, expressed as EC50 values for the 48 and 72 h treatment period, are presented in Table 5. FR and MI had no cytotoxic effect in the 48 h treatment at 1,500 µg/ml. Sulfation of both preparations increased the cytotoxic activity with EC50 values of 605.6 and 342.1 µg/ml, respectively for FR-S and MI-S. Similarly DEX-S was more active than DEX. Table 5: Inhibitory effect of Agaricus brasiliensis polysaccharides in A549 cell proliferation (MTT assay) Increase in 48h 72h Cytotoxicity 95% 95% Confidence Confidence EC50 72h/ Sample EC50a Interval EC50a Interval EC50 48h FR >1500 1147 1006 to 1307 >1.3 FR-S

605.6

440.6 to 832.5

222.5

153 to 323.6

2.7

MI

>1500

-

>1500

-

-

MI-S

342.1

275.4 to 425.1

60.66

50.41 to 73

5.6

DEX

>1500

-

>1500

-

-

DEX-S

991.6

600.5 to 1638

783.1

560.6 to 1094

1.3

Paclitaxel

0.40

0.27 to 0.58

0.056

0.03 to 0.11

7

FR and FR-S, A. brasiliensis fruiting body polysaccharide and its sulfated derivative; MI and MI-S, A. brasiliensis mycelial polysaccharide and its sulfated derivative; DEX and DEX-S, dextran (410 kDa) and dextran sulfate (> 500 kDa), Sigma. a 50% effective concentration (µ g/mL)

In order to differentiate the cytotoxic (LC50) and cytostatic (TGI) effects in the detected activity, FR-S and MI-S were evaluated by the sulforhodamine assay using A549 and Vero cells. Table 6 shows that FR-S and MI-S were cytotoxic in the higher concentrations tested, with MI-S appearing to be slightly more active. Moreover, Vero cells were found to be resistant to the cytotoxic effects of FR-S and MI-S. These results raise the possibility that these sulfated polysaccharides might

74 Capítulo I: Artigo relacionado have selectivity for human cancer cells, but further studies are needed to confirm this hypothesis. As observed by other authors, the antiproliferative effect of sulfated polysaccharides depends on cell type [51, 58]. Table 6: Inhibitory effect of sulfated Agaricus brasiliensis polysaccharides in A549 and Vero cells growth by the sulforhodamine method FR-S MI-S Paclitaxel Parameter A549 GI50a 155.4 160.9 0.23 TGIb 598.8 488.3 0.19 LC50c 1042 815.7 0.62 Vero GI50a >1500 >1500 0.12 TGIb >1500 >1500 0.46 LC50c >1500 >1500 1.05 SId >1.4 >1.8 1.7 FR-S, sulfated derivative of A. brasiliensis fruiting body polysaccharide; MI-S, sulfated derivative of A. brasiliensis mycelial polysaccharide. a Median growth inhibition; bTotal growth inhibition; cMedian lethal inhibition. Values are expressed in µ g/mL. d Selectivity index: calculated as LC50 Vero/LC50 A549.

Previous studies have shown that there is an optimum degree of sulfation (DS) to reach the maximal biological response, which varies according to the polysaccharide type. For instance, Liu et al. [52], comparing polysaccharides with similar Mw (~20 kDa), observed a stronger inhibition of Hep 2 cells grown by polysaccharides with a DS of 1.8 in comparison to those with lower DS values (1.52), while the activity was reduced when the DS was increased to 2.02. Similarly, Bao et al. [55] demonstrated that sulfated polysaccharides with low DS (0.11-0.14) were less cytotoxic than those with higher values (0.28-066), whereas further increases in DS (1.06) reduced the activity. No direct relationship between the cytotoxic activity and DS values were observed in the present work and the differences on effectiveness might be related to other polymer characteristics. MI-S had a slightly higher cytotoxic activity than FR-S and both were more effective than the commercial DEX-S. Since DEX-S has a much higher Mw, we believe that this is an important feature for its reduced efficacy. Yang et al., [59] found a significantly higher cytotoxic activity for partially hydrolyzed fucoidans (Mw= 490 kDa) compared to the native polymers (Mw= 5,100 kDa). However, it is important to note that the sulfated polysaccharides

Capítulo I: Artigo relacionado 75

evaluated herein have different sugar compositions, chain conformations, and sulfation positions, and these features probably also contribute to the differences in their cytotoxicity. 4. Conclusion The current study showed that the sulfation increased the cytotoxic activity of A. brasiliensis fruiting body polysaccharide, and was essential for the activity of the mycelial polysaccharide. Despite using identical conditions for chemical derivatization, distinct patterns of sulfation were obtained for MI-S and FR-S, most likely due to the differences in their native carbohydrate composition and structure. After chemical modification, structural analysis revealed that the chain structure of the compounds was preserved. MI-S, FR-S, and the control DEX-S presented cytotoxic effects inversely proportional to their Mw. The present findings increase the understanding of FR-S and MI-S structure-activity relationships and raise the possibility that these sulfated polysaccharides might display selective toxicity against tumor cells. Additional studies of these polysaccharides are clearly warranted. 5. Acknowledgments The Brazilian authors of this work thank to CAPES (MEC) and CNPq (MCTI, grant number 562785/2008-6) for their research fellowships. This work was also supported by NIH grant EY018597 (CRB), NIH /NEI Core Grant for Vision Research (P30-EY016665, CRB), and an unrestricted grant from Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology and Visual Sciences at the University of Wisconsin-Madison. Authors are also grateful to Dr Aaron Crapster and Dr Matthew Kraft of the Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, for their helpful assistance in the chemical analysis. Conflict of interest Authors disclose any actual or potential conflict of interest in this work.

76 Capítulo I: Artigo relacionado 6. References [1] M. Zhang, S.W. Cui, P.C.K. Cheung, Q. Wang, Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity, Trends Food. Sci. Tech., 18 (2007) 4-19. [2] M. Largeteau, R. Llarena-Hernández, C. Regnault-Roger, J.-M. Savoie, The medicinal Agaricus mushroom cultivated in Brazil: biology, cultivation and non-medicinal valorisation, Appl. Microbiol. Biotechnol., 92 (2011) 897-907. [3] R.W. Kerrigan, Agaricus subrufescens, a cultivated edible and medicinal mushroom, and its synonyms, Mycologia, 97 (2005) 12-24. [4] R.W. Kerrigan, Inclusive and exclusive concepts of Agaricus subrufescens peck: A reply to Wasser et al, Int. J. Med. Mushrooms, 9 (2007) 79-83. [5] S.P. Wasser, Molecular identification of species of the genus Agaricus. Why should we look at morphology?, Int. J. Med. Mushrooms, 9 (2007) 85-88. [6] L. Yang, L.-M. Zhang, Chemical structural and chain conformational characterization of some bioactive polysaccharides isolated from natural sources, Carbohydr. Polym., 76 (2009) 349-361. [7] J. Yang, J. Cai, K. Wu, D. Li, Y. Hu, G. Li, Y. Du, Preparation, characterization and anticoagulant activity in vitro of heparin-like 6carboxylchitin derivative, Int. J. Biol. Macromol., 50 (2011) 1158-1164. [8] C.R. Brandt, F. Piraino, Mushroom antivirals, Recent Res. Devel. Antimicrob. Agents & Chemother., 4 (2000) 11-26. [9] T. Yang, M. Jia, S. Zhou, F. Pan, Q. Mei, Antivirus and immune enhancement activities of sulfated polysaccharide from Angelica sinensis, Int. J. Biol. Macromol., 50 (2012) 768-772. [10] Y. Wang, Y. Peng, X. Wei, Z. Yang, J. Xiao, Z. Jin, Sulfation of tea polysaccharides: Synthesis, characterization and hypoglycemic activity, Int. J. Biol. Macromol., 46 (2010) 270-274. [11] X. Wang, J. Wang, J. Zhang, B. Zhao, J. Yao, Y. Wang, Structureantioxidant relationships of sulfated galactomannan from guar gum, Int. J. Biol. Macromol., 46 (2010) 59-66.

Capítulo I: Artigo relacionado 77

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Capítulo I: Artigo relacionado 79

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Capítulo I: Artigo relacionado 81

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CAPÍTULO II: AVALIAÇÃO DO MECANISMO DA ATIVIDADE ANTIHERPÉTICA DO DERIVADO SULFATADO DO POLISSACARÍDEO OBTIDO DOS CORPOS DE FRUTIFICAÇÃO DO FUNGO Agaricus brasiliensis

Capítulo II: Apresentação 85

1. APRESENTAÇÃO Uma vez que os polissacarídeos isolados das frutificações (FR) e do micélio (MI) do A. brasiliensis não apresentaram atividade antiherpética in vitro e com base no conhecimento de que polissacarídeos sulfatados apresentam potencial ação antiviral, foi realizada a sulfatação química destes polímeros gerando os derivados FR-S e MI-S. Ambas as amostras apresentaram promissora atividade anti-herpética in vitro e tiveram seu mecanismo de ação determinado. Assim, foram elaborados dois artigos. O primeiro que trata do FR-S, incuído no capítulo II desta tese e será submetido à revista Letters of Applied Microbiology. O segundo artigo trata do MI-S, incluído no Capítulo III, tendo sido publicado, em 2011, no periódico Antiviral Research.

Capítulo II: Artigo relacionado 87

2. ARTIGO A SER SUBMETIDO PARA AVALIAÇÃO AO PERIODICO LETTERS OF APPLIED MICROBIOLOGY TITLE: Antiherpetic mechanism of a sulfated derivative of Agaricus brasiliensis fruiting bodies polysaccharide RUNNING HEADLINE: Anti-HSV mechanism of a sulfated polysaccharide Authors’ names: Francielle Tramontini Gomes de Sousa Cardozoa, Carla Maísa Camelinia, Paulo César Lealc, Jadel Müller Kratzb, Ricardo José Nunesc, Célia Regina Monte Barardia, Margarida Matos de Mendonçaa, Cláudia Maria Oliveira Simõesb* Authors’ affiliations: a Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia. b Departamento de Ciências Farmacêuticas. cDepartamento de Química. Universidade Federal de Santa Catarina, 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil. *Corresponding author: Laboratório de Virologia Aplicada, Departamento de Ciências Farmacêuticas, CCS, UFSC, Campus Universitário Trindade, 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil. Tel.: +55 48 3721 5207; fax: +55 48 3721 9258. e-mail address: [email protected] (C.M.O. Simões)

88 Capítulo II: Artigo relacionado

Abstract Aims: This study aimed to evaluate the cytotoxicity and mechanism of antiherpetic activity of the sulfated derivative of a polysaccharide extracted from Agaricus brasiliensis fruiting bodies (FR-S). Methods and Results: The mechanism of anti-HSV activity was evaluated by viral plaque assay applying different methodological strategies. FR-S suppressed HSV-1 and HSV-2 attachment (EC50=0.32 and 0.10µg ml-1) and penetration (EC50=8.39 and 2.86µg ml-1), respectively. FR-S efficiently reduced cell-to-cell spread of HSV-1 (57.14%) and HSV-2 (54.76%), at 6.74µg ml-1 and 4.72µg ml-1, respectively. The synergistic antiviral effect between FR-S and acyclovir was also verified using Calcusyn software. Conclusions: FR-S was categorized as a potent viral entry inhibitor since it significantly reduced HSV attachment and penetration, probably by interacting with viral and cellular components. FR-S also displayed an efficient reduction of HSV-1 and HSV-2 cell-to-cell spread as well as synergistic antiherpetic effect with acyclovir. Significance and Impact of Study: In this study we demonstrated that FR-S displays an interesting mechanism of antiviral action, and might represent a promising drug candidate for the treatment of herpetic infections, useful as a single therapeutic agent or in combination with acyclovir. Keywords: Agaricus brasiliensis; sulfated polysaccharide; antiherpes activity; Herpes Simplex Virus type 1 (HSV-1); Herpes simplex virus type 2 (HSV-2); mechanism of action; synergistic effect.

Capítulo II: Artigo relacionado 89

1. Introduction Herpes simplex virus (HSV) types 1 and 2 belong to the family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, and are responsible for a variety of mucocutaneous infections highly prevalent worldwide. Factors such as the high morbidity in immunocompromised patients, the emergence of drug-resistant virus strains, and the undesirable side effects of the current antiviral chemotherapy has encouraged the search for new antiherpetic agents (Roizman et al. 2007). The HSV attachment and entry into target cells, as well as virus cell-to-cell spread, entail the interaction of viral envelope glycoproteins with host cell surface receptors. These complex processes include a series of sequential steps and are essential for a productive infection in humans and, therefore, represent suitable targets for drug development. Three viral entry inhibitors have already been approved by the FDA: n-docosanol for oro-labial herpes infections, and enfuvirtide and maraviroc for HIV-1 infections (FDA 2012). Agaricus brasiliensis (syn A. subrufescens) is closely related to A. blazei. This Brazilian mushroom has been traditionally used worldwide for prevention and treatment of various illnesses, including cancer, physical and mental stress, osteoporosis, diabetes, hyperlipidemia, arteriosclerosis, and hepatitis (Firenzuoli et al. 2008). In vitro and in vivo studies have shown mainly immunomodulatory (Kozarski et al. 2011), antitumoral (Gonzaga et al. 2009), and antigenotoxic activities for this species (Angeli et al. 2009). Some authors have previously demonstrated the antiviral activity of A. brasiliensis extracts against HSV, Poliovirus, and Western equine encephalitis virus (Sorimachi et al. 2001), HSV-1 (Bruggemann et al. 2006) and bovine herpesvirus 1 (Bruggemann et al. 2006; Minari et al. 2011), and poliovirus 1 (Faccin et al. 2007). Recently, our group has reported the anti-HSV-1 and 2 activity of a sulfated derivative of a polysaccharide obtained from A. brasiliensis mycelia (Cardozo et al. 2011). Herein we endeavored to underline the antiherpetic mechanism of the sulfated derivative of a polysaccharide obtained from fruiting bodies of the same species by evaluating its action on virus viability, attachment, penetration, and cell-to-cell spread.

90 Capítulo II: Artigo relacionado

2. Materials and methods 2.1 Fungal Material Agaricus brasiliensis fruiting bodies were collected in Biguaçu (Santa Catarina State, Brazil), and cultivated in the Bioprocess Laboratory - UFSC. Species identification was performed by Dr Maria Alice Neves and a voucher specimen was deposited in the FLOR Herbarium (FLOR 11 797, UFSC). Afterward, the dried fruiting bodies were ground, lyophilized, and stored at -80ºC until use. 2.2 Isolation of fruiting bodies polysaccharide The polysaccharide was obtained as reported by Cardozo et al., (2011). Briefly, 50g of lyophilized fruiting bodies were extracted with water at 100ºC (3h), precipitated with ethanol, and centrifuged (1100g, 10min). The obtained polysaccharide (FR) was freeze-dried and chemically sulfated according to the methodology described previously (Zhang et al. 2003). The highest molecular mass polysaccharides were separated by dialysis (Cut-off 3.5kDa) and freeze-dried generating the sulfated derivative (FR-S). 2.3 Cells and viruses Vero (ATCC:CCL 81, Rockville, MD, USA) and GMK AH1 (Department of Clinical Virology, Göteborg University, Göteborg, Sweden) cells were grown in minimum essential medium (MEM, Cultilab, Brazil), supplemented with 10% fetal bovine serum (Cultilab), penicillin (100U ml-1), streptomycin (100µg ml-1), and amphotericin B (25µg ml-1) (Cultilab), and maintained at 37ºC in a humidified 5% CO2 atmosphere. The virus strains used were: HSV-1 KOS and HSV-1 29R (Faculty of Pharmacy, University of Rennes, France); HSV-1 gC-null variant gC-39 (Holland et al. 1983); HSV-2 strain 333 (Duff and Rapp 1971) and its gC-negative designated HSV-2 gCneg1 (Trybala et al. 2000). HSV-1 and HSV-2 were propagated in Vero and GMK AH1 cells, respectively. Virus titers were determined by plaque assay and expressed as plaque forming units (PFU ml-1), as reported by Burleson et al. (1992).

Capítulo II: Artigo relacionado 91

2.4 Cytotoxicity evaluation The cytotoxicity of samples on Vero and GMK-AH1 cells was evaluated by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay (Mosmann 1983), with minor modifications. Briefly, 2×104 cells per well were cultivated in 96-well plates for 24h. Then, the growth medium was replaced by 1:2 serial dilutions of each sample diluted in MEM. After 72h of incubation, the medium was substituted by MTT solution (1mg ml-1) and plates were further incubated for 4h. MTT solution was removed and DMSO was added to dissolve formazan crystals. The optical densities were read at 540nm and concentrations of the samples sufficient to reduce cell viability by 50% (CC50) were estimated by linear regression of concentrationresponse curves generated from the data. Acyclovir (ACV, A4669) and heparin (HEP, H9399) were purchased from Sigma (USA) and were employed as controls in all experiments. Stock solutions of samples and controls were prepared in MEM and maintained at -20°C until use. 2.5 Evaluation of antiherpes activity For the plaque number reduction assay, confluent cells were infected with HSV-1 KOS or HSV-2 333 (100 PFU per well) at 37°C for 1h. Different concentrations of samples were added either simultaneously with virus (simultaneous treatment) or after virus infection (post-infection treatment). After virus infection, plates were further incubated at 37°C for 48 and 72h for HSV-1 and HSV-2, respectively. Viral plaques were visualized by staining with naphtol blue-black (Sigma), and enumerated using a stereomicroscope. The concentrations of samples required to reduce plaque number by 50% (EC50) and the respective selectivity indices (SI=CC50/EC50) were calculated by standard methods (Burleson et al. 1992). 2.6 Evaluation of mechanism of action 2.6.1 Virucidal assay The direct effect of FR-S on HSV infectivity was assessed according to procedures described previously (Cardozo et al. 2011). Equal volumes of samples (20µg ml-1) and 4 x 104 PFU of HSV (KOS or HSV-2) in serum-free MEM were co-incubated for 20min at 4, 22, or 37°C. Ethanol (70% v/v) was used as a positive control. The samples were then diluted to non-inhibitory concentrations (1:1000) to determine

92 Capítulo II: Artigo relacionado

residual infectivity by plaque number reduction assay, as described above (item 2.5). 2.6.2 Effect on virus adsorption Four distinct experimental protocols (treatments A to D) were employed to investigate the inhibition of HSV-1 (strains KOS and gC39) and HSV-2 (strains 333 and gCneg1) adsorption by the samples. Treatment A (attachment assay): cells monolayers grown in 24well culture plates were pre-chilled at 4°C for 1h and exposed to viruses (100 PFU per well) in the absence or presence of serial dilutions of the sample (FR-S) and controls (HEP and ACV). After incubation for 2h at 4°C (adsorption period), cells were washed with ice-cold PBS to remove samples and unbound viruses. As a control, wells in which viruses had been preattached to cells were treated with citrate buffer (pH 3.0) to verify that incubation at 4°C allowed only viral attachment avoiding viral entry. Subsequently, cells were overlaid with CMC medium (MEM containing 1.5% carboxymethylcellulose) and the inhibitory activity of the samples was determined by the plaque number reduction assay, as described above (item 2.5). Treatment B (pretreatment of virions): virus suspensions were incubated with the samples for 2h at 4°C. After that, the mixtures were added to pre-chilled cell monolayers to allow viral attachment. After the adsorption period (2h, 4°C), the same procedures described for the treatment A were performed. Treatment C (pretreatment of cells): confluent cells grown in 24well culture plates were pretreated for 1h at 37°C with different concentrations of the samples and then washed with PBS. Afterward, cells were chilled at 4°C for 1h, and exposed to viruses for another 2h. The inhibitory effect was then determined as described in the treatment A. Treatment D (post-attachment assay): pre-chilled cells were firstly incubated with virus suspensions at 4°C for 2h to allow a stable attachment of HSV to cells. Unbound viruses were removed by aspiration and cells were washed with ice-cold PBS. Samples were then added and plates were further incubated at 4°C for another 2h. The remaining steps were conducted as described above. 2.6.3 Penetration assay In order to examine the effect of samples on penetration of HSV1 (KOS or gC-39) and HSV-2 (333 or gCneg1), cells were incubated

Capítulo II: Artigo relacionado 93

with viruses for 2h at 4°C. After the removal of unbound viruses, the temperature was shifted to 37°C to allow penetration and cells were treated with different concentrations of pre-warmed samples. After the penetration period (1h, 37°C), non-penetrated viruses were inactivated with citrate buffer (pH 3.0). Cells were washed twice with PBS, and CMC overlay medium was added to allow plaque formation as described previously. The percentage of inhibition was calculated based on the reduction of plaque number. 2.6.4 Plaque size reduction assay The effect of tested samples on HSV cell-to-cell spread was investigated as previously described (Cardozo et al. 2011). In brief, infected cells (100 PFU per well) were treated with FR-S, HEP, or ACV at concentrations equivalent to their corresponding EC50 values and incubated throughout the entire period of viral plaques development. Results were obtained by analyses of the images of 20 plaques per each sample concentration, and compared with the untreated controls. The area of each plaque was determined using the Image J software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). 2.7 Synergistic effect in combination with acyclovir The effects of FR-S in combination with ACV was evaluated by plaque reduction assay as described above and according to the experimental design proposed by Chou (2006). Briefly, each drug alone or in combination was tested at a fixed ratio of its corresponding EC50 value (i.e. at EC50 x 0.25, x 0.5, x 1, x 2, and x 4). The interaction degree between FR-S and ACV was calculated through combination index (CI) equation, using Calcusyn software (version 2.1, Biosoft®). According to the CI theorem, CI values < 1, = 1, and > 1 indicate synergism, additive effect, and antagonism, respectively. 2.8 Anticoagulant assay The anticoagulant activity of FR-S was evaluated using the activated partial thromboplastine time (APTT) assay (Andersson et al. 1979). Heparin was used as reference substance at the same concentration (10 µg ml-1). PBS was used as negative control. Briefly, 50 µL of each sample was added to 100 µL of pooled human plasma and 100 µL of APTT reagent (Biotécnica, Brazil). The mixtures were

94 Capítulo II: Artigo relacionado

incubated for 3 min at 37ºC. After that, preheated calcium chloride (100 µL, 20 mmol l-1) was added and clot time was recorded. 2.9 Statistical analysis Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. The differences between tested samples and controls were analyzed by one-way ANOVA followed by Dunnett test. A p value less than 0.05 was considered to be statistically significant. 3. Results 3.1 Antiviral activity Different A. brasiliensis polysaccharides were initially evaluated in terms of cytotoxicity by assessing their effects on Vero and GMK AH1 cells viability. The antiviral activity was evaluated by plaque number reduction assay using simultaneous and post-infection treatments. These results reveal that FR has no antiviral activity, while FR-S inhibited both HSV-1 and HSV-2 replication (Table 1).

Capítulo II: Artigo relacionado 95

Table 1: Cytotoxicity and antiherpetic activity of Agaricus brasiliensis polysaccharides Sample

Cytotoxicity VERO CC50*

GMK AH1 CC50*

Simultaneous treatment HSV-1 (KOS) EC50

†

Post-infection treatment

HSV-2 (333)

SI

ǂ

EC50

†

HSV-1 (KOS)

SI

ǂ

EC50

†

HSV-2 (333)

SI

ǂ

EC50

†

SI

ǂ

FR

2370 ± 60

>2500

NI

-

NI

-

NI

-

NI

-

FR-S

2650 ± 190

2520 ± 460

1.43 ± 0.06

1853

0.62 ± 0.08

4064

6.74 ± 0.01

393

4.62 ± 0.38

545

HEP

>2500

>2500

1.15 ± 0.30

>2174

0.58 ± 0.01

>4310

12.68 ± 1.13

>197

8.06 ± 1.46

>310

ACV

>2500

>2500

NI

-

NI

-

0.51 ± 0.05

> 22727

3.91 ± 0.41

>639

†

ǂ

*50% cytotoxic concentration; EC50: 50% effective concentration. Selectivity index (=CC50/EC50); NI: No inhibitory activity; FR: A. brasiliensis fruiting bodies polysaccharide; FR-S: Sulfated A. brasiliensis fruiting bodies polysaccharide; HEP: Heparin; ACV: Acyclovir. Values represent the mean ± standard deviation of three independent experiments in µg ml-1.

96 Capítulo II: Artigo relacionado

3.2 Virucidal activity Preincubation of virus suspensions with FR-S, HEP, and ACV at 4, 22, and 37ºC had no significant inactivating effects on HSV-1 KOS and HSV-2 333 at the tested concentrations (data not shown). These results indicate that virucidal effects do not seem to be involved in the detected antiviral activity of FR-S. Ethanol (70% v/v) presented 100% inhibition of residual virus infectivity, confirming the assay validity. 3.3 Inhibition of viral adsorption and penetration The EC50 values obtained on different adsorption and penetration assays are summarized in Tables 2 and 3, respectively. Results showed that FR-S strongly inhibited viral adsorption in all treatments, while HEP was only effective in treatments A and B. The results presented in Table 3 reveal that FR-S inhibited the HSV penetration more significantly than HEP for all virus strains tested. As expected, acyclovir did not impair viral adsorption and penetration.

Capítulo II: Artigo relacionado 97

Table 2: Effect of Agaricus brasiliensis sulfated polysaccharide (FR-S) on HSV adsorption Treatment protocol (A)Attachment assay

(B)Pretreatment of virions

(C)Pretreatment of cells

(D)Postattachment assay

†

EC50 FR-S 0.32 ± 0.05

Virus(strain) HSV-1(KOS)

HEP 0.33 ± 0.04

ACV NI

HSV-2(333)

0.10 ± 0.04

0.07 ± 0.01

NI

HSV-1(gC–39)

2.07 ± 0.06

2.16 ± 0.41

NI

HSV-2(gCneg1)

0.51 ± 0.13

0.54 ± 0.03

NI

HSV-1(KOS)

0.20 ± 0.01

0.23 ± 0.03

NI

HSV-2(333)

0.08 ± 0.04

0.03 ± 0.01

NI

HSV-1(gC–39)

1.00 ± 0.05

0.91 ± 0.04

NI

HSV-2(gCneg1)

0.11 ± 0.01

0.02 ± 0.01

NI

HSV-1(KOS)

68.26 ± 2.21

> 100.00

NI

HSV-2(333)

6.09 ± 1.81

> 10.00

NI

HSV-1(gC–39)

3.49 ± 1.56

> 10.00

NI

HSV-2(gCneg1)

2.43 ± 1.07

> 10.00

NI

HSV-1(KOS)

3.00 ± 0.01

> 10.00

NI

HSV-2(333)

7.95 ± 0.93

> 10.00

NI

HSV-1(gC–39)

8.76 ± 0.83

> 10.00

NI

HSV-2(gCneg1)

6.70 ± 1.11

> 10.00

NI

†

EC50: 50% effective concentration (µg ml-1). NI = no inhibitory activity; FR-S: Sulfated A. brasiliensis fruiting bodies polysaccharide; HEP: Heparin; ACV: Acyclovir. Values represent the mean ± standard deviation of three independent experiments.

Table 3: Effect of Agaricus brasiliensis sulfated polysaccharide (FR-S) on HSV penetration Virus (strain)

EC50† FR-S

HEP

ACV

HSV-1(KOS)

b

8.39 ± 0.36

13.34 ± 3.64

NI

HSV-2(333)

2.86 ± 0.83a

6.47 ± 0.21b

NI

HSV-1(gC–39)

9.53 ± 0.90b

17.99 ± 4.06c

NI

5.21 ± 0.69b

NI

HSV-2(gCneg1) †

1.97 ± 0.21

a

c

EC50: 50% effective concentration (µg ml-1). NI = no inhibitory activity; FR-S: Sulfated A. brasiliensis fruiting bodies polysaccharide; HEP: Heparin; ACV: Acyclovir. Values represent the mean ± standard deviation of three independent experiments. Different letters indicate statistically significant differences (one way ANOVA/Tukey’s test).

98 Capítulo II: Artigo relacionado

3.4 Inhibition of viral cell-to-cell spread The reduction of HSV-1 and HSV-2 lateral spread was evaluated by measuring 20 viral plaque areas in infected cells treated with FR-S, HEP, and ACV at concentrations equivalent to their EC50 values (Fig. 1).

3.5 Synergism with acyclovir Results of combinations between FR-S and acyclovir are compilated in Table 4. Different concentrations of both compounds, based in their respective EC50 values, were tested. The percentagens of inhibition increased in comparison to each compound alone and since all

Capítulo II: Artigo relacionado 99

combinations tested presented CI values less than 1, FR-S was shown to have a synergistic anti-HSV effect with ACV for both tested viruses. Table 4: Synergistic anti-HSV effects of sulfated Agaricus brasiliensis polysaccharide (FR-S) in combination with acyclovir (ACV) Sample concentration (µg ml-1)

Mean percentage of inhibition (%) FR-S + ACV

Compounds combination ratio

FR-S

ACV

4 x EC50

26.96

2.04

100.00

0.662

2 x EC50

13.48

1.02

100.00

0.572

1 x EC50

6.74

0.51

99.22

0.286

0.5 x EC50

3.37

0.26

69.15

0.239

0.25 x EC50

1.68

0.13

55.19

0.443

4 x EC50

18.88

15.64

100.00

0.550

2 x EC50

9.44

7.82

100.00

0.312

1 x EC50

4.72

3.91

94.51

0.171

0.5 x EC50

2.36

1.96

86.20

0.192

0.25 x EC50

1.18

0.98

52.63

0.367

Experimental CI values

Description (Graded symbols)

HSV-1 (KOS) Synergism (+ + +) Synergism (+ + +) Strong synergism (+ + + +) Strong synergism (+ + + +) Synergism (+ + +)

HSV-2 (333) Synergism (+ + +) Strong synergism (+ + + +) Strong synergism (+ + + +) Very strong synergism (+ + + + +) Strong synergism (+ + + +)

CI: Combination Index is a quantitative index calculated by Calcusyn software, which quantifies the interaction between the tested compounds, as described by Chou (2006). In detail, the ranges of CI