Júlia Gomes Farias [PDF]

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E FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA

Júlia Gomes Farias

DINÂMICA DO ARSÊNIO NO SISTEMA SOLO - ÁGUA - ARROZ NA AMÉRICA DO SUL: DISTINÇÕES FISIOLÓGICAS ENTRE CULTIVARES E OCORRÊNCIA EM GRÃOS COMERCIAIS.

Santa Maria, RS 2016

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Júlia Gomes Farias

DINÂMICA DO ARSÊNIO NO SISTEMA SOLO - ÁGUA - ARROZ NA AMÉRICA DO SUL: DISTINÇÕES FISIOLÓGICAS ENTRE CULTIVARES E OCORRÊNCIA EM GRÃOS COMERCIAIS.

Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Agronomia.

Orientador: Prof. Dr. Fernando Teixeira Nicoloso

Santa Maria, RS 2016

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Júlia Gomes Farias

DINÂMICA DO ARSÊNIO NO SISTEMA SOLO - ÁGUA - ARROZ NA AMÉRICA DO SUL: DISTINÇÕES FISIOLÓGICAS ENTRE CULTIVARES E OCORRÊNCIA EM GRÃOS COMERCIAIS.

Tese apresentada ao Curso de PósGraduação em Agronomia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Agronomia.

Aprovado em 29 de fevereiro de 2016

_________________________________________ Prof. Dr. Fernando Teixeira Nicoloso, Prof. Dr. (UFSM) (Presidente/Orientador)

___________________________________________ Janette Palma Fett, PhD (UFRGS)

__________________________________________ Felipe de Campos Carmona, Dr. (UFRGS)

___________________________________________ Felipe Ricachenesky, Prof. Dr (UFSM) ___________________________________________ Gustavo Brunetto, Prof. Dr. (UFSM) Santa Maria, RS 2016

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DEDICATÓRIA

A maior de todas as minhas inspirações, minha grande amiga, meu grande amor, meu porto seguro e para sempre meu norte, minha mamis Iria Luiza Gomes Farias, dedico. Te amo hoje, ontem e sempre.

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AGRADECIMENTOS

O universo sempre foi um grande mistério para mim, onde começa e quando termina? O finito e o infinito sempre me deixaram muito confusa, ainda sim sempre tive a sensação de algo maior que todos nós. Alguns chamam de Deus, outros de Alá, Shiva Ganesha... outros de destino e há quem não dê "nome aos bois". Para mim tudo isso é energia. Gostaria então de começar agradecendo esta energia maravilhosa, que vem me acompanhando a vida inteira e, claro, super presente em meu momento filósofa, escrevendo a primeira versão da tese. Bem dito isso, agradeço a minha família maravilhosa, que sempre me apoiou, mesmo quando apoiar significava olhar para o lado e deixar eu levar um tombo, pois levantar e persistir é uma das mais importantes lições da vida. Além do apoio e é claro amor incondicional, minha família sempre me estimulou, questionando e sempre me instigando ao aprimoramento. Meu agradecimento especial aos meus pais e a minha irmã, amores da minha vida! Agradeço também a oportunidade de desde muito cedo conviver com professores apaixonados por esta linda profissão que é lecionar, partilhar, transmitir o saber. Também sou grata pela oportunidade que me foi dada tanto em termos de infraestrutura quanto de profissionais competentes na UFSM além é claro dos órgãos financiadores CAPES, CNPq e FAPERGS. Este imenso investimento do governo nos dá a oportunidade de aprender e desbravar novos caminhos, no meu caso pude ainda realizar um sonho de trabalhar com um pesquisador que admiro muito, prof. Andy Meharg no Reino Unido. Também tive a grande alegria de contar sempre com um time maravilhoso. Sim porque o nosso grupo de pesquisa é um grande time onde crescemos juntos e com um objetivo em comum, o saber. Para estes faço um agradecimento especial (em ordem cronológica) para meus queridos Sibila, Jader, Pedro, Bianca, Raissa, Katieli e Anderson pelo profissionalismo, amizade e confiança sempre. Eu contei ainda com um outro time, de amigos dispostos às mais diversas "indiadas", as quais em geral estavam relacionadas com coleta de arroz, solo, água ou as três alternativas anteriores, agradeço por tudo meus queridos Heuri, Roberto, Roberta e Glaucia. Finalizo agradecendo o grande responsável por tudo isso, meu grande mestre prof. Nicoloso, que no decorrer destes quase 8 anos sempre me respeitou, incentivou e acreditou em mim, tantas vezes mais do que eu. Professor que bom poder trabalhar contigo! Que nunca nos faltem sonhos nem vontade de lutar. Como o senhor me disse uma vez, ser sua orientada foi o meu Everest. Que bom que tive um grande companheiro de jornada. A todos vocês, sou grata!

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Learn from yesterday, live for today, hope for tomorrow. The important thing is not to stop questioning.

Albert Einstein

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RESUMO DINÂMICA DO ARSÊNIO NO SISTEMA SOLO – ÁGUA - ARROZ NA AMERICA DO SUL: DISTINÇÕES FISIOLÓGICAS ENTRE CULTIVARES E OCORRÊNCIA EM GRÃOS COMERCIAIS

AUTORA: Júlia Gomes Farias ORIENTADOR: Fernando Teixeira Nicoloso O arroz é a principal fonte de arsênio inorgânico (Asi), uma substância cancerígena, na dieta humana. Neste sentido, existe um grande interesse em reduzir o acúmulo do mesmo em grãos. Para tal, a gestão a campo, criação/modificação no processamento de arroz e estudo com diferentes cultivares vêm sendo explorados. A nível global, muitos países que consomem arroz não produzem o mesmo, ou mesmo regiões dentro de um país produtor. Visto que para manter o consumo tais regiões importam arroz, a identificação de regiões com baixa concentração de As é uma importante opção para a salubridade dos consumidores. Entretanto, a localização de pequenas áreas livres ou com baixas concentrações de As não parece ser a solução completa para a contaminação observada em alimentos; visto a grande demanda de arroz e o número já considerável de áreas descritas como contaminadas. Desta forma, faz-se necessário o uso conjunto de informações como a descrição dos níveis de As em diferentes áreas, comparação entre cultivares, incluindo mecanismos específicos de tolerância e baixa translocação, além da descrição de efeitos secundários como nível dos demais minerais presentes no grão e efeito do manejo da cultura na qualidade de grãos. Visto o exposto, o presente estudo teve por objetivos avaliar amostras comerciais de arroz da América Latina, bem como amostras coletadas a campo sob diferentes manejos de água, fertilizantes e uso do solo; além de utilizar experimentos de curta duração em casa de vegetação para avaliar parâmetros morfofisiológicos em diferentes cultivares. Existe uma grande discrepância na concentração de As nas diferentes regiões testadas. Embora o fator genético (cultivar) tenha efeito sobre a concentração de As em grãos, os fatores ambiente e manejo são determinantes. Aparentemente, a cultivar BR-IRGA 409 apresenta uma maior suscetibilidade ao As, apresentando também uma menor translocação para os grãos, enquanto que cultivares com comportamentos tolerantes apresentaram um maior acúmulo deste elemento. A eficiência de uso de fósforo e a concentração de tióis não proteicos parecem estar relacionadas à tolerância ao As, sendo altamente pronunciadas em cultivares tolerantes. Finalmente, o As apresenta alto potencial genotóxico e oxidativo, sendo a principal anormalia observada a presença de micronúcleos. Palavras chave: Arsenito. Contaminação. Metaloide. Nutrição mineral. Oryza sativa.

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ABSTRACT

ARSENIC DYNAMICS IN THE SYSTEM SOIL - WATER - RICE IN SOUTH AMERICA: PHYSIOLOGICAL DISTINCTIONS BETWEEN CULTIVARS AND OCCURRENCE IN COMMERCIAL GRAINS

AUTHOR: Júlia Gomes Farias ADVISOR: Fernando Teixeira Nicoloso

Rice is the main source of inorganic arsenic (Asi), a carcinogenic substance, in the human diet. In this sense, there is great interest in reducing the accumulation of As in rice grains. To achive this, field management / rice processing and study of different cultivars have been explored. Globally, many countries that consume rice don’t produce it, or even specifics regions of a producer country. As to maintain the rice consumption these regions have to import rice, the identifycation of regions with low As is an important option to ensure food security for the consumers. However, the location of As free areas seems to be an incomplete solution; as there is a large demand for rice and the already considerable number of areas described as contaminated. Thus, it is necessary to use a set of information able to describe As levels in different areas, comparing cultivars, including specific mechanisms of tolerance and low translocation, besides the description of side effects such as levels of other minerals present in the grain and effect of soil management on grain quality. Given the above, this study aimed to evaluate commercial samples of rice in Latin America, as well as samples collected in the field under different managements of water, fertilizer and land use; in addition it was used short-term experiments in greenhouse were performed to evaluate morphophysiological parameters in different cultivars. There is a large discrepancy regarding As concentration among the different regions tested. Although the genetic factor (cultivar) has an effect on As concentration in grain, environmental and management factors are decisive. Apparently the cultivar BR-IRGA 409 presents a large susceptibility to As, also presenting a lower translocation to grains while cultivars described as tolerant had a higher accumulation of this element. The phosphorus use efficiency and the concentration of non-protein thiols appear to be related to tolerance, being highly pronounced in tolerant cultivars. Finally, As has a high potential to genotoxic and oxidative stress, and the main abnormality observed was the presence of micro-nuclei. Keywords: Arsenite. Contamination. Metalloid. Mineral nutrition. Oryza sativa.

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LISTA DE GRÁFICOS

Figura 1

Representação em diagramas das espécies de arsênio detectadas em plantas terrestres............................................................................................................... Figura 2 Possíveis rotas para a redução e metilação de arsênio por plantas terrestres com base em rotas para os organismos aquáticos e fungos......................................... Figura 3 Absorção de arsenito via raízes de arroz............................................................. Figura 4 Diagrama esquemático da absorção e metabolismo do arsênio em raízes de não hiperacumuladoras (a) e (b) hiperacumuladoras.................................................. Figura 5 Coleta de solo (A, B, C), lavoura de arroz durante o estágio vegetativo (D, E), separação de colmo principal e perfilhos marcados (F)....................................... Figura 6 Amostras de arroz no freeze drier (A, B, C). Máquina para moagem de arroz com esferas de zircônio (D, E, F)......................................................................... Figura 7 Sistema experimental utilizado demonstrado em três estágios, climatização, exposição e recuperação....................................................................................... Figura 8 Plântulas de arroz cinco dias após a germinação (A). Retirada da raiz seminal (B). Sistema de cultivo com raiz intacta (C) sem as (D) e com As (E). Sistema com raízes divididas (F, G, H, I)……………………………………………….. Figura 9 Experimento com areia em vasos (A, B, C, D, E) e hidroponia floating (G, H). Figura 10 Esquema prático do manejo de água, sem supressão (T1), com uma supressão (T2) e com três supressões (T3), locais e níveis de fósforo.................................. MANUSCRITO 1 Figure 1 Schematic map of rice production sites................................................................ Figure 2 Soil use management in different areas of southern Brazil…………………….. Figure 3 Geographical distribution of organic matter, phosphorus and iron in rice fields from southern Brazil……………………………………………………………. Figure 4 Geographical distribution of arsenic in soil (A), and grains (B, C) in rice fields from southern Brazil…………………………………………………………… Figure 5 Distribution of DMA, As V and total arsenic concentrations.............................. Figure 6 Rice production in Brazil (according to Global Rice Science Partnership GriSP- 2013) and percentage of samples suitable for infants and young children’s food according to Commission Regulation (EU) 2015 (0,10 mg Asi/ Kg)........................................................................................................................ Figure 7 Estimated daily intake of Asi considering the potential health risk for Brazilians of different regions, based on the POF/IBGE..................................... Figure 8 Arsenic species relationship to sum of species of total As...................................

22 26 30 32 39 40 44

49 51 53 60 62 63 64 67

70 71 72

MANUSCRITO 2 Figure 1 Liquid Chromatography Profile High Efficiency R. officinalis extract under the concentration of 5 g L-1 (right side) and 20 g L-1(right side)………………….. 88 Figure 2 Cytogenetic analysis
of meristematic cells obtained from A. cepa radicles exposed to arsenic……………………………………………………………… 92 MANUSCRITO 3 Figure 1 Practical scheme of the experimental design used in this study………………... 105 Figure 2 Biomass and root system parameters of rice plants of three cultivars exposed to 100 μM arsenic (+As) and without arsenic (–As), with phosphorus 0.09 mM (+P) and without phosphorus (–P) in nutrient solution…………………………. 108 Figure 3- Effect of phosphorus levels with or without arsenic exposure in rice plants on

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total root length increment (percentage inside the box) of plants after five days in control solution, recovery stage……………………………………………… Figure 3- Inorganic arsenic (Asi) concentration in shoot tissues of BR-IRGA 409, IRGA 423 and IRGA 24 cultivars under phosphorus starvation (-P) and normal supply (+P)……………………………………………………………… Figure 5- Arsenic species relationship to sum of species of total As for BR-IRGA 409, IRGA 423 and IRGA 424 cultivars in shoot tissue samples……………………. Figure 6 Biomass and root system parameters of rice plants of three cultivars exposed to 100 μM arsenic (+As) and without arsenic (–As), with phosphorus 0.09 mM (+P) and without phosphorus (–P) in nutrient solution…………………………………. Figure 7- Phosphorus use efficiency of rice plants of three cultivars exposed to 100 μM arsenic (+As) and without arsenic (–As)………………………………………. Figure 8 Phosphorus use efficiency (PUE) relationship to sum of species of total As, shoot dry weight, root dry weight and total root length for BR-IRGA 409, IRGA 423 and IRGA 424 cultivars in shoot tissue samples…………………… MANUSCRITO 4 Figure 1 Effect of As exposure on the total length of adventitious roots (AR) per seedling (A), average length of AR per seedling (B) and number of adventitious roots per seedling (C)……………………………………………… Figure 2 Rice roots exposed to different As levels during 10 days under hydroponic system. Were collected both mature (with lateral roots) and young roots in order to characterize the morphological As effects…………………………….. Figure 3 Effect of As levels on rice plants grown under split root system………………. Figure 4 Effect of As exposure on non-protein thiol groups (NPSH) concentration in both shoot and root tissues……………………………………………………… MANUSCRITO 5 Figure 1 Effect of increasing As level on panicle lengh and grain production of five rice cultivars (BR/IRGA 409, BR/IRGA 410, IRGA 420, IRGA 423 and IRGA 424 exposed to different As levels (0, 2 and 10 μM)…………………………... Figure 2 Biplot graphic of scores and weights (loadings) for the fisrt two principal componentes (PC1 and PC2) for mineral evaluation in rice plants exposed to different As levels………………………………………………………………. MANUSCRITO 6 Figure 1 Experiment locations in Southern Brazil. Experiment I Cachoeirinha, Camaquã and Restinga Seca; experiment II Bagé............................................................... Figure 2 Practical scheme of irrigation systems used and overview of three localities evaluated…………………………………………………….………………… Figure 3 Rice grain yield under different water managements and locals, A, B Restinga Seca; C, D Cachoeirinha, and cultivars A, C BR-IRGA 409 and B, D IRGA 425……………………………………………………………………………… Figure 4- Rice grain yield under different water managements, aerobic, with center pivot irrigation; and Flooded………………………………………………………… Figure 5- Arsenic in rice grains of experiment I and II…………………………………… Figure 6- Acid phosphatase activity (Apase) in main culm and tillers flag leaves under different phosphorus levels and cultivars BR-IRGA 409 and IRGA 425……… Figure 7 - APA activity under different phosphorus levels, irrigation system of the cultivars BR-IRGA 409 and IRGA 425………………………………………… Figure 8- TBARS concentration in main culm and tillers flag leaves under different

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111 113

114 115

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131 134 141

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181 182 183 186 187 188

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phosphorus levels………………………………………………………………. Figure 9 Rice grains yield relationship to phosphatase activity in soil (A), Main culm flag leaf (B) and tillers flag leaf (C)…………………………………………………. 189 Figure 10 -Rice grains yield relationship to TBARS in Main culm flag leaf (A) and tillers flag leaf (B)…………………………………………………………………….. 190

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Ensaios de citogenética com exposição ao arsênio................................................... 35 MANUSCRITO 1 Table 1 Estimated weekly intake of aluminum and potential health risk due to consumption of rice for Latin Americans, based on the provisional tolerable weekly intake (PTWI) by JECFA, 2014.................................................................. 67 Table 2 Comparison of arsenic species composition in rice samples from different countries and studies................................................................................................. 68 MANUSCRITO 2 Table 1 Concentration of phenolic compounds, mg g-1, in extracts of R. officinalis, prepared with two concentrations (5g of leaves L-1 and 20 g of leaves L-1)……… 87 Table 2 Chemical composition of Rosmarinus officinalis volatile oil…………………….. 90 Table 3 Effect of Rosmarinus officinalis oil and extract on mitotic index and chromosomal aberrations in root tip cells of A. cepa exposed to arsenic…………………………. 91 Table 4 Levels of H2O2, TBARS and POD in cells obtained from Allium cepa radicles exposed to arsenic and Rosmarinus officinalis oil and extract…………………….. 94 MANUSCRITO 4 Table 1 Effect of Arsenic exposure on root length and root dry weight…………………… 129 Table 2 Effect of Arsenic exposure on Arsenic concentration in root and shoot tissues..… 136 Table 3 Effect of Arsenic exposure on Sulfur concentration in root and shoot tissues……. 137 Table 4 Effect of Arsenic exposure on Arsenic concentration in root and shoot tissues under split root system……………………………………………………………………………… 138 Table 5 Effect of Arsenic exposure on Sulfur concentration in root and shoot tissues under split root system…………………………………………………………………………….... 139 MANUSCRITO 5 Table 1 Effect of Arsenic exposure on root length, shoot length, number of leaves and plant dry weight……………………………………………………………………. 153 Table 2 Effect of Arsenic exposure on shoot and root growth……………………………... 154 Table 3 Effect of Arsenic exposure on main culm and tillers length, number of tillers, weight of 100 unitis of polished grains, panicle length and panicle production….. 155 Table 4 Effect of Arsenic exposure on Arsenic concentration in root and shoot tissues…… 156 Table 5 Effect of Arsenic exposure on Arsenic concentration in external bran and polished grains of main culm and tillers……………………………………………………. 157 Table 6 Table 7

Table 8

Effect of Arsenic exposure on mineral nutrient concentration of shoot tissue of rice plants after five days of exposure in hydroponic system………………………………………… 159 Effect of Arsenic exposure on mineral nutrient concentration of root tissue of rice plants after five days of exposure in hydroponic system………………………………………… 160

Effect of Arsenic exposure on mineral nutrient concentration of shoot tissue of rice plants after five days of exposure in hydroponic system……………………… 161 Table 9 Effect of Arsenic exposure on mineral nutrient concentration of root tissue of rice plants after five days of exposure in hydroponic system………………………….. 162 Table 10 Effect of Arsenic exposure on macronutrients of external bran and polished grains of main culm and tillers…………………………………………………………… 163 Table 11 Effect of Arsenic exposure on micronutrients of external bran and polished grains of main culm and tillers…………………………………………………………… 164 MANUSCRITO 5

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Table 1 Table 2 Table 3

Chemical and physical properties of soils used for rice production……………… 176 Effect of cultivar on rice grain yield in three locations of Rio Grande do Sul…..... 179 Effect of water management on rice grain yield in three locations of Rio Grande do Sul state………………………………………………………………………… 180

Table 4

Effect of phosphorus increment on rice grain yield in three locations of Rio Grande do Sul state……………………………………………………………………………………. 180

MANUSCRITO 6 Table 1 Person’s correlation among soil chemical characteristics of rice areas……………. 168 Table 2 Arsenic concentration in main and tillers of three rice cultivars grown in southern Brazil………………………………………………………………………………. 172 Table 3 Rice grain yield of three cultivars grown in southern Brazil……………………… 173

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SUMÁRIO

1 APRESENTAÇÃO................................................................................................. 1.2 REFERENCIAL TEÓRICO..................................................................................... 1.2.1 Arsênio: características, abundância e quantificação.......................................... 1.2.2 Solo, o grande receptor de resíduos e seu valor de preservação......................... 1.2.3 Arsênio e o meio ambiente...................................................................................... 1.2.4 Arsênio: toxicidade para plantas e animais.......................................................... 1.2.5 Dinâmica do arsênio em áreas de rizicultura...................................................... 1.2.6 Variedades resistentes e não resistentes ao arsênio.............................................. 1.2.7 Exposição ao arsênio e estresse oxidativo de plantas........................................... 1.2.8 Arsênio: toxicidade aos seres humanos................................................................. 1.2.9 Estratégias de mitigação........................................................................................ 1.3 PROPOSIÇÃO......................................................................................................... 1.4 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 1.4.1 Manuscrito1............................................................................................................. 1.4.1.1Amostras de solos e arroz........................................................................................ 1.4.1.2Análise química........................................................................................................ 1.4.1.3Mapas de distribuição espacial................................................................................ 1.4.1.4Amostras comerciais de arroz.................................................................................. 1.4.1.5Especiação de As...................................................................................................... 1.4.1.6Estimativa da ingestão de espécies de arsênio diárias............................................ 1.4.1.7análise estatística..................................................................................................... 1.4.2 Manuscrito 2........................................................................................................... 1.4.2.1Cultivo da Allium Cepa e Rosmarinus Officinalis................................................. 1.4.2.2Obtenção de extrato aquoso e óleo essencial de alecrim..................................... 1.4.2.3Análise citogenética (teste Allium cepa)................................................................... 1.4.2.4Análises bioquímicas e enzimas................................................................................ 1.4.2.5Análise estatística...................................................................................................... 1.4.4 Manuscrito 3........................................................................................................... 1.4.4.1Plantas e condições de crescimento.......................................................................... 1.4.4.2Análise dos elementos As e P.................................................................................... 1.4.4.3Análise de dados........................................................................................................ 1.4.2 Manuscrito 4........................................................................................................... 1.4.2.1Plantas e condições de crescimento......................................................................... 1.4.2.2Experimento hidropônico com e sem a presença de raiz seminal........................... 1.4.2.3Experimento hidropônico com um sistema radicular intacto................................... 1.4.2.4Experimento hidropônico com um sistema raiz-dividida..................................... 1.4.2.5Biomassa, e conteúdo nutriente mineral................................................................. 1.4.2.6Concentração Grupos tióis não-protéicos (NPSH)..................................................

18 19 20 24 25 27 28 31 32 34 35 36 36 37 37 37 38 39 39 40 41 41 41 41 42 42 42 43 43 43 45 39 39 39 39 40 40 40

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1.4.2.7Análise estatística...................................................................................................... 41 1.4.5 Manuscrito 5............................................................................................................ 49 1.4.5.1Plantas e condições de crescimento.......................................................................... 49 1.4.5.2Experimento hidropônico.......................................................................................... 49 1.4.5.3Experimento em vasos contendo. areia.................................................................... 50 1.4.5.4Análise de crescimento da Planta............................................................................ 50 1.4.5.5A análise multivariada............................................................................................. 50 1.4.6 Manuscrito 6............................................................................................................ 47 1.4.6.1Experimento I............................................................................................................ 47 1.4.6.2Experimento II........................................................................................................... 48 2 MANUSCRITO 1 - COMPREHENSIVE EVALUATION OF ARSENIC OCCURRENCE IN SOIL AND RICE GRAINS FROM SOUTH AMERICA 54 1 INTRODUCTION.................................................................................................... 54 2 MATERIALS AND METHODS.............................................................................. 55 2.1 Rice sourcing……………………………………………………………………… 55 2.2 Chemical analysis………………………………………………….……………. 56 2.3 Estimation of arsenic species and aluminum daily intake …………………….. 58 2.4 Stastistics………………………………………………………………..………… 58 3 RESULTS AND DISCUSSION............................................................................... 58 4 CONCLUSION........................................................................................................ 67 REFERENCES......................................................................................................... 68 3 MANUSCRITO 2 - CHEMICAL PROPERTIES AND PROTECTIVE EFFECT OF Rosmarinus officinalis: MITIGATION OF LIPID PEROXIDATION AND DNA-DAMAGE FROM ARSENIC EXPOSURE… 78 INTRODUCTION.................................................................................................... 79 MATERIALS AND METHODS.............................................................................. 80 Plant cultivation………………………………………………………………….. 80 Preparation of aqueous extracts………………………………………………… 81 Extraction of volatile oil of rosemary…………………………………………… 81 High Performance Liquid Chromatography…………………………………… 81 Chromatographic analysis of the volatile oil of Rosmarinus officinalis………. 82 Identification of the components………………………………………………… 83 Cytogenetic analysis……………………………………………………………… 83 Biochemical parameters…………………………………………………………. 84 Non specif peroxidase activity…………………………………………………. 85 Statistical analysis……………………………………………………………… 86 RESULTS AND DISCUSSION............................................................................... 86 Chromatography and cytogenetic analysis…………………………………… 86 Oxidative stress…………………………………………………………………… 92 CONCLUSION........................................................................................................ 94 REFERENCES......................................................................................................... 95 4 MANUSCRITO 3 - ARSENIC UPTAKE AND METABOLISM IN RICE 101

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5

5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.3 5.3.1 5.2.2 5.4 5.5 6

6.1 6.2 6.2.1 6.2.2 6..2.3 6.2.4 6.3 6.3.1

CULTIVARS DIFFERING IN USE EFFICIENCY AND RESPONSE TO PHOSPHORUS....................................................................................................... INTRODUCTION.................................................................................................... MATERIALS AND METHODS.............................................................................. Plant materials and growth conditions…………………………………………. Tissue elements analysis ………………………………………………………… Data analysis …………………………………………………………………… RESULTS AND DISCUSSION............................................................................... CONCLUSION........................................................................................................ REFERENCES......................................................................................................... MANUSCRITO 4 - MORPHOLOGICAL, MINERAL AND BIOCHEMICAL ADAPTATIONS TO ARSENIC-INDUCED STRESS IN INDICA RICE CULTIVARES. ........................................................................... INTRODUCTION.................................................................................................... MATERIALS AND METHODS.............................................................................. Plant materials and growth conditions…………………………………………. Biomass, As and mineral nutrient content determination……………………... Statistical analysis ……………………………………………………………….. RESULTS AND DISCUSSION............................................................................... Morpho-physiological adaptive capacity of roots……………………………… Biochemical and mineral response to As contamination………………………. CONCLUSION........................................................................................................ REFERENCES......................................................................................................... MANUSCRITO 5 - DIFFERENTIAL PARTITIONING OF ARSENIC AND MINERAL NUTRIENTS BETWEEN THE MAIN CULM AND TILLERS OF RICE CULTIVARS INTRODUCTION.................................................................................................... MATERIALS AND METHODS.............................................................................. Plant materials and growth conditions…………………………………………. Plant growth analysis…………………………………………………………….. Determination of the As and mineral nutrient concentrations ……………….. Multivariate analysis…………………………….........................................…… RESULTS AND DISCUSSION.............................................................................. Biomass and As concentrations in reproductive and vegetative organs………..........................................................................................................

6.3.2 Mineral nutrition of the shoot, root and grain tissues………………..........................................................................…………………..

103 103 103 105 106 107 116 118

123 123 124 124 126 127 127 127 135 141 142

147 147 148 148 149 150 150 150 150

158 6.3.3 Plant clustering by multivariate analysis……………………………………….. 166 6.4 CONCLUSION........................................................................................................ 168 6.5 REFERENCES......................................................................................................... 168 7 MANUSCRITO 6 - RELATIONSHIPS BETWEEN WATER MANAGEMENT AND ARSENIC ACCUMULATION IN RICE GRAINS UNDER DIFFERENT NUTRICIONAL LEVELS........………………………. 172 7.1 INTRODUCTION.................................................................................................... 172

17

7.2 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.3 7.3.1 7.3.2 7.3.3 7.4 6.5 8 9

MATERIALS AND METHODS.............................................................................. 173 Experimental system…………………………….................................………… 173 Soil analysis………………………………………………………………………. 175 Tissue elements analysis…………………………………………………………. 176 Biochemical Analysis……………………………………………...…………... 177 Statistics…………………………………………………………………………… 178 RESULTS AND DISCUSSION............................................................................... 178 Grain yield ……………………………………………………………………….. 178 Arsenic in rice grains…………………………………………………………….. 184 Biochemical analysis……………………......................................................…… 1851 CONCLUSION........................................................................................................ 191 REFERENCES......................................................................................................... 158 DISCUSSÃO............................................................................................................ 196 CONCLUSÃO......................................................................................................... 200 REFERENCIAS...................................................................................................... 202

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1. APRESENTAÇÃO Neste estudo buscou-se o esclarecimento e a caracterização da relação entre arsênio (As) e planta, sob diferentes módulos experimentais, e predição de possíveis efeitos para a saúde humana. Através de um enfoque acadêmico, uma série de experimentos foi realizada. O trabalho iniciou com um quadro global, onde avaliou-se amostras de arroz comerciais em diferentes países da América Latina quanto aos níveis de As ocorrente. Posteriormente, avaliando-se experimentos em casa de vegetação, com experimentos em hidroponia floating e com areia, a fim de determinar diferenças específicas entre cultivares e sistemas. Finalmente partimos para experimentos a campo, onde manejo, solo e cultivares foram avaliados juntos, sendo consideradas suas inter-relações para o acúmulo de As em grãos. No manuscrito final, esta tese demonstra o efeito do As a nível celular, mais especificamente na avaliação de danos à cromossomos. Este trabalho buscou não somente caracterizar o problema, mas também, ainda que de uma forma sutil, mostrar alternativas ao mesmo: seja no manejo do solo, na escolha de cultivares ou ainda com mudanças sutis em nossa alimentação. Existem dois fatores fundamentais que sustentam a pesquisa científica: I) O problema, pois só se faz pesquisa frente a algo que deva ser melhorado, incorporado, modificado, ou que seu contexto atual não seja adequado, satisfatório ou ainda que represente algo prejudicial; II) A curiosidade do pesquisador. Uma vez identificado o problema, o fator curiosidade torna-se fundamental para um desenvolvimento satisfatório e que culmine em uma descoberta ou inovação de sucesso. O As têm recebido atenção crescente principalmente em produtos a base de arroz ou mesmo grãos de arroz in natura; especialmente pela comunidade europeia e norte americana. Sendo a América do Sul , em especial o Brasil, um grande produtor de arroz, e tendo em vista a carência de trabalhos caracterizando amostras produzidas nesta região, justifica-se uma abordagem detalhada a qual inclui desde experimentos em casa de vegetação, à coletas a campo e análise de amostras comerciais. Este trabalho tem como hipótese: “existe ocorrência de arsênio em grãos de arroz produzidos na América do Sul, com alta variabilidade de concentração, sendo esta dependente do material genético, local de produção e manejo agrícola”.

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1.2 REFERENCIAL TEÓRICO

A contaminação ambiental por metais pesados tem despertado crescente interesse de órgãos vinculados à pesquisa. Isto devido a problemática ambiental e eminente risco à saúde humana, bem como pelos resultados de estudos mais específicos. Este fato tem resultado em um significativo avanço em diferentes linhas de pesquisa, como fitoremediação, fitointoxicação e contaminação alimentar. Neste cenário, a contaminação por As tem recebido atenção especial, devido à extensa área agricultável contaminada já descrita e pela significativa entrada deste elemento na cadeia alimentar, via água, animais e vegetais contaminados (IARC, 2004; ZHAO et al., 2010; ZHAO et al., 2013, CAREY et al., 2015; SIGNES-PASTOR et al., 2016). Em humanos, o As ingerido a partir do consumo do arroz pode ser substancial, pois o arroz (Oryza sativa) é particularmente eficiente em absorver As, podendo também translocálo para os grãos (MA et al., 2008). Além de fatores relacionados à entrada e ao acúmulo de As na cadeia alimentar humana, é importante também avaliar o efeito do As na produção agrícola, bem como na qualidade nutricional dos grãos. A contaminação por As pode diminuir sensivelmente a altura de plantas, o rendimento da produção de grãos, raiz e biomassa total (ROBERTS et al., 2012), sendo também responsável por alterações na concentração de nutrientes dos grãos (LOMBI et al., 2009). Notavelmente, fatores referentes ao solo (pH, óxidos, fósforo e enxofre) juntamente com clima e condições hídricas (solo drenado ou inundado) são determinantes para ocorrência de diferentes espécies de As, bem como de formas de absorção das mesmas por vegetais. Dentre estes, o ferro (Fe) tem um papel fundamental no ciclo do As, atuando tanto como agente de adsorção como agente redutor, de acordo com o nível de umidade do solo. Assim, o As apresenta comportamento divergente em solos bem drenados em relação a solos saturados de água. Adicionado a esta equação, temos o fator genético vegetal como outro determinante na cinética de absorção e acúmulo deste metal (YAMILY et al., 2008; ZIA et al., 2010). O fluxo de nutrientes no sistema solo-planta envolve mecanismos complexos, muitos deles relacionados à transformação e à mobilização dos nutrientes pela biota do solo (RHEINHEIMER et al., 1999). Adicionalmente, este fluxo é diretamente afetado pela combinação de nutrientes coexistente em um dado momento. Nesse sentido, o fósforo (P), que é um elemento essencial para o crescimento e desenvolvimento das plantas, também pode atenuar o estresse por metais pesados, através processos de complexação e aumento na

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produção de biomassa e, consequentemente, diluição de metal nos tecidos (MARSCHNER, 1995). Embora em solos com elevado nível de inteperização, percentual de argila e pH ácido o conteúdo total de P do solo esteja geralmente elevado, a disponibilidade de P é frequentemente um fator limitante para o crescimento das plantas e sua produtividade. Este paradoxo surge porque a concentração de Pi disponível na solução do solo é cerca de 1 µM e raramente excede 10 μM (BIELESKI, 1973). Nos solos que sofrem ciclos de umedecimento e drenagem, como os solos de várzea, a disponibilidade de P mostra-se mais complexa que em solos bem drenados, visto que as reações de redução, hidrólise e solubilização de diversos compostos influem no teor de P disponível. Atualmente existe um banco de dados considerável em relação à absorção, especiação e acúmulo de As em plantas de arroz, bem como ocorrência de As em regiões diversas do mundo (MA et al., 2006, MA et al., 2008). Entretanto, são poucas as informações sobre os mecanismos de translocação do As entre colmo principal e perfilhos de arroz, bem como a interação da fitointoxicação com os parâmetros nutricionais da planta e do solo, além da qualidade de grãos comerciais e o impacto de diferentes manejos nos aspectos anteriormente citados. O histórico de rizicultura e a proximidade com regiões onde foram descritas contaminações por As além do potencial produtivo da América Latina, a qual exporta arroz para um considerável número de países da África e Europa, justificam a investigação e a caracterização de diferentes áreas da América do Sul. Sendo o Brasil o principal produtor de arroz, uma descrição mais detalhada das diferentes regiões produtoras foi proposta, de forma que o conhecimento do mecanismo da aquisição do As pelo arroz e suas relações com manejo e cultivares permita estudar estratégias para a redução do acúmulo de As nos grãos, reforçando a segurança dos alimentos, através do uso de diferentes genótipos, manejo de água e fertilização.

1.2.1 - Arsênio: características, abundância e quantificação

O arsênio (do latim arsenium; do grego arsenikos = potente), ou também arsênico, é um elemento químico, de símbolo As, com número atômico 33 e massa atômica de 75 g mol1

. É um semimetal (ou metaloide) encontrado no grupo 15 (5A) da Classificação Periódica dos

Elementos. Distribui-se de maneira relativamente uniforme nos principais tipos de rochas e sua concentração média está entre 0,5-2,5 mg kg-1. Apenas em sedimentos argilosos a média

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pode atingir valores mais expressivos, cerca de 13 mg kg-1 (KABATA PENDIAS, 2001; FAURE, 1991). Desde sua descoberta pelo alquimista alemão Albertus Magnus (1193-1280), este elemento foi extensamente explorado. Embora hoje o As seja um elemento notavelmente tóxico, ele já foi muito utilizado como defensivo agrícola e também no tratamento de doenças de pele e sífilis em humanos (MORENO-JIMÉNEZ et al., 2012). O As está associado a depósitos minerais, sendo frequentemente encontrado junto com S, Se e Te. Numerosos minerais de As são o resultado da oxidação de depósitos de sulfetos. Estes são os arsenatos e arsenitos, em que o As é combinado com algum metal (por exemplo, Fe, Pb e Cu). O mais comum dos arsenominerais, porém, é um sulfeto, a arsenopirita (FeAsS) (KABATA PENDIAS, 2001; FRANKENBERGER Jr, 2002). A arsenopirita é o mineral de As mais comumente encontrado no Brasil, associado a outros minerais originados por hidrotermalismo (MATSCHULLAT, 2007). A exposição de minerais sulfatados a condições oxidantes pode desencadear reações irreversíveis que causam severa acidificação do meio, processo conhecido por drenagem ácida. Além da severa acidificação causada pelo intemperismo rápido destes minerais, quando expostos a condições oxidantes, a dispersão do As no ambiente e contaminação de solos e águas subterrâneas são os principais problemas ambientais gerados pela atividade de mineração. Embora os arseno-minerais e compostos de As sejam facilmente solúveis, a migração de As é limitada, devido à forte adsorção por argilas, óxidos e matéria orgânica. O enriquecimento de As em solos e sedimentos argilosos, bem como em solos superficiais, em relação às concentrações em rochas ígneas, aparentemente refletem algumas fontes externas de As, tais como erupções vulcânicas e poluição, como também o enriquecimento supergênico natural dos elementos pouco móveis, durante o intemperismo das rochas e a formação do solo. No solo, o As também está presente na fração mineral pesada do solo, mas sua contribuição é pequena (geralmente cerca de 1%). A maior proporção do total de As (2790%) no solo está associada com a fração argila ( 0/20 [20] = 0/50 [50] = 25/25 (Figure 3). We observed an interesting pattern in response to As for the IRGA 424 cultivar. This cultivar showed the highest sensitivity to As in the total length of adventitious roots with direct or indirect exposure to As (Figure 3). Interestingly, this cultivar maintained the average length of adventitious roots in halves without direct exposure to As; however, a decrease in the number of roots was observed (Figure 3). In the root halves where there was a reduction in the average length and direct exposure to As (treatments 0/20 and 0/50), an increase in the number of adventitious roots was noticed (Figure 3). This result suggests a different strategy in relation to the use of assimilates under As exposure. From examining the raw data of dry weight, a default behavior exists between the cultivars exposed to As. However, in further evaluating the root system it seems that there are a number of distinctions among the tested cultivars.

5.2.2 Biochemical and mineral response to As contamination

In the experiment with intact roots, all of the cultivars showed an increase in sulfur (S) concentration in the root tissue with increasing As levels in the nutrient solution. This increase was followed by an increase in the root tissue As. However, in the shoot tissue, there

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was an increase in the As concentration followed by a decrease in the S tissue concentration (Table 2, 3). Excess metals/metalloids are harmful to plants because they alter the metabolism. These elements stimulate the formation of reactive oxygen species (ROS). The increased production of ROS during stress can be a threat to the cells, but ROS production may signal the activation of the defense processes and stress response (SCANDALIOS, 1997). Whether the effect of ROS is beneficial is determined by the delicate balance between ROS production and scavenging at the local and temporal levels through the action of the antioxidant defense system. This metabolic imbalance and the consequent formation of ROS are directly related to the ability of the plant to reduce/prevent the absorption and translocation of elements to toxic levels.

Table 2 - Effect of Arsenic exposure on Arsenic concentration in root and shoot tissues. Cultivar

BR/IRGA 409

BR/IRGA 410

IRGA 420

IRGA 423

IRGA 424

As concentration μM

Arsenic concentration μg g -1 root

shoot

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