mycobacterium avium - Université de Sherbrooke

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ANALYSE DE L’EXPRESSION GÉNIQUE DES MACROPHAGES BOVINS FACE À LA MALADIE DE JOHNE ET LEUR RÉPONSE À L’INFECTION IN VITRO PAR MYCOBACTERIUM AVIUM SOUS-ESPÈCE PARATUBERCULOSIS

par

Olivier Ariel

Mémoire présenté au Département de biologie en vue de l’obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)

FACULTÉ DES SCIENCES UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE

Sherbrooke, Québec, Canada, août 2017

Le 25 août 2017

Le jury a accepté le mémoire de Monsieur Olivier Ariel dans sa version finale.

Membres du jury

Professeure Nathalie Bissonnette Directrice de recherche Professeure associée au Département de biologie Chercheur Scientifique d’Agriculture et Agroalimentaire Canada

Professeur Nicolas Gévry Codirecteur de recherche Département de biologie

Professeur Viktor Steimle Membre interne Département de biologie

Professeur Pierre-Étienne Jacques Président-rapporteur Département de biologie

SOMMAIRE

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) est l’agent pathogène responsable de la maladie de Johne qui est aussi connue sous le nom de paratuberculose. Cette maladie affecte principalement les ruminants, mais également d’autres animaux d’élevages et sauvages. Les mécanismes de pathogenèse de la paratuberculose sont toujours peu compris, mais il est connu que MAP est capable de s’évader du système immunitaire de son hôte pendant plusieurs années en utilisant les macrophages comme réservoir principal. L’effet de MAP dans l’infection des macrophages est souvent étudié en utilisant des vaches saines ou encore infectées de façon expérimentale, mais les études sur l’effet à long terme de la paratuberculose en étudiant les macrophages de vaches atteintes sont manquantes. Dans mon projet, le transcriptome de macrophages primaires dérivés des monocytes circulants infectés in vitro par MAP a été analysé par séquençage haut débit de l’ARN (RNA-seq). Des différences importantes dans les interactions hôtes-pathogènes ont été observées dans les signatures d’expression génique des vaches diagnostiquées comme négatives ou positives. Ces modifications mettent en lumière la mise en place de processus durables dans l’établissement de la paratuberculose. Les modifications clés observées lors de mon projet sont un débalancement immunométabolique, un changement dans l’homéostasie du cholestérol et des lipides intracellulaires, ainsi qu’un patron d’expression génique associé à l’établissement d’une tolérance mémoire chez les macrophages. En effet, les résultats obtenus lors de ce projet consolident l’hypothèse selon laquelle MAP pourrait induire un état de type tolérance dans les monocytes sanguins périphériques circulants lorsqu’ils se différencient en macrophages. De ce fait, MAP pourrait promouvoir davantage la persistance de la maladie en influençant le comportement des macrophages à long terme. Cette étude contribue à une meilleure compréhension du contrôle de MAP sur les cellules immunitaires et de ses mécanismes de survie.

iv

Mots-clés : paratuberculose, macrophage bovin, vaches laitières, séquençage haut débit d’ARN, transcriptome, immunité innée, immunité mémoire, métabolisme des lipides

v

REMERCIEMENTS

En premier lieu, j’aimerais exprimer ma très grande gratitude envers ma directrice de maîtrise Dre. Nathalie Bissonnette pour m’avoir accueilli dans son laboratoire et m’avoir offert la chance de développer mes habilités scientifiques et professionnels. À l’intérieur de son laboratoire, Nathalie m’a permis de me dépasser et de concilier mes nombreux intérêts : les travaux pratiques à la ferme et le laboratoire, la biologie moléculaire et la bio-informatique. Cet équilibre a fait de ma maîtrise un parcours enrichissant, stimulant et passionnant. Ma maîtrise n’aurait pas été la même si ce n’avait pas été des nombreuses personnes qui font ou ont fait partie de l’équipe du laboratoire. Merci à Catherine Thibault et Pier-Luc Dudemaine pour leur accueil et leurs formations techniques ainsi que Jean-Simon Brouard, Daniel Gendron et Gérald Bernatchez pour leur sagesse et leurs nombreux conseils. J’aimerais également exprimer un merci tout spécial à David Fock-Chow-Tho qui m’a beaucoup aidé lors de ma maîtrise et avec qui j’ai partagé plusieurs moments lors de mon parcours aux études gradués. Je veux remercier mon comité de conseillers pour leurs recommandations et nombreux conseils très appréciés au cours de mon projet de maîtrise et particulièrement mon codirecteur Dr Nicolas Gévry pour avoir permis la réalisation de ce projet. Je veux également saluer l’aide précieuse des employés de l’étable du Centre de recherche et développement de Sherbrooke lors des prélèvements de mon projet ainsi que les producteurs laitiers du Québec pour leurs efforts constants et leur dévouement.

vi

Finalement, j’aimerais dédier ce mémoire à ma famille et plus particulièrement à mes parents Diane Houle et François Ariel. Ceux-ci ont toujours été à mes côtés pour me supporter et m’encourager dans les bons et moins bons moments de ma vie et de mon cheminement universitaire. Ils sont une grande inspiration et une source de motivation pour moi. Merci pour tout ! « N’oublie pas qui tu es! » Le Roi Lion - 1994

vii

TABLE DES MATIÈRES

SOMMAIRE .............................................................................................................................. iv REMERCIEMENTS ................................................................................................................. vi TABLE DES MATIÈRES ....................................................................................................... viii LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... xiii LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. xv CHAPITRE 1 INTRODUCTION ............................................................................................ 17 1.1

L’industrie laitière au Canada et les maladies des bovins laitiers ............................ 17

1.2

Les mycobactéries et MAP ....................................................................................... 18

1.2.1

Le genre Mycobacterium .................................................................................. 18

1.2.2

Le complexe Mycobacterium avium (MAC) et MAP ...................................... 21

1.2.3

Culture in vitro de MAP ................................................................................... 22

1.2.4

Dissémination environnementale de MAP ....................................................... 23

1.2.5

Potentiel zoonotique de MAP ........................................................................... 24

1.3

La paratuberculose .................................................................................................... 26

1.3.1

Historique ......................................................................................................... 26

1.3.2

Mécanisme d’infection ..................................................................................... 27

1.3.3

Transmission et évolution de la maladie .......................................................... 29

1.3.4

Susceptibilité génétique de l’hôte ..................................................................... 30

1.3.5

Diagnostic et traitement .................................................................................... 33

1.4

Le système immunitaire............................................................................................ 35

1.4.1

Rôles et constitution du système immunitaire .................................................. 35

1.4.2

Le système immunitaire inné ............................................................................ 36

1.4.3

Le système immunitaire adaptatif..................................................................... 38

1.4.4

La mémoire du système immunitaire inné ....................................................... 39

1.4.5

MAP et l’évasion du système immunitaire....................................................... 41 viii

1.5

Hypothèse et objectifs .............................................................................................. 43

CHAPITRE 2 ARTICLE RÉDIGÉ .......................................................................................... 45 2.1

Référence de l’article ................................................................................................ 45

2.2

Contribution des auteurs ........................................................................................... 45

2.3

Avant-propos de l’article .......................................................................................... 45

2.4

Article ....................................................................................................................... 47

2.4.1

Introduction ...................................................................................................... 49

2.4.2

Methodology..................................................................................................... 52

2.4.2.1

Ethical approval and consent to participate .................................................. 52

2.4.2.2

Animal selection and JD diagnosis ............................................................... 52

2.4.2.3

Monocyte isolation and MDM differentiation.............................................. 53

2.4.2.4

Bacterial preparation and in vitro MAP infection of primary macrophages 54

2.4.2.5

Fluorescent labelling of MAP in macrophages ............................................ 56

2.4.2.6

RNA extraction, Libraries and sequencing................................................... 56

2.4.2.7

RNA-seq read preparation and alignment .................................................... 57

2.4.2.8

RNA-seq gene expression evaluation ........................................................... 58

2.4.2.9

Functional analysis ....................................................................................... 59

2.4.2.10

RT-qPCR validation analysis ................................................................... 59

2.4.2.11

Statistical analysis .................................................................................... 60

2.4.2.12

Lipid accumulation assay ......................................................................... 61

2.4.3

Results .............................................................................................................. 62

2.4.3.1

Infection efficiency ....................................................................................... 62

2.4.3.2

Summary statistics for RNA-seq data .......................................................... 64

2.4.3.3

Global sample comparison using PCA ......................................................... 65

2.4.3.4

RNA-seq differential gene expression profiles ............................................ 67

2.4.3.4.1

Effect of in vitro MAP infection of macrophages from JD(−) cows ...... 67

2.4.3.4.2

Effect of in vitro MAP infection of macrophages from JD(+) cows ...... 68

ix

2.4.3.4.3 2.4.3.5

Effect of JD status on MAP-infected macrophages................................ 70

Functional analysis ....................................................................................... 72

2.4.3.5.1

Functional analysis of DE genes in in vitro MAP infection in JD(−) cows ................................................................................................................ 72

2.4.3.5.2

Functional analysis of DE genes in in vitro MAP infection in JD(+) cows ................................................................................................................ 81

2.4.3.5.3

Functional analysis of DE genes in uninfected macrophages from different JD status ................................................................................... 88

2.4.3.5.4

Functional analysis of DE genes in MAP-infected macrophages from different JD status ................................................................................... 91

2.4.3.6

qPCR and RNA expression comparison ....................................................... 96

2.4.3.7

Lipid accumulation assay ........................................................................... 100

2.4.4

Discussion....................................................................................................... 102

2.4.4.1

Lipid homeostasis ....................................................................................... 102

2.4.4.2

Immune response ........................................................................................ 104

2.4.4.3

Perspective of immune tolerance status...................................................... 107

2.4.5

Conflict of interest statement.......................................................................... 109

2.4.6

Author contributions ....................................................................................... 109

2.4.7

Funding ........................................................................................................... 110

2.4.8

Acknowledgements ........................................................................................ 110

2.4.9

References ...................................................................................................... 111

CHAPITRE 3 DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE .......................................... 126 BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................. 134

x

LISTE DES ABRÉVIATIONS

ADN

acide désoxyribonucléique

ADNc (cDNA)

ADN complémentaire

ARN

acide ribonucléique

CCL

chimiokine CC

Cellules M

cellule membraneuse (microfold cells)

CSF

facteur de stimulation cellulaire

CTL

contrôle

DE

différentiellement exprimé (differentially expressed)

˚C

degré Celcius

FDR

taux de faux positif (false discovery rate)

FPKM hpi

fragments par kilobase par million de séquences alignés heure post-infection

IFN

interféron

IL (1β, 2, 4, 10, 12)

interleukine

IPA

Ingenuity Pathway Analysis

JD

Maladie de Johne (Johne’s disease)

LPS

lypopolysaccharide

LXR

récepteur nucléaire des oxystérols

RXR

récepteur X de rétinoïdes

MAC

Complexe Mycobacterium Avium

MAP

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

MDM

macrophages dérivés de monocytes

mL

millilitre

xi

MOI

multiplicité d’infection

MTBC

Complexe Mycobacterium tuberculosis

MUGQIC

McGill University and Genome Quebec Innovation Center

NOD2

Récepteur NOD de type 2

ORO

oil red-O

PAMP

motifs moléculaires associés aux pathogènes

PBMC

cellules mononuclées du sang périphérique

PBS

tampon phosphate salin

PCA

analyse de composantes principales

PPAR

qPCR

récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires PCR quantitative

RNA-seq

séquençage de l’ARN à haut débit

ssp

sous-espèce

TLR

récepteur de type toll

µg

microgrammes

µL

microlitre

µM

micromolaire

PRR

xii

LISTE DES TABLEAUX

Chapitre 1 : Introduction Tableau 1.1

Gènes affectés par des variations génétiques associées à une plus

31

grande susceptibilité à la paratuberculose dans la littérature Chapitre 2 : Article rédigé Table 2.S1

Primers sequences used in the qPCR validation

60

Table 2.S2

Macrophages MAP infection percentage at each time point of the ex-

63

vivo infection measured using the fluorescence microscopy picture Table 2.S3

Detailed description and T-test analysis of total and aligned RNA-seq

64

reads (numbers, intra-intergenic proportion, exon-intron proportion and transcript/genes detected proportion) from both JD status groups. Table 2.1

Top 20 DE genes after MAP infection vs. uninfected CTL samples of

68

macrophages from JD(−) cows. Table 2.2

Top DE genes after MAP infection vs. uninfected CTL samples of

69

macrophages from JD(+) cows. Table 2.3

Top 20 DE RNA-seq genes1 between MDMs of JD (+) cows vs.

71

MDMs of JD (−) cows under different in vitro experimental conditions: uninfected controls (CTL) or different incubation periods in the presence of MAP, in order of log2 (fold change)1 Table 2.4

Top 20 IPA pathways over-represented by DE genes at the 8-hpi time

74

point in macrophages from JD(–) cows. Table 2.S4

Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes at 1hpi time point

75

in macrophages from JD (–) cows. Table 2.S5

Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes at 4hpi time point

76

in macrophages from JD(–) cows. Table 2.S6

Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes at 24hpi time

77

xiii

point in macrophages from JD(–) cows Table 2.S7

IPA pathways over-represented by down-regulated DE genes in

80

macrophages from JD(−) cows following MAP infection compared to uninfected macrophages (CTL). Table 2.S8

IPA pathways over-represented by DE genes at 4hpi time point in

81

macrophages derived from JD(+) cows Table 2.S9

Top networks of the IPA analysis over-represented by all DE genes

82

following infection in JD(−) MDM and between JD status time points. Table 2.S10

Top networks of the IPA analysis over-represented by up-regulated DE

84

genes following infection in JD(−) MDM and between JD status time points. Table 2.S11

Top networks of the IPA analysis over-represented by down-regulated

86

DE genes following infection in JD(−) MDM and between JD status time points. Table 2.5

Top 20 IPA pathways over-represented by DE genes in macrophages

89

from JD(+) compared to JD(–) cows at the control (CTL) time point. Table 2.S12

Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes between

92

macrophages from JD(–) cows compared to macrophages from JD(+)cows at 1hpi. Table 2.6

Top 20 IPA pathways over-represented by DE genes in macrophages

93

from JD(+) compared to JD(–) cows at the 8hpi time point. Table 2.S13

Top 30 IPA pathways over-represented (FDR adjusted p-value ≤ 0.05)

94

by DE genes between MDM derived from JD negative cows compared to MDM from JD positive cows at 4hpi. Table 2.S14

Top 30 IPA pathways over-represented (FDR adjusted p-value ≤ 0.05)

95

by DE genes between MDM derived from JD negative cows compared to MDM from JD positive cows at 24hpi.

xiv

LISTE DES FIGURES

Chapitre 1 : Introduction Figure 1.1

Position phylogénétique de MAP et de 15 autres mycobactéries de

20

l’ensemble du genre Mycobacterium. Figure 1.2

Schématisation des événements initiaux au niveau de la muqueuse

28

intestinale lors de l’infection par MAP. Figure 1.3

Représentation de l’effet des variants dans les gènes SLC11A1 et

32

NOD2 responsable d’une susceptibilité génétique accrue à la paratuberculose. Figure 1.4

Résumé des fonctions du système immunitaire inné et adaptatif lors

36

d’une infection. Figure 1.5

Résumé de l’activité biologique (A) et du remodelage épigénétique

40

(B) dans le cadre de la mémoire de l’immunité innée. Chapitre 2 : Article rédigé Figure 2.1

Experimental design.

55

Figure 2.2

Evaluation of MAP uptake by macrophages from Johne’s disease

63

negative (A) and Johne’s disease positive (B) cows. Figure 2.3

Principal component (PC) analysis of RNA-seq expression values

66

from macrophages of (A) Johne’s disease (JD) negative (JD(–)) cows, (B) JD positive (JD(+)) cows and (C) analysis of macrophage from both JD status groups. Figure 2.4

Number of differently expressed (DE) genes

67

Figure 2.5

IPA second most enriched pathway by DE genes at 8hpi compared to

78

controls in Johne’s disease negative macrophages: Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis pathway.

xv

Figure 2.6

Early signaling events in hepatic stellate cells of the IPA top-ranked

79

“Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation” pathway Figure 2.7

IPA LXR/RXR activation pathway significantly enriched by DE genes.

90

Figure 2.8

qPCR validation of DE genes for (A) CCL2, (B) CSF3, (C) IL1A, and

98

(D) IL10. Figure 2.S1

qPCR validation of DE genes for (A) IDO1, (B) HIF1A, (C) NOS2,

99

(D) GSR, and (E) GPX4. Figure 2.9

Lipid accumulation assay using Oil red-O staining.

101

xvi

CHAPITRE 1 INTRODUCTION

1.1

L’industrie laitière au Canada et les maladies des bovins laitiers

La production laitière au Canada est une activité économique importante au pays. En effet, on compte plus de 10 000 fermes laitières au Canada qui en 2015 ont produit plus de huit milliards de litres de lait (Canadian Dairy Information Centre, 2017). Ces fermes laitières sont principalement réparties au Québec et en Ontario, on compte plus de 80 % des troupeaux laitiers canadiens à l’intérieur de ces deux provinces. De plus, la production laitière au Canada est une des industries les plus importantes dans l’agriculture canadienne, mais également dans l’ensemble de l’économie du pays. Le secteur de la production laitière représente le premier ou le deuxième secteur le plus important de l’ensemble de l’économie de l’agriculture au Canada dans sept provinces sur dix. La production laitière à elle seule représente plus de 115 000 emplois et ce chiffre augmente à plus de 220 000 emplois si l’on tient compte du secteur de la transformation laitière (fromage, yogourt, etc.). Le secteur de la production et de la transformation laitière représente un peu plus de 1 % du produit intérieur brut canadien total, soit plus de 19 milliards de dollars annuellement. Les maladies qui affectent la santé globale et la production laitière des vaches de leurs troupeaux sont un combat continuel et font partie des nombreux défis auxquels font face les producteurs laitiers du Canada. En effet, plusieurs maladies peuvent affecter les vaches laitières. Notamment la mammite bovine ou la leucémie virale bovine entraînent d’importantes pertes économiques chez les producteurs laitiers. Une autre maladie qui affecte de plus en plus de producteurs est la paratuberculose ou maladie de Johne. Elle induit également des pertes économiques grandissantes chez les producteurs canadiens. La bactérie responsable de cette maladie est une mycobactérie nommée Mycobacterium avium de la sous-espèce paratuberculosis aussi appelée MAP. Cette maladie sera l’intérêt principal de ce mémoire de maîtrise.

17

1.2

Les mycobactéries et MAP

1.2.1 Le genre Mycobacterium

Parmi l’embranchement des Actinobacteria, la famille des Mycobacteriaceae forme un unique genre bactérien nommé Mycobacterium. Ce genre est formé d’environ 150 bactéries qui possèdent des caractéristiques morphologiques et de croissance semblable. Depuis des millénaires, ces bactéries ont causé de nombreuses maladies. En effet, des lésions pulmonaires causées par des mycobactéries ont été rapportées aussi loin que 1000 ans avant l’ère commune (Murray, J.F. 2004). De plus, deux bactéries de ce genre soient M. tuberculosis et M. leprea sont encore responsables de nos jours de maladies chez l’humain, soit respectivement la tuberculose et la lèpre. Les mycobactéries sont des bacilles acido-alcoolo-résistants mesurant entre 1 et 10 µm de longueur. Ces bactéries ont une membrane externe et une capsule. Elles ne produisent pas d’endospore. Elles possèdent toutes une membrane cellulaire caractéristique, soit cireuse, hydrophobe et plus épaisse que la majorité des autres bactéries. Cette membrane cellulaire est également caractérisée par une couche importante d’acide mycosique et de lipides. En effet, tandis qu’une bactérie classique possède une proportion de 2–3 % de lipide à l’intérieur de sa paroi cellulaire, on peut compter 30–40 % de composé lipidique, tels les acides mycosiques, dans les parois cellulaires de mycobactéries (Rowe and Grant, 2006;Niederweis et al., 2010). Cette importante couche cireuse leur confère une protection naturelle contre plusieurs antibiotiques qui normalement viennent perturber la synthèse de la paroi cellulaire telle la famille des antibiotiques bêta-lactames. Ces mycobactéries sont désignées comme acidoalcoolo-résistantes notamment à cause de leur paroi cellulaire distinctive qui résiste à une décoloration à l’alcool ou à l’aide d’un acide. Ainsi, les colorations classiques en microbiologie telles que les colorations gram ne fonctionnent pas sur ces bactéries. Des

18

colorations spécifiques aux mycobactéries telles que la coloration de Zheil-Neelson (Ellis and Zabrowarny, 1993;Tarhan et al., 2003) sont alors utilisées. Les premières descriptions de mycobactéries furent rapportées à la fin des années 1800 avec comme principal moteur les travaux minutieux de Robert Koch sur la tuberculose. Ces travaux vont paver la voie vers la découverte d’autres mycobactéries responsables de différentes maladies chez l’humain et les animaux. Les mycobactéries ont d’abord été classées selon leur vitesse de croissance (rapide et lente) et leur pigmentation (pigment photoactivé, pigment jaune-orange et non pigmenté). La démocratisation du séquençage a permis de mieux définir la classification des mycobactéries. Aujourd’hui, les mycobactéries sont toujours classifiées selon leur vitesse de croissance, mais également selon leur similitude génétique. On discerne une mycobactérie à croissance rapide par une présence de colonie visible à l’œil nu en moins de 7 jours tandis que les mycobactéries à croissance lente peuvent prendre plus de 6 semaines avant d’avoir des colonies visibles. Les mycobactéries à croissance rapide vont principalement causer des problèmes dermatologiques chez les humains suivant un stress important (Wallace et al., 1983). Ce groupe de mycobactérie contient notamment Mycobacterium smegmatis qui est l’une des souches les plus utilisées comme modèle d’étude sur les mycobactéries (Altaf et al., 2010). Deuxièmement, parmi les mycobactéries à croissance lente, on dénombre 2 principaux complexes soit le complexe Mycobacterium tuberculosis (MTBC) et le complexe Mycobacterium avium (MAC). Le MTBC contient l’ensemble des mycobactéries causant la tuberculose chez l’humain et les animaux. On y retrouve Mycobacterium tuberculosis et aussi M. bovis qui causent respectivement la tuberculose chez l’humain et la vache. L’autre catégorie d’agents pathogènes infectieux, soit le complexe MAC, ne cause pas d’infection pulmonaire. Cette catégorie regroupe notamment M. avium, et également M. avium de la sousespèce paratuberculosis soit l’agent responsable de la maladie de Johne. La Figure 1.1 permet d’apprécier les mycobactéries suivant leur similitude génétique. L’étude de Veyrier et al. publiée en 2009 démontre les similitudes génétiques présentes entre les différentes mycobactéries à l’aide d’une analyse de séquences multilocus de 20 gènes

19

constitutifs (de l’anglais housekeeping genes) des mycobactéries. On peut y voir à l’aide du diagramme phylogénétique le regroupement des bactéries à croissance rapide et lente. De plus, il est possible d’apprécier les différences génétiques entre les complexes MTBC et MAC regroupant respectivement M. tuberculosis et M. avium ssp. paratuberculosis.

Figure 1.1 : Position phylogénétique de MAP et de 15 autres mycobactéries de l’ensemble du genre Mycobacterium. La distance phylogénétique est basée sur l’analyse de séquences multi-locus de 20 gènes constitutifs des mycobactéries. La barre est proportionnelle au nombre d’acide aminé distinguant les différentes bactéries. Figure adapté de (Veyrier et al., 2009)

20

1.2.2 Le complexe Mycobacterium avium (MAC) et MAP

En étant une mycobactérie du complexe Mycobacterium avium, MAP se distingue des mycobactéries plus connues tel que M. tuberculosis. En effet, les mycobactéries du complexe MAC sont plutôt présentes chez les oiseaux, d’où la nomenclature avium, et les animaux d’élevage. Ces mycobactéries à croissance lente ont été décrites pour une première fois dans les travaux de Maffucci en 1892 où ils ont étudié la tuberculose aviaire et ont défini que l’agent pathogène n’était pas le même bacille que celui de la tuberculose humaine. Il sera par la suite nommé M. avium. Il sera également découvert que cette infection peut se transmettre entre animaux tels que les cochons, les vaches, les chèvres et les primates non humains (Thorel et al., 1997). C’est avec la venue du génotypage moléculaire que les sous-espèces de mycobactérie du complexe MAC ont été définies. La classification de MAP comme sousespèce de M. avium et non comme une mycobactérie distincte est arrivée seulement en 1990 avec les travaux de l’équipe de Marie Thorel qui, en regroupant des résultats d’analyses phénotypiques et génomiques, va proposer un changement dans la classification de MAP (Thorel et al., 1990). L’analyse de la séquence de la partie 3’ du gène hsp65 chez les différentes mycobactéries a été utilisée pour différencier les souches. En effet, en utilisant cette technique, il est possible de distinguer MAP des autres mycobactéries, mais également de différencier les souches de MAP qui affectent principalement les chèvres (type S ou I/III) ou les vaches (type C ou II). D’autres analyses génétiques permettent également de distinguer MAP des autres mycobactéries. En effet, l’analyse du nombre d’unités mycobactériennes répétées (Bull et al., 2003 b), des répétitions en tandem d’unités unitaires répétitives intercalées mycobactériennes et de polymorphisme de longueur de fragment de restriction (Thibault et al., 2008), ainsi que la combinaison de plusieurs autres méthodes permet de bien différencier l’ensemble de la diversité bactérienne présente dans le génome de MAP (Whittington et al., 2000 ; Mobius et al., 2008). Grâce à ces méthodes, il est même possible d’identifier la diversité génétique des souches de MAP selon leur provenance géographique (Ahlstrom et al., 2016).

21

Une autre différence importante de MAP par rapport aux autres mycobactéries est la composition lipidique et protéique de sa paroi cellulaire. En effet, MAP n’intègre pas de glycopeptidolipide (GPL) à sa paroi cellulaire ce qui est le cas chez les autres mycobactéries, dont celles du complexe MAC. La présence d’un autre composé lipidique spécifique à MAP est plutôt observée. En effet, un lipopentapeptide spécifique à MAP nommée L5P est produit au lieu des GPL. Ce composé de la paroi cellulaire de MAP est également important, car il serait ciblé par le système immunitaire des animaux infectés par MAP afin de monter une réponse immunitaire humorale importante (Eckstein et al., 2006 ; Biet et al., 2008).

1.2.3 Culture in vitro de MAP En faisant partie de la classification des mycobactéries à croissance lente, MAP est une bactérie fastidieuse à faire croître in vitro. En effet, dans les meilleures conditions de culture, on compte un temps de doublement de bactérie d’environ 1,4 jour comparativement à environ 2 heures pour une mycobactérie à croissance rapide tel que M. smegmatis (Stephan et al., 2005 ; Elguezabal et al., 2011). Ainsi, il faut compter environ quatre à six semaines de croissance avant d’avoir une culture liquide dense en bactérie à partir d’un ensemencement substantiel. En milieu solide, les différents milieux de croissance font varier le temps de culture, mais en moyenne les colonies de MAP sont visibles autour de six à huit semaines (Whittington et al., 2011). La bonne assimilation des différents composés nutritifs d’un milieu de culture est un facteur important pour une bonne croissance bactérienne in vitro. Un des composés importants dans la croissance et le métabolisme général des bactéries est le fer. Une des méthodes utilisées par les bactéries pour obtenir le fer nécessaire à leur croissance, à partir des nutriments présents dans leur environnement, est l’utilisation de molécules chélatrices appelées sidérophore. Une particularité de MAP par rapport aux autres mycobactéries est notamment sa dépendance à un sidérophore pour sa croissance in vitro, nommée mycobactine J. En effet, contrairement aux autres mycobactéries, qui en produisent, MAP ne produit pas le sidérophore essentiel pour chélater le fer dans le milieu de culture (Lambrecht and Collins, 1992; Merkal and Curran, 1974. Cette caractéristique de MAP permet également de distinguer MAP des autres mycobactéries lors de culture avec ou sans mycobactine J dans les milieux de

22

croissance. La mycobactine J provient en fait d’une souche de MAP qui a été adaptée pour la culture in vitro qui produit ce sidérophore (Merkal and McCullough, 1982). Ce composé est maintenant disponible commercialement. Il est ajouté dans l’ensemble des milieux de culture liquide ou solide pour la croissance de MAP.

1.2.4 Dissémination environnementale de MAP

En réponse à l’infection de MAP chez les animaux d’élevage tel que les vaches laitières ou le bovin de boucherie, il a été démontré, que MAP peut se retrouver dans le bœuf et le lait destiné à la consommation humaine. Cette étude a montré qu’entre 4 et 20 % des carcasses de bœuf de boucherie étaient positives lors d’une analyse de PCR du gène F57 qui est spécifique à MAP. Cependant, la quantité de bactéries serait négligeable et ne serait pas la principale cause de transmission potentielle de MAP vers les humains (Meadus et al., 2008). De plus, la majorité des études qui détectent la présence de MAP dans les échantillons de lait commercial pasteurisé le retrouve dans une proportion de 1 à 3 % des échantillons (Klijn et al., 2001 ; Lund et al., 2002). En utilisant des techniques plus précises, mais toujours en développement, tel que des méthodes utilisant des bactériophages pour la détection de MAP couplée à une détection des bactéries vivantes ou non, ces chiffres pourraient possiblement augmenter (Swift et al., 2016). Outre les échantillons biologiques associés aux animaux d’élevage MAP peut se retrouver dans l’environnement tel que les champs et différents types de sols ainsi que dans l’eau de surface (Whiley et al., 2012 ; Salgado et al., 2013). Étant un pathogène obligatoire, MAP ne peut se reproduire à l’extérieur d’un hôte. Cependant, le cycle de vie de MAP entraîne son excrétion dans les fèces des animaux atteints et MAP se retrouve donc de façon latente dans l’environnement. On le retrouve plus particulièrement dans les pâturages d’animaux d’élevage et évidemment dans les établissements d’élevage tel les étables (Whittington et al., 2004). La survie de MAP dans l’environnement est cependant très longue. En effet, il a été déterminé qu’il est possible de cultiver MAP après avoir laissé des échantillons de fèces 55 semaines

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dans un endroit sec et à l’abri de la lumière (Whittington et al., 2004). De plus, une étude dans l’est de l’Australie démontre que MAP peut être cultivé après une exposition à des conditions environnementales naturelles pendant 1 à 16 semaines selon les conditions d’ensoleillement (Eppleston et al., 2014). À l’intérieur d’échantillons d’eau de barrage hydrique, MAP était toujours cultivable après 36 ou 48 semaines selon l’exposition à la lumière (Whittington et al., 2005). Il a été suggéré que cette longue survie en milieu aqueux pourrait être due à des interactions avec les autres microorganismes présents dans l’eau. En effet, des insectes, protozoaires ou nématodes pourraient permettre à un pathogène intracellulaire, comme MAP, de survivre plus longtemps (Whan et al., 2006). De plus, des amibes infectées par MAP pourraient servir de cheval de Troie comme source d’infection des animaux en pâturage (Salgado et al., 2013). D’autres mécanismes de survie tels que la dormance ou la formation d’un biofilm permettraient à MAP de résister à des environnements plus ou moins hostiles (Rowe and Grant, 2006 ; Beumer et al., 2010 ; Whiley et al., 2012 ; Chern et al., 2015). Cette dissémination dans l’environnement et sa survie accrue sont inquiétantes, car à la suite de grandes pluies MAP peut se retrouver dans les cours d’eau et même se retrouver jusqu’aux usines de traitement d’eau potable. En effet, des bactéries viables ont été dénombrées à l’embouchure d’une usine de traitement des eaux en Irlande du Nord et dans des réservoirs naturels d’eau potable en Grande-Bretagne (Whan et al., 2005;Aboagye and Rowe, 2011).

1.2.5 Potentiel zoonotique de MAP

Le potentiel zoonotique de MAP est associé au développement de la maladie de Crohn chez les humains, une maladie qui a d’ailleurs des symptômes similaires à ceux de la paratuberculose (Singh et al., 2008 ; Pierce, 2009 ; Sechi and Dow, 2015 ; Timms et al., 2016). En fait, une étude de M. Crohn en 1952 proposait déjà l’idée que cette maladie soit causée par une forme atypique de tuberculose. C’est en 1980 que la présence de MAP chez des patients humains atteints de la maladie de Crohn a été constatée. Cependant, certaines études ont également détecté du MAP dans des patients qui n’étaient pas atteints de la maladie de Crohn (Bull et al., 2003 a). Il a alors été proposé que, comme dans le cas de la paratuberculose, une

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susceptibilité génétique à la maladie soit un des facteurs importants dans le développement futur de la maladie en plus de l’infection primaire par MAP (Tuci et al., 2011). L’association directe entre la maladie de Crohn et MAP est toutefois toujours un sujet controversé dans la littérature. La présence de MAP dans des échantillons de viande et de produits laitiers est également inquiétante quant au potentiel infectieux de MAP dans les produits pour la consommation humaine. Les études qui se sont concentrées sur l’efficacité de la pasteurisation du lait destiné à la consommation humaine ne permettent pas d’établir un consensus quant à l’efficacité de cette méthode (Klijn et al., 2001 ; Lund et al., 2002). En effet, malgré des tentatives d’optimisation, les méthodes classiques de pasteurisation ne sont toujours pas efficaces pour inactiver totalement le MAP dans le lait (Hammer et al., 2014). De plus, MAP serait également capable de survivre dans les produits fermentés tels que le yogourt ou le kéfir malgré l’acidification qui est requise dans le processus de transformation (Klanicova et al., 2012). Il a également été démontré que les mycobactéries jouent un rôle dans l’arthrite rhumatoïde considérant que M. tuberculosis a été détecté dans le liquide synovial des patients atteint de cette maladie (Kempsell et al., 2001). De plus, la présence d’un anticorps contre une lipoprotéine de surface de M. tuberculosis était plus fréquemment détectée dans le sang de certains patients atteints d’arthrite rhumatoïde (Erre et al., 2014). Également, l’association entre des anticorps dirigés contre les protéines de choc thermique (HSP) de mycobactérie (Sechi and Dow, 2015) et des troubles auto-immunitaires de cirrhose biliaire (Vilagut et al., 1997) suggère que les mycobactéries jouent potentiellement un rôle dans différentes maladies auto-immunes chez l’humain.

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1.3

La paratuberculose

1.3.1 Historique

La paratuberculose ou maladie de Johne (JD) est une entérite chronique et débilitante qui affecte les ruminants. Cette maladie est causée par un pathogène intracellulaire obligatoire, Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) (Chiodini et al., 1984 ; Tiwari et al., 2006). MAP est une mycobactérie a croissance lente qui affecte les ruminants, mais également d’autres animaux domestiques et sauvages à travers le monde (Clarke, 1997 ; Beard et al., 2001 ; Kennedy and Benedictus, 2001). Les premières descriptions d’une maladie qui entraîne une consommation excessive et non digérée de nourriture remontent en 1822 par Edward Skelett (Skellett, 1822). C’est au tournant des années 1830 que l’on décrit ces animaux ayant un épaississement de la muqueuse intestinale associé à des diarrhées chroniques qui se rapproche de la description actuelle de la paratuberculose (Cartwright, 1829). En 1895, deux chercheurs nommés Heinrich Albert Johne et Langdon Frothingham ont associé ces symptômes aux mycobactéries (Johne and Frothingham, 1895). En effet, ils ont découvert que des coupes histologiques de paroi intestinale provenant de vaches ayant ces symptômes présentaient des bactéries acido-résistantes qui étaient morphologiquement ressemblantes au bacille de M. tuberculosis. Cependant, cette bactérie ne causait pas le même symptôme chez des cochons d’Inde infectés. Ils ont alors conclu que c’était probablement le même bacille non tuberculeux qui affecte les oiseaux (M. avium). C’est en 1906 que le nom paratuberculose va être proposé par Bernhard Bang sous la forme pseudo-tuberculose (Bang, 1906). Ses études ont permis de confirmer que la mycobactérie associée aux symptômes de paratuberculoses chez les vaches n’était pas associée à la tuberculose humaine, mais plutôt à M. avium. En 1912, la culture in vitro de MAP devient possible grâce à l’ajout d’une culture inactivée de M. phlei qui apporte des composants nutritifs nécessaires à la culture de MAP (Twort and Ingram, 1912). C’est en 1923 que MAP

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sera officiellement décrit comme l’agent causal de la maladie de Johne et obtiendra sa nomenclature presque finale soit Mycobacterium paratuberculosis (Bergey et al., 1923). Tel que mentionné plus haut dans le texte, c’est en 1990 que MAP sera plutôt associé à une sousespèce de M. avium grâce aux avancés dans la classification des espèces bactériennes et mycobactéries (Thorel et al., 1990). Avec la révolution verte et la mondialisation de l’agriculture au début du siècle dernier, la paratuberculose se retrouve maintenant sur l’ensemble de la planète et résulte en de grands impacts économiques chez les producteurs laitiers notamment. En fait, c’est en 1913 que la première de nombreuses études sur les impacts économiques de cette maladie sera effectuée (Meyer, 1913).

1.3.2 Mécanisme d’infection

Un animal s’infecte généralement par l’ingestion de matière environnementale contaminée ou par des aliments souillés par le MAP. Tel que schématisé dans la Figure 1.2, à la suite de l’ingestion, les mycobactéries passent à travers la barrière intestinale en utilisant les cellules spécialisées des plaques de Peyer nommé les cellules M (microfold cells) de la muqueuse intestinale (Momotani et al., 1988 ; Sigurdardottir et al., 2005). C’est de l’intérieur de ces cellules, que MAP entraînera la sécrétion, sous la muqueuse intestinale, de différentes molécules chimioattractantes afin que les macrophages et les cellules dendritiques s’infiltrent près des cellules M (Khare et al., 2009). Il est également proposé, que les cellules M soient la cible préférentielle de MAP lors d’une infection, car ces cellules ne présentent pas de lysosome n’y d’enzymes hydrolytiques ce qui permet un passage sans affecter ces capacités infectieuses (Miller et al., 2007). De plus, une densité importante d’intégrines 1 à la surface de ces cellules pourrait également expliquer l’attachement prioritaire de MAP sur ces cellules plus que d’autres. Cependant, comme l’on peut voir sur la Figure 1.2, MAP peut également infecter les autres cellules épithéliales et également induire la sécrétion d’autres molécules telles que des interleukines afin d’attirer les macrophages et cellules dendritiques (Secott et

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al., 2002). Par la suite, MAP s’infiltre dans le dôme sous-épithélial et pourra alors entrer en contact avec sa cellule hôte principale : les macrophages et les cellules dendritiques (Jozefowski et al., 2008).

Figure 1.2 : Schématisation des événements initiaux au niveau de la muqueuse intestinale lors de l’infection par MAP. Figure adaptée de (Bannantine and Bermudez, 2013) Il est connu, que MAP peut interagir avec les récepteurs de ces cellules, comme DC-SIGN chez les cellules dendritiques ou les récepteurs de type Toll (TLR) et les récepteurs au mannose des macrophages (Astarie-Dequeker et al., 1999 ; Ferwerda et al., 2007 ; Jozefowski et al., 2008). La mycobactérie est alors phagocytée. De nombreuses études ont examiné l’impact des récepteurs des macrophages impliqués dans l’infection par MA. Ces études ont trouvé une susceptibilité génétique à la paratuberculose associée au gène NOD2 qui code pour le détecteur bactéries intracellulaires (Pinedo et al., 2009 a ; Kupper et al., 2014). Également, les récepteurs de mannose peuvent induire la phagocytose de MAP sans être corrélés avec une

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activation du système immunitaire inné (Astarie-Dequeker et al., 1999). Après l’invasion des cellules immunitaires, MAP va prendre le contrôle de ces cellules afin de favoriser sa survie et sa réplication à court et à long terme par des mécanismes encore mal connus. La maturation et l’acidification du phagosome sont les mécanismes de survie exploités par MAP la plus connue (Rowe and Grant, 2006 ; Woo et al., 2007 ; Keown et al., 2012). Ce phénomène est bien décrit pour la mycobactérie M. tuberculosis qui va bloquer la maturation du phagosome et la fusion du phagolysosome et ainsi être capable de survivre dans un environnement moins acide (Ehrt and Schnappinger, 2009)

1.3.3 Transmission et évolution de la maladie

La transmission de la paratuberculose est principalement due à la voie oro-fécale préférablement utilisée par MAP. En effet, le MAP va être excrété dans les fèces d’animaux infectieux. Ces animaux vont par la suite participer au cycle de vie de MAP en contaminant l’environnement. La majorité des infections par MAP qui résulte par le développement de la paratuberculose se fait chez les veaux d’un à deux ans puisque leur système immunitaire n’est pas aussi développé (Larsen et al., 1975 ; Fecteau et al., 2010). Une infection par MAP chez les vaches adultes est toujours possible, mais la capacité d’induire la maladie diminue beaucoup avec l’âge (Larsen et al., 1975). Les vaches qui sont atteintes de paratuberculose à des stades avancés peuvent également contaminer leur veau in utero (Whittington and Windsor, 2009;Adaska and Whitlock, 2012), mais aussi à la suite de leur naissance par l’ingestion du colostrum ou du lait contaminé (Sweeney, 1996 ; McAloon et al., 2016). Chez les vaches, la paratuberculose est une maladie qui progresse très lentement. On divise son évolution en trois ou quatre grandes étapes : l’infection silencieuse, l’état sous-clinique, clinique, et finalement un état clinique avancé (Whitlock and Buergelt, 1996). Il est toutefois rare d’atteindre l’état clinique avancé, soit la cachexie, car souvent les producteurs vont réformer l’animal présentant des signes cliniques tel qu’une baisse du rendement de production de lait ou d’autres problèmes de santé.

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L’étape de l’infection silencieuse peut être asymptomatique pour une période moyenne d’environ 5 ans suivant la première infection (Jubb et al., 2004). Suivant cette période de latence, l’étape sous-clinique demeure l’étape la plus insidieuse, car les vaches peuvent être asymptomatiques, mais commencer à excréter le pathogène dans l’environnement à travers leurs fèces. À ce stade, l’excrétion dans les fèces est également intermittente ce qui rend la détection encore plus complexe. Finalement, les animaux vont converger vers l’état le plus avancé de la maladie, l’état clinique de la paratuberculose. À ce niveau, MAP s’est multiplié de façon importante dans les cellules immunitaires et ainsi ce niveau est défini par l’arrivé d’une multitude de symptômes tels qu’une diarrhée chronique, une perte de poids importante malgré une alimentation normale, une réduction de la production laitière, des problèmes de fertilité et une perte de santé globale de l’animal. Avec la progression de la maladie dans un état clinique avancé, les animaux vont éventuellement mourir naturellement ou être réformés par les producteurs.

1.3.4 Susceptibilité génétique de l’hôte Comme pour plusieurs autres maladies résultant d’une infection bactérienne, il a été démontré que la susceptibilité génétique à l’infection par le MAP est un des éléments importants dans le développement de la maladie. Le tableau 1.1 présente un résumé des différents gènes dont les variations génétiques furent associées à une susceptibilité accrue au développement de la paratuberculose. Il est à noter que plusieurs de ces gènes sont reliés à l’immunité et la détection de pathogénies. En effet, les gènes NOD2 et des récepteurs de type Toll (TLR1-2-4) codent pour des protéines permettant la détection des bactéries par les cellules du système immunitaire. Comme indiqué sur la Figure 1.3, la mutation présente sur le gène codant pour la protéine NOD2 rend les vaches 3,35 fois plus susceptibles de développer la paratuberculose (Pinedo et al., 2009a). Cette protéine joue un rôle important dans la détection intracellulaire des bactéries ainsi que dans la maturation du phagosome (Herskovits et al., 2007). Alors, il est

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clair qu’une mutation dans le gène de cette protéine est un avantage pour la survie de MAP lors d’une infection. Tableau 1.1 : Gènes affectés par des variations génétiques associées à une plus grande susceptibilité à la paratuberculose dans la littérature Gènes associés Références NOD2 (CARD15) TLR1 TLR2 TLR4 SLC11A1 (NRAMP)

(Pinedo et al., 2009a) (Ruiz-Larranaga et al., 2010a) (Mucha et al., 2009) (Mucha et al., 2009 ; Koets et al., 2010) (Mucha et al., 2009) (Reddacliff et al., 2005;Pinedo et al., 2009b;Ruiz-Larranaga et al., 2010c)

SP110

(Ruiz-Larranaga et al., 2010b)

IL10RA

(Reddacliff et al., 2005;Pinedo et al., 2009b;Ruiz-Larranaga et al., 2010c)

Les mutations dans le gène SLC11A1 sont également importantes, car sa protéine est associée avec une résistance naturelle contre les pathogènes intracellulaire (Pinedo et al., 2009b). Comme indiqué dans la Figure 1.3, une mutation dans ce gène induit une susceptibilité de développement la paratuberculose accrue de 1,75 fois plus élevée. De plus, des mutations dans ce gène ont également été découvertes chez des patients humains atteints d’arthrite rhumatoïde (Ates et al., 2009). Ainsi, il est clair que les nombreuses mutations décrites dans des gènes clairement reliés au système immunitaire et au cycle d’infection de MAP sont importantes et induisent une susceptibilité accrue au développement de la maladie. Cependant, une susceptibilité accrue ne veut pas nécessairement dire un développement de la maladie automatique. D’autres facteurs tels que la dose d’infection de départ, la souche de MAP, l’état immunitaire des vaches au

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moment de l’infection, les co-infections et d’autres facteurs peuvent également jouer dans l’établissement de la maladie ou non.

Figure 1.3 : Représentation de l’effet des variants dans les gènes SLC11A1 et NOD2 responsable d’une susceptibilité génétique accrue à la paratuberculose. L’effet de ces varitions est représenté dans le cycle infection de MAP dans les macrophages. FCP= phagosome hâtif, EE=Compartiment endocytotique hâtif, LE= Compartiment endocytotique tardif, Lys= Lysosyme. Figure adaptée de (Chong and Celli, 2010)

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1.3.5 Diagnostic et traitement

Le diagnostic de la paratuberculose est principalement fait par la détection des bactéries vivantes, de leur ADN ou d’anticorps associé à MAP dans les fèces, le sang ou le lait des animaux. Les méthodes les plus utilisées sont la culture bactérienne de MAP provenant des fèces dans des systèmes de culture automatisés, la détection d’anticorps dirigés contre MAP par ÉLISA à partir d’échantillon sanguin et finalement la détection d’ADN de MAP dans les fèces par qPCR. Ces différentes méthodes comportent chacune leurs avantages et inconvénients. En effet, la culture bactérienne permet de distinguer les bactéries vivantes et mortes, mais prend plus de 56 jours avant d’obtenir un diagnostic. La détection d’anticorps contre MAP dans le sang est rapide, mais n’est pas efficace pour les stades hâtifs de la maladie. Des progrès ont été faits pour augmenter la détection d’animal en phase sousclinique et réduire la complexité des méthodes de détections en améliorant les protocoles d’extraction de l’ADN génomique de MAP ainsi qu’en optimisant les techniques de détection en qPCR (Fock-Chow-Tho et al., 2017). Malgré tout, le diagnostic des animaux infectés par MAP dans les stades hâtifs de la maladie reste un défi. De plus, comme l’excrétion du pathogène dans les fèces est non constante dans les stades hâtifs de la maladie, cela rend la détection d’autant plus complexe à ces stades. En effet, des prélèvements de fèces pris à quelques mois de différence peuvent produire des résultats diagnostiques complètement différents. Il est également important de mentionner que très peu de traitements ou vaccins sont facilement disponibles pour les producteurs de vaches atteintes. Des antibiotiques tels que l’isoniazide, la rifampicine, et la clofazimine peuvent être utilisés comme traitement contre la paratuberculose, mais ils ne permettent pas une guérison complète des vaches atteintes (Fecteau and Whitlock, 2011). Récemment, beaucoup d’effort est orienté vers le développement de vaccins efficaces pour prévenir la paratuberculose. Cependant, la majorité des vaccins testée jusqu’à présent tendent à diminuer les symptômes, mais n’offrent pas une solution à long terme ou finale pour éradiquer cette maladie (Bannantine et al., 2014 ; Settles et al., 2014 ; Carlos et al., 2015). Cependant, certains vaccins contre la paratuberculose peuvent entraîner des réactions croisées avec les tests de dépistages d’anticorps contre une

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autre mycobactérie soit Mycobacterium bovis (Perez de Val et al., 2012) ce qui pourrait entraîner des coûts supplémentaires pour le contrôle de la tuberculose bovine. 1.3.6 Prévalence et effets économiques En fait, la maladie de Johne est responsable de pertes économiques importantes à travers le monde, et ce principalement dans l’industrie laitière. Malgré le fait que cette maladie n’est pas aussi prévalente que d’autre maladie telle que la mammite bovine, le nombre de troupeaux affecté est en expansion. En 1997 le nombre de troupeaux infectés par MAP aux États-Unis était estimé à environ 30-50 % par le U.S. National Animal Health Monitoring System ou NAHMS (NAHMS, 1997) tandis que ce nombre était évalué à 70 % en 2006. Une nouvelle étude publiée en 2013 montre à l’aide d’un modèle statistique qu’une prévalence réelle de l’infection à MAP serait plutôt autour de 90 % (Lombard et al., 2013) ce qui est supérieur à l’évaluation du NAHMS américain en 2006. Cette étude visait justement à compenser la difficulté d’identifier les vaches infectées, mais encore au stade d’infection silencieuse ou sous-clinique. Il est également estimé que la perte monétaire associée uniquement à la maladie de Johne serait entre 200 millions et 1,5 milliard de dollars américains et cela uniquement aux États-Unis (Stabel, 1998). Au Canada, il est estimé que les pertes économiques représentent plus 15 millions de dollars canadiens chaque année (McKenna et al., 2006). Ces impacts économiques sont probablement encore sous-évalués dus à la difficulté de diagnostiquer efficacement les vaches dans les stades hâtifs de la paratuberculose.

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1.4

Le système immunitaire

1.4.1 Rôles et constitution du système immunitaire

La joute de pouvoir qui s’exerce entre le pathogène et son hôte fait appel au système immunitaire. Le pathogène MAP utilisera différents mécanismes pour faire face à l’infection microbienne. Ce chapitre permettra de définir les principales étapes d’une réponse immunitaire et le rôle des différents acteurs de ce système. Ces connaissances vont permettre de mettre en contexte les résultats d’une infection par MAP chez les macrophages et l’effet chez le macrophage d’une infection de l’animal à long terme. Le système immunitaire est un ensemble de défense que l’organisme développe au cours de sa croissance pour se défendre contre une panoplie d’agents pathogènes tels que des bactéries, des virus ou encore des parasites. Les deux principales composantes du système immunitaire sont l’immunité innée et l’immunité adaptative. Ces deux systèmes agissent de façons très différentes pour limiter la croissance d’un pathogène ou pour l’éliminer. Malgré tout, ces deux composantes du système immunitaire s’intègrent une à l’autre pour établir une défense complète face à un envahisseur. Les types cellulaires qui participent à la réponse immunitaire et leur rôle respectif sont résumés dans la Figure 1.4, et ce pour les deux types d’immunité.

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Figure 1.4 : Résumé des fonctions du système immunitaire inné et adaptatif lors d’une infection. Figure adaptée de (Gregersen and Behrens, 2006)

1.4.2 Le système immunitaire inné

Ce système est la première ligne de défense de l’organisme. Cette défense commence dès le contact du pathogène avec l’organisme. En effet, la défense initiale est effectuée par les barrières physiques, chimiques et biologiques du corps. Ainsi, la peau, les différentes muqueuses, l’acidité de l’estomac ainsi que leur flore bactérienne commensale permettent un contrôle en amont afin d’éviter des infections. Un dérèglement dans cette défense peut entraîner de graves infections et maladies. La réponse du système immunitaire inné se caractérise également par une réponse rapide pour contrôler les pathogènes à l’aide de cellules spécialisées. On compte plusieurs types cellulaires

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qui vont venir interagir de façon non spécifique avec les pathogènes. Il y a les monocytes qui se différentient en macrophages, les cellules dendritiques et les mastocytes à la suite d’une étape de différentiation. Ces trois derniers types cellulaires vont permettre de contrôler l’infection, mais également de faire progresser la réponse immunitaire innée vers une réponse dite adaptative pour assurer une défense à long terme. Il y a également les neutrophiles, basophiles et éosinophiles qui viennent phagocyter, de façon non spécifique, les microorganismes pour ensuite effectuer leur destruction. Les premières cellules à affronter les pathogènes sont les cellules phagocytaires, notamment les macrophages. Ces dernières qui résident dans les tissus infectés et dans la circulation sanguine vont phagocyter les microorganismes et sécréter des protéines solubles que l’on appelle cytokines. Ces protéines vont permettre le recrutement d’autres cellules immunitaires, tel que les neutrophiles, au site d’infection. La reconnaissance non spécifique des microorganismes par les différentes cellules du système inné s’effectue grâce aux différents motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) par les récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) des cellules. Les PAMPs sont des molécules présentes à la surface de plusieurs microorganismes que les PRR reconnaissent afin d’identifier les envahisseurs de façon non spécifique. Tel que l’on peut le remarquer dans la Figure 1.4, grâce à leur lysosome, les macrophages ont un rôle polyvalent et peuvent également éliminer les microorganismes. L’action conjointe de macrophages qui excrètent des cytokines et d’autres cellules du système inné va produire une inflammation locale au niveau de l’infection. Cette inflammation cause une rétroaction positive qui augmente le recrutement des cellules immunitaires au niveau de l’infection.

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1.4.3 Le système immunitaire adaptatif

À la suite d’une réponse rapide du système immunitaire inné, le système immunitaire adaptatif répond au besoin d’une protection à long terme de l’organisme face aux différents pathogènes. La caractéristique principale de ce mécanisme de défense est qu’il cible spécifiquement le pathogène qui a été mis en contact avec le système immunitaire inné. Cette réponse immunitaire va débuter avec la digestion des microorganismes par les cellules présentatrices d’antigènes et leur présentation par le biais des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) à leur surface. Par la suite, les différentes cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages, vont migrer vers les ganglions lymphatiques pour permettre la présentation des antigènes aux lymphocytes. Les lymphocytes de type T sont les cellules spécialisées dans la reconnaissance des complexes CMH-antigène. Ils vont reconnaître ces complexes à l’aide de leur récepteur de cellules T (TCR). Un lymphocyte T ayant un corécepteur CD8 reconnaîtra les antigènes présentés par les CMH-I et va entraîner une réponse de type cytotoxique. Les lymphocytes ayant le corécepteur CD4 vont reconnaître les CMH-II est vont entraîner une réponse plus complète incluant une sécrétion de cytokine pour favoriser la communication entre les cellules immunitaires. Les lymphocytes de type B sont les cellules qui sont responsables du déclenchement de la production des anticorps. À la suite de la fixation de l’antigène sur les récepteurs de cellules contenant les anticorps de surface, il y a une prolifération des cellules B et leur différentiation en plasmocyte producteur d’anticorps. Selon le type d’antigène se retrouvant lié au BCR, les cellules B naïves peuvent aussi avoir besoin d’un signal supplémentaire, provenant des cellules T effectrices, afin de s’activer et produire des anticorps. Une partie des lymphocytes B vont également devenir des lymphocytes B mémoire et ainsi permettre une réponse immunitaire humorale beaucoup plus rapide lors d’une deuxième infection.

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1.4.4 La mémoire du système immunitaire inné

Un nouveau concept au niveau des mécanismes de défense de l’organisme est celui de mémoire du système immunitaire inné. La croyance classique suggère que le système inné ne conserve pas de mémoire d’un pathogène ou d’une infection précédente comme le système adaptatif peut le faire grâce à la production d’anticorps et la puissance des lymphocytes T mémoires. Cependant, de nouvelles études ont démontré que certains microorganismes ou composés tels que le LPS ou le β -glucan peuvent affecter la réponse immunitaire innée lors d’une deuxième infection ou contact. Ce phénomène peut affecter la majorité des cellules de l’immunité innée soit les monocytes, les macrophages et les neutrophiles (Gardiner and Mills, 2016). L’homéostasie des composants métaboliques et lipidiques des cellules à la suite d’un premier contact avec un pathogène joue également un grand rôle dans ce phénomène (Procaccini et al., 2012 ; Quintin et al., 2012 ; Cheng et al., 2014). La mémoire du système immunitaire est divisée en deux types principales de réponses, l’immunité innée éduquée et tolérante (Ifrim et al., 2014 ; Topfer et al., 2015 ; Crisan et al., 2016). Un aperçu de la réponse des macrophages dans ces deux situations est démontré dans la Figure 1.5. On peut y voir l’effet de ces deux situations au niveau biologique (Figure 1.5A) et épigénétique (Figure 1.5B). Le premier type s’appelle l’immunité innée éduquée (de l’anglais trained immunity). Cette réponse est caractérisée par l’établissement d’un état pro-inflammatoire des cellules immunitaires suite à une première infection, qui permet une meilleure amplitude du signal en réponse à une deuxième infection. Cet état pro-inflammatoire est plus prompt à répondre, même envers des pathogènes autres que celui du premier contact. Comme on peut le voir dans la Figure 1.5A, les macrophages produisent une réponse pro-inflammatoire plus prononcée après un deuxième stimulus. Les modifications épigénétiques, telles que présentées dans la Figure 1.5B, expliqueraient le phénomène d’immunité innée éduquée (Kleinnijenhuis et al., 2012 ; Quintin et al., 2012 ; Saeed et al., 2014 ; Logie and Stunnenberg, 2016). En effet, les macrophages en condition d’immunité éduquée vont conserver les marques épigénétiques

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nécessaires à une activation accrue de l’expression des gènes lors du deuxième stimulus (Alvarez-Errico et al., 2015). Le cas de mémoire de l’immunité innée éduquée le plus décrit

Figure 1.5 : Résumé de l’activité biologique (A) et du remodelage épigénétique (B) dans le cadre de la mémoire de l’immunité innée. Figure adaptée de (Alvarez-Errico et al., 2015) dans la littérature est celui du vaccin Bacille Calmette-Gerin (BCG) qui protège les humains contre les infections par M. tuberculosis qui causent la tuberculose (Kleinnijenhuis et al., 2012). Ce vaccin atténué est connu pour induire un changement dans la réponse des cellules immunitaire innée qui correspond à une réponse immunitaire accrue de façon non spécifique à

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M. tuberculosis jusqu’à six mois suivant la première infection (Kleinnijenhuis et al., 2012). Cette immunité innée éduquée peut être conservée à long terme grâce à des changements épigénétiques dans le récepteur intracellulaire NOD2 responsable de la détection des mycobactéries (Kleinnijenhuis et al., 2012). Un autre cas bien connu d’immunité innée éduquée est le cas du β-glucan tel que démontré dans la Figure 1.5A (Cheng et al., 2014). Le deuxième type de mémoire est l’immunité innée dite de tolérance (de l’anglais tolerance). Ce type de mémoire induit un état réfractaire ou tolérant dans les cellules immunitaires face à un deuxième stimulus. En effet tel que montré dans la Figure 1.5A, un deuxième stimulus n’induit pas de réponse pro-inflammatoire supplémentaire au niveau basal et peut même être diminué par rapport au niveau basal. Cette réaction serait principalement due à un remodelage épigénétique comme démontré dans la Figure 1.5B. Les marques épigénétiques permettant une expression accrue des gènes pro-inflammatoires ou antimicrobienne par exemple sont perdues à la suite du premier stimulus et ainsi l’expression reste faible ou réfractaire face à un deuxième stimulus. Ce phénomène est aussi observé avec des molécules comme le LPS comme montré dans la Figure 1.5. On parle alors de tolérance d’endotoxine (Morris et al., 2014). La tolérance est connue pour être favorisée par les pathogènes ou molécules qui sont reconnues principalement par les TLR. Il est également connu, qu’une dose plus élevée lors du premier contact pouvait induire cette tolérance dans des monocytes humains (Ifrim et al., 2014). Cet état de tolérance peut également être inversé soit en changeant les molécules utilisées lors du deuxième contact ou en changeant la dose utilisée (Ifrim et al., 2014).

1.4.5 MAP et l’évasion du système immunitaire

L’évolution de l’infection des ruminants vers l’établissement de la paratuberculose est issue d’une interaction complexe entre les bactéries intracellulaires MAP et l’hôte, en l’occurrence le macrophage, où le pathogène niche pour se reproduire. Il est encore inconnu comment certaines vaches sont capables de contrôler l’infection de MAP alors que d’autres développeront la paratuberculose à long terme (Koets et al., 2000 ; Vir Singh et al., 2013). Le

41

premier modèle proposé était que les individus infectés développaient une réponse immunitaire dite de type Th1 soit une médiation cellulaire afin de produire une réponse proinflammatoire dans le but d’éliminer des pathogènes intracellulaires par l’action des macrophages. Cela progressait vers une réponse dite de type Th2, qui induit une réponse humorale afin de produire des anticorps pour favoriser une protection à long terme (Stabel, 2000;Coussens, 2004). Depuis, ce modèle a été contredit par plusieurs études puisque le transfert vers une réponse immunitaire Th2 humorale n’était pas la description la plus précise des évènements caractéristiques de la progression de la paratuberculose (Begg et al., 2011 ; Dudemaine et al., 2014 ; Magombedze et al., 2015). Afin de comprendre ces différences dans la réponse immunitaire des vaches contre MAP et dans la progression de la maladie, il est essentiel d’observer le comportement des macrophages et leur réponse à l’infection chez les sujets sains et les vaches naturellement infectées par l’agent causal de la paratuberculose bovine. Cette habileté à prévenir la fusion du phagosome et du lysosome et ainsi prévenir le potentiel de destruction des bactéries des cellules est un processus actif des cellules, car cette fusion s’opère normalement lors d’une infection avec des bactéries MAP inactivées ou en présence de mycobactéries non pathogéniques (Kuehnel et al., 2001 ; Woo et al., 2007). Comme seuls certains animaux infectés développent une réponse immunitaire humorale (Nielsen and Toft, 2006), cette dysfonction du phagolysosome pourrait expliquer la présentation antigénique inefficace aux cellules T par complexe majeur d’histocompatibilité. En effet, la destruction des bactéries est faible, due à la maturation du phagosome qui est bloqué par MAP (Yates and Russell, 2005). L’interférence avec la voie normale d’activation des macrophages pourrait également être une façon dont MAP peut prendre contrôle des macrophages et favoriser sa survie et sa réplication. Il est connu que les macrophages, qui ont été activés par l’interféron-y (INF-γ) ou le facteur de nécrose tumorale α (TNFα) avant une infection par mycobactéries pathogènes, sont capables de monter une fusion phagosome-lysosome efficace menant à la destruction des bactéries (Flynn et al., 1993 ; Bonecini-Almeida et al., 1998 ; Florido et al., 1999). Ce phénomène n’a pas été répété lors d’un traitement après l’infection (Robertson and

42

Andrew, 1991). MAP pourrait modifier le patron des cytokines circulantes et affecter la réponse globale des macrophages à une infection de mycobactéries pathogènes. Cette hypothèse fait écho aux résultats du patron de cytokines et de molécules circulantes affecté par l’infection par MAP à long terme chez les sujets atteints de paratuberculose (De Buck et al., 2014 ; Dudemaine et al., 2014)

1.5

Hypothèse et objectifs

Le but de ce projet est de comprendre l‘impact à long terme d’une infection à MAP chez le macrophage. Ainsi l’hypothèse de départ de ce projet est que l’étude de macrophages dérivés de monocytes (MDM) provenant de sujets sains et naturellement atteints de paratuberculose bovine permet d’étudier et de comprendre, de façon optimale, leur réponse à l’infection in vitro par l’agent causal, soit MAP. Le premier objectif de mon projet consiste à définir le niveau d’expression de l’ensemble des gènes dans les différentes conditions d’infection in vitro à MAP et selon le statut de paratuberculose sur un petit groupe de vache. Le deuxième objectif vise l’identification des voies biologiques affectées par ces différences d’expression géniques afin de mieux définir les mécanismes d’action de MAP dans la paratuberculose. L’utilisation des macrophages dans cette étude va permettre d’avoir un aperçu précis de l’effet de MAP sur le système immunitaire puisque ces cellules sont l’hôte principal de MAP. De plus, ces cellules possèdent un rôle crucial dans la réponse immunitaire et la survie de MAP. Bien que plusieurs études traitant de la paratuberculose se concentrent sur des vaches infectées par MAP de façon expérimentale (Sommer et al., 2009 ; Kabara and Coussens, 2012 ; Casey et al., 2015), l’utilisation de vaches naturellement infectées va améliorer la compréhension d’un effet à long terme de la maladie sur les cellules immunitaires afin de mieux comprendre leur rôle dans l’évolution de la maladie. Afin de bien comprendre l’impact global sur l’expression génique de l’infection à MAP chez les macrophages et du statut de paratuberculose des vaches à long terme, une expérience de 43

séquençage haut débit de l’ARN (RNA-seq) a été réalisée. Cette expérience a permis de dresser un portrait global de tous les changements d’expression géniques suite à une infection par MAP à court terme (jusqu’à 24 h post-infection), mais aussi à long terme en regardant la différence entre les vaches naturellement infectées et les vaches naïves. Comme le RNA-seq est une méthode coûteuse, qui nécessite de longues étapes d’analyses et génère énormément de données, un nombre plus limité de réplicats biologiques a été généré. Ainsi, une validation sur une plus grande population a été faite par PCR quantitative (qPCR) à l’aide de gènes candidats identifiés dans l’étape de RNA-seq. Le chapitre 2 de ce mémoire présente le manuscrit en processus de publication qui décrit l’ensemble des résultats du projet. Ces résultats nous ont aidés à comprendre les changements que MAP induit dans les macrophages et à la compréhension des changements dans la réponse immunitaire globale des vaches atteintes de cette maladie. Ces différentes conclusions sont présentées dans le chapitre 3 de ce mémoire afin d’obtenir une vision globale des résultats obtenus lors de ma maîtrise et leur impact dans l’évolution des connaissances sur la paratuberculose bovine.

44

CHAPITRE 2 ARTICLE RÉDIGÉ

2.1

Référence de l’article

Cet article a été soumis en mai 2017 pour publication dans la revue Frontiers in cellular and infection microbiology. 2.2

Contribution des auteurs

Le manuscrit de l’article fut rédigé par Olivier Ariel, puis révisé et amélioré par Mme Nathalie Bissonnette. L’échantillonnage des animaux et l’interprétation diagnostique ont été réalisés par le Dr Gilles Fecteau et Mme Nathalie Bissonnette. Le traitement du sang et la préparation des macrophages ont été réalisés par Olivier Ariel et M. Pier-Luc Dudemaine avec la participation de M. David Fock-Chow-Tho. Les librairies furent fabriquées par Catherine Thibault. Le séquençage haut débit a été réalisé grâce à M. Nicolas Gévry et l’analyse bioinformatique a été réalisée par Olivier Ariel avec l’aide de l’équipe de Mme Eveline IbeaghaAwemu. L’interprétation des résultats fut réalisée par Olivier Ariel et Nathalie Bissonnette. Le design expérimental a été réalisé par Mme N. Bissonnette. Tous les auteurs ont lu et contribué à la rédaction de l’article. 2.3

Avant-propos de l’article

La paratuberculose est souvent étudiée sur des animaux sains que l’on infecte expérimentalement pour observer les résultats à court et moyen terme. Cependant, les études sur l’effet à long terme de la paratuberculose en étudiant les macrophages de vaches atteintes 45

sont manquantes. Ce manuscrit vient répondre à ce besoin dans la compréhension de la maladie. Dans ce projet, le transcriptome de macrophages primaires dérivés des monocytes circulants infecté in vitro par MAP a été analysé en RNA-seq. Des différences importantes dans les interactions hôtes pathogènes ont été observées lors de l’analyse des niveaux expression géniques des vaches diagnostiquées comme négatives ou positives. Ces modifications démontrent l’établissement de différents mécanismes durables de modulation de l’hôte par MAP dans la progression de la paratuberculose. Les modifications clés observées lors de mon projet sont un débalancement immunométabolique, un changement dans l’homéostasie du cholestérol et des lipides intracellulaires, ainsi que l’établissement d’un patron d’expression génique associé à la tolérance mémoire des macrophages. Cette étude contribue donc à une meilleure compréhension des mécanismes d’infection et de survie de MAP dans les macrophages, mais également dans l’établissement à long terme de la paratuberculose chez les vaches laitières.

46

2.4

Article

Deep transcriptome profiling of primary bovine macrophages infected by Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis suggests a subversion of host lipid metabolism and an innate immune tolerance state Olivier Ariel1, 2, Nathalie Bissonnette1, 2*, Eveline M. Ibeagha-Awemu1, Gilles Fecteau3, and Nicolas Gévry2 1

Sherbrooke Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada,

Sherbrooke, Qc, Canada 2

Department of Biology, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Qc, Canada

3

Faculty of Veterinary Medicine, Université de Montréal, Saint-Hyacinthe, Qc, Canada

* Correspondance: Nathalie Bissonnette, PhD [email protected]

11,150 words Keywords: Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis, bovine, paratuberculosis, macrophage, innate immunity, immune tolerance, RNA-seq, Johne’s disease

47

Abstract

Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of Johne’s disease (JD), which is also known as paratuberculosis, in ruminants. The mechanisms of JD pathogenesis are still unclear, but it is known that MAP subverts the host immune system by using macrophages as its primary reservoir. The effect of MAP infection on macrophages is often studied in healthy or experimentally infected cows, but reports on primary macrophages from naturally infected cows are lacking. In our study, in vitro experiment using primary monocyte-derived macrophages (MDM) allowed a deep analysis through next-generation sequencing (RNA seq) of the transcriptome of primary macrophages challenged in vitro with live MAP. The gene expression signatures of primary macrophages from cows diagnosed as negative or positive for JD [JD(–) or JD(+), respectively] revealed differential host–pathogen interplay, highlighting long-term mechanisms established during mycobacterial disease. In JD(–) cows, a considerable number of genes (1,436) were differentially expressed at 8 h postinfection (hpi). Interestingly, while expected immune response pathways were significally challenged by MAP, others related to hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation, lipid homeostasis, such LXR/RXR (liver X receptor/retinoid X receptor) activation, and autoimmune diseases such rheumatoid arthritis were consistently among the top significant pathways. Unexpectedly, the macrophages from JD(+) cows did not present a clear response pattern to MAP infection, neither during the early period (1–8 hpi) nor at 24 hpi. Analysis of the transcriptomic profile of the uninfected macrophages revealed 868 genes that were differentially expressed in JD(+) versus JD(–) cows. The down-regulated genes predominantly modified the general cell metabolism by down-regulating amino acid synthesis, cholesterol biosynthesis, and other energy production pathways while introducing a pro-fibrotic pattern associated with foam cells. These modifications show the apparent importance of the metabolic pathways hijacked by MAP to subvert the immune cells. Our findings support the hypothesis that MAP could induce a tolerant-like state in circulating monocytes when they are differentiating into macrophages. Thereby, MAP could further promote disease persistence by

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influencing macrophage behavior in the long term. This report contributes to a better understanding of MAP control of immune cells and its mechanisms of survival.

2.4.1 Introduction

Mycobacterium avium spp. paratuberculosis (MAP) is an obligate intracellular pathogen causing paratuberculosis, which is also known as Johne’s disease (JD). This disease is a granulomatous inflammatory disorder of the gastrointestinal tract and regional lymph nodes caused by a massive influx of monocytes and macrophages [1-2]. The MAP bacterium affects ruminants worldwide, both domestic and wild [3-5]. In cattle, JD progresses slowly and can be divided in three or four stages: silent infection, subclinical, and clinical/advanced clinical [6]. Following primary infection with MAP, the silent infection stage is generally asymptomatic [7]. The subclinical stage can be extremely variable (between two and five years) and is the most critical period since asymptomatic cows shed MAP into the environment through their feces. After the subclinical stage, gut mucosal inflammation effectively prevents absorption of nutrients, causing cattle to manifest various clinical signs, such as intermittent to chronic diarrhea, reduced milk production, reduce reproductive performance, emaciation, and eventually cachexia [5]. As a consequence, JD is responsible for major economic losses worldwide, notably in the dairy industry. There is currently no treatment for JD, and vaccines are not only ineffective at preventing new infections, but can actually interfere with the diagnosis of some mycobacteria [8-9]. The number of affected dairy herds is increasing worldwide. In 1997, the National Animal Health Monitoring System reported that 30% to 50% of herds in the United States were infected, while in 2006, the proportion of JD herds was estimated at around 70% [10]. In 2013, a statistical model estimated the true herd prevalence to be closer to 90% [11]. In the United States alone, the net monetary loss associated with JD is estimated to be between $US200 million and $US1.5 billion [12-13], and losses in Canada are in excess of CDN$15 million per year [14]. Additionally, there is a long-standing debate on the precise role played by MAP in Crohn’s disease in humans.

49

Because MAP introduces symptoms in ruminants similar to those of Crohn’s disease, it will remain an incriminating zoonotic factor until conclusive proof is established [15-18]. Cows’ primary contact with MAP generally begins with the ingestion of contaminated material, such as feed or from an environmental source. Following ingestion, the mycobacterium passes through the intestinal barrier. The importance of microfold M cells and macrophages in MAP infection was described previously [19-20]. The mycobacterium is then phagocytized, mainly by macrophages but also by dendritic cells. For invasion, MAP interacts with the cells’ receptors, such as DC-SIGN in dendritic cells or toll-like receptors (TLRs) and mannose receptors in macrophages [21-23]. The MAP-signaling mechanisms through TLRs are one of the survival strategies that MAP uses to escape the host’s defense mechanisms [24]. Several studies have also investigated the role of cytoplasmic recognition receptors in MAP infection, particularly nuclear oligomerization domain 2 (NOD2), which detects muramyl dipeptide (a hydrolyzed product of bacterial peptidoglycan), and phagolysosome membrane members, notably the SLC11A1 solute carrier. Those receptors have been found to be genetically associated with JD susceptibility [25-26]. Interestingly, mutations in the NOD2 and TLR genes, among others, are also associated with susceptibility to Crohn’s disease [2730]. Recruited macrophage–MAP cross-talk is most likely the first sustained activity that the host has to deal with during early infection [31]. Following invasion, MAP promotes short- and long-term survival for its replication using mechanisms that are not fully understood. Prevention of the maturation and acidification processes of the phagosome are among the most depicted MAP survival mechanisms [32-33], similar to what is observed in Mycobacterium tuberculosis infection [34-35]. This ability is an active process, since only live MAP bacilli can prevent phagosome maturation and lysosomal fusion [32-33;36-37]. The bacterium also appears to interfere with other host processes, such as the ability of macrophages to become activated by interferon γ (IFN γ) [38]. The macrophage–MAP cross-talk eventually turns into a duel that lasts for years with an unpredictable disease progression. Similar to other mycobacterial infections, MAP infection

50

elicits an initial strong T helper type 1 (Th1) mediated response that is dominated by IFN γsecreting T cells [39-40]. It is believed that this response dominates during the early stages of infection, given that distinct antigen recall responses have been observed in the later stages of the disease [41]. The first infection model proposed was that cows mount a Th1 cell-mediated immune response following primary infection and then change to a T helper type 2 (Th2) humoral response as the disease progresses [42-43]. This model was challenged by several subsequent studies, since the conversion to a Th2 humoral immune response was not the most accurate description of the steps in the progression of the disease [44-47]. As the disease progresses, T cell hyporesponsiveness is observed [45] and is well documented as T cell exhaustion [48-49] and/or anergy [44]. Although research has focused on antigen-specific T cell immune response, the presence of several types of regulatory T cells exist in the intestine of JD positive cows [48]. These regulatory T cells has been suggested to play a role in the progression of JD, either through promotion of tolerance to MAP or via a loss in homeostasis that subsequently allows widespread inflammation [50]. In addition, there are mounting evidences suggesting a systemic metabolomics transformation in MAP-infected animals during both the first [51-52] and the subclinical [45;53-54] stages of this disease. Models have been developed to study host–pathogen interactions. Some have focused on cow responses using artificial enteric infection models [31;52;55]. Infection with MAP and the development of paratuberculosis are the result of a complex interplay between the intracellular bacterium and the host. Following invasion of the intestinal barrier, the macrophage–MAP cross-talk eventually turns into a duel that lasts for years with an unpredictable disease progression. To better understand the pivotal role of the macrophage, the response to MAP infection was investigated using human monocytic cell lines [32;56] or bovine monocytes or monocyte-derived macrophages (MDMs) [57-65]. Most of those studies were conducted using monocytes or MDMs isolated from healthy cows. The long-term effect of positive JD status on primary macrophages has never been investigated. MAP leading to a remnant infection in livestock that jeopardizes both animal

51

health and human food security. To break it life cycle, we need to better understand how MAP leads to a persistent infection. JD originates from a complex interplay between the intracellular MAP bacteria, host macrophages, and other host factors (e.g. genetics). Nextgeneration RNA sequencing (RNA-seq) is an effective way of identifying the wholetranscriptome activity of primary macrophages from subclinical and clinical JD cows. The purpose of our study was to characterize the functional properties of primary macrophages in response to an in vitro challenge using a clinical field strain of MAP and to characterize the major regulatory pathways involved in MAP requisitioning of macrophages using RNA-seq.

2.4.2 Methodology

2.4.2.1

Ethical approval and consent to participate

All animal procedures were carried out according to the Canadian Council on Animal Care guidelines for institutional animal use, and ethical approval for the study was obtained from the Agriculture and Agri-Food Canada Animal Ethics Committee (protocols 424 and 431). The owners of all animals used in this study signed a collaborative agreement allowing the use of their animals.

2.4.2.2

Animal selection and JD diagnosis

The commercial dairy farms (tie and free stall) enrolled in this study were selected because of reported JD cases in their herds and were located in the province of Québec, Canada. To select animals for RNA-seq, the diagnostic results of a companion project were analyzed. Animals from multiple herds were blood sampled and tested for the presence of MAP antibodies using the Pourquier ELISA assay (IDEXX Laboratories, Markham, Ontario, Canada) according to the manufacturer’s instructions. Samples with a sample-to-positive ratio greater than or equal

52

to 55% were considered positive [66-67]. Fecal excretion of MAP was also confirmed using the mycobacterial culture method by the Laboratoire d’épidémiosurveillance animale du Québec (Saint-Hyacinthe, Québec, Canada), as described in [67]. Although only three biological replications are required to make inferences on the population in RNA-seq analysis [68], six replicates of each groups totalizing 12 cows were selected for the RNA-seq analysis. The cows were divided into two groups: negative [JD(–)] if both tests (serum ELISA and fecal culture) were negative (−/−; n = 6, animals G to L) or positive [JD(+)] if both tests were positive (+/+; n = 6, animals A to F). An additional 37 cows (18 JD-negative and 19 JD-positive) were selected for RT-qPCR validation of the RNA-seq data. These animals were tested every six months during a threeyear companion project [66]. The serums were analyzed using the ELISA (IDEXX Laboratories). The fecal excretion of MAP DNA was confirmed by PCR [66]. Confirmation of both tests during the longitudinal study was required to classify the cows as negative (−/−; n = 18) or positive (+/+; n = 19) for the RT-qPCR validation analysis. JD-negative cows were specifically selected to be in at least their second lactation to increase the likelihood of selecting truly negative cows. Mean age of JD(–) cows was 6.4±1.2 years, and 5.1±1.4 years for the JD(+) cows.

2.4.2.3

Monocyte isolation and MDM differentiation

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 700 mL of blood drawn from the jugular vein using two commercial transfusion bags containing citrate–phosphate– dextrose–adenine anticoagulant (Animal Blood Resources International, Dixon, CA, USA). The methods used to isolate PBMCs and monocytes by adherence and to culture the MDMs have previously been described [45;69]. PBMCs were seeded in CELLSTAR TC T-75 flasks (Greiner Bio-One North America Inc, Monroe, NC, United States) at a density of 4 × 107 cells per flask with RMPI 1640 medium (Wisent, Saint-Bruno, Québec, Canada) supplemented by 10% bovine heat-inactivated heterologous serum from JD-negative cows and a mix of L-glutamine (Wisent) and GlutaMax (Life Technologies, Burlington, Ontario,

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Canada) and antibiotics/antimycotics (Wisent). After an incubation period of 2 h in a humid atmosphere at 39°C with 5% CO2, non-adherent cells were removed and cells were gently washed with complete media. After overnight incubation, monocyte culture was washed twice with complete media, remnants of non-adherent cells were removed, and the medium was changed for a new RPMI 1640 medium containing 10% heat-inactivated FBS, the mixture of L glutamine and GlutaMax, and the antibiotics/antimycotics. The purity of CD14+ monocytes was confirmed by flow cytometry using an anti-CD14 FITC labelled antibody as described previously [45;70]. The purity of CD14+ cells was estimated ≥90%. For differentiation of monocytes into macrophages, cultures were maintained for 7 to 10 days in a humid atmosphere at 39°C with 5% CO2, with the medium being refreshed every 2 to 3 days. Macrophage purity was validated by flow cytometry using anti-CD68 antibody, targeting a macrophage specific lysosomal-associated membrane protein [71]. The cells were fixed and permeabilized using Cytofix/cytoperm kit (BD biosciences, Mississauga, Ontario, Canada). The primary antibody was a mouse monoclonal anti-human CD68 (M071801-5; Agilent) and the secondary antibody was a rat anti-Mouse PE labelled IgG1 (P-21129; ThermoFisher, Waltham, MA, USA). As for the CD14 assay, the flow cytometry analysis was performed on the 3-laser FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences). After 7-10 days, differentiation was estimated at 90±3%. Once the cell displayed macrophage morphology, the medium was changed for complete media without the antibiotics/antimycotics. The macrophages were then incubated overnight under the same conditions for the MAP infection experiment on the following day.

2.4.2.4

Bacterial preparation and in vitro MAP infection of primary macrophages

A live MAP strain (Canadian clinical field strain 39382) was cultured using Middlebrook 7H9 liquid media with supplements of mycobactin J (Allied Monitor, Fayette, MO, USA) at a final concentration of 2 µg/L, 100 mL/L of oleic albumin dextrose catalase (OADC) growth supplement (BD Biosciences,) and 2% (v/v) glycerol (Bioshop, Burlington, Ontario, Canada).

54

The absorbance (A600nm) of the bacterial suspension was measured weekly to assess bacterial growth. After 10 weeks, bacteria were harvested, washed with sterile phosphate

Figure 2.1 Experimental design. Monocyte were isolated from Johne’s disease negative [JD(–)] and positive [JD(+)] cows and cultured in vitro to support their differentiation into macrophages before the infection using live MAP at a MOI of 10:1. The 4 and 24h controls are surrounded with a dotted lin e and were used as biological replicate for the RNA-seq and qPCR analysis.

buffer saline (PBS) (pH 7.4), and then resuspended in PBS. The suspension was passed through a 26 gauge needle to disperse the clumps, and MAP concentration was evaluated by absorbance at 600 nm as described elsewhere [59;72-75]. Cell culture and infections were performed at 39°C, the temperature at which MAP infectivity is enhanced [76]. The experimental design of the MDM infection is shown in Figure 2.1. Infections were performed for incubation periods of 1h, 4h, 8h, and 24h at a multiplicity of infection of 10 bacteria for each macrophage, as described elsewhere [77]. Two uninfected control flasks were also collected at 4 h and 24 h. To stop the infection, cells were washed twice with PBS and harvested by adding 1.8 mL of RLT buffer (Qiagen, Toronto, Ontario, Canada) to each culture flask. Lysed cells were conserved at −80°C until required for RNA extraction.

55

2.4.2.5

Fluorescent labelling of MAP in macrophages

The adherent monocytes from the T-75 flask were harvested after 2 h using Trypsin 0.05% / EDTA 0.53 mM (Wisent) and were seeded at a density of 1 million cells on a glass coverslip. Cells were cultured in a six-well plate under the same conditions as described above. After MAP infection, the cells were washed with RPMI and then fixed using ice-cold 100% ethanol. The coverslips were then stained with a Morse coloration using the commercial BD Auramine M kit protocol (BD Biosciences) and a DAPI 300 nM solution (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) for 30 min. Coverslips were mounted on a microscope slide using Fluoroshield (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and examined using the Zeiss Axio Observer Z1 (Zeiss Canada, Toronto, Ontario, Canada). Analyses were performed using the ZEN 2 (blue edition) v2.0.0.0 software at the imaging platform of the Department of Biology of the Université de Sherbrooke (Quebec, Canada). All images were taken with the 63× objective and consisted of a merged image of the eGFP, DAPI and differential interference contrast (DIC) channels.

2.4.2.6

RNA extraction, Libraries and sequencing

For the samples used for the RNA-seq analysis (MDM from 12 cows), the RNA was extracted using the RNeasy kit (Qiagen) with the on-column DNase treatment according to the manufacturer’s recommendations. The RNA from the additional 37 animals used for qPCR validation were extracted using a different protocol, allowing for the extraction of both total RNA for qPCR validation and small RNA for future analysis. The RNeasy classic protocol does not retain small RNA in the final fraction. The lysed cell samples in the buffer RLT were processed using a phenol–chloroform method. The different time points were extracted using TRIzol LS (Thermo Fisher) and chloroform separation. The aqueous phase was then treated with the miRNeasy kit using the total RNA extraction protocol according to the manufacturer’s recommendations. The RNA yield of the samples (four infection and two

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control time points per animal) was quantified using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Fisher). The quality was assessed using the Bioanalyzer RNA 6000 kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Following rRNA removal using the Ribo-Zero Gold kit (Illumina, Victoria, British Columbia, Canada), 72 cDNA libraries (12 animals × 6 samples, including infection and control time points) were generated from 250 ng of total RNA using the Illumina TruSeq Stranded Total mRNA Sample Preparation kit (Illumina). The length of the fragments was assessed using the Agilent High Sensitivity DNA Chip (Agilent Technologies) on a 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), and the concentration was determined using a NanoDrop spectrophotometer. Libraries were sequenced at the McGill University and Génome Québec Innovation Centre (MUGQIC) (McGill University, Montreal, Quebec, Canada). Samples were multiplexed in equal ratios (six libraries per two sequencing lanes, equivalent to three libraries per lane) and sequenced in the form of 50-cycle 100 bp paired-end reads on a HiSeq 2000 instrument (Illumina). RNA-seq data were deposited in the NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database under the accession number GSE98363.

2.4.2.7

RNA-seq read preparation and alignment

Using barcode-indexed demultiplexed FASTQ files a minimum of 60 million paired reads were obtained for each sample. The analysis was performed on the MP2 computing cluster of Compute Canada at the Université de Sherbrooke using the RNA-seq pipeline v.1.2 developed by the MUGQIC team [78]. Briefly, trimming and clipping were done using Trimmomatic software v0.32 [79]. Trimming was performed by removing extremities that had a phred quality score below 20 in each four-nucleotide window. The same quality pass or fail criteria were also used for the entire read. Reads with a minimum length of 32 nucleotides were aligned using TopHat software v2.0.9 [80] to the Btau 4.6.1 reference genome [81], allowing for two mismatches per read. The quality of the alignment was verified by checking for high levels of duplicated reads and low transcript coverage with the RSeQC package. Further

57

analysis focused on uniquely mapped reads to calculate the gene count. These unique reads were used to calculate the fragments per kilobase per million mapped reads (FPKM) of each gene for downstream differential gene expression and system biology analysis. Transcripts covered by fewer than five read counts were filtered out to remove traces of trivial gene expression.

2.4.2.8

RNA-seq gene expression evaluation

The FPKM calculated by Cufflinks software v2.1.1 was used to determine the transcript expression rate. Correlation analyses were performed on the FPKM gene expression values to discriminate our samples and identify outsider samples using the cor function from the stats package of R software v3.1.2 [82]. All samples with a correlation value of less than 50% with the other biological replicates for their corresponding time point and JD status group were eliminated from subsequent analyses. To examine the global sample distribution, principal component analysis (PCA) plots of the FPKM values of each sample and time point were drawn using the stats R package. The PCA graphs were produced for the sample of each JD group separately and also using total samples from both groups. All R analyses and graphs were processed in RStudio v0.99.467 [83]. Cuffdiff v3.10 software [84] was used to identify differentially expressed (DE) genes based on the transcript assembled by Cufflink. Two types of comparisons were performed using Cuffdiff: first, the effect of infection in each JD status group was evaluated by comparing the pooled control samples to each infection time point (1 h, 4 h, 8 h and 24 h); and second, the effect of the JD status was assessed by comparing the response of macrophages from the JD(–) cows to the samples from JD(+) cows for each infection and control time point individually.

58

2.4.2.9

Functional analysis

Functional analysis of the DE genes was performed using Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software (summer release, June 2016, Qiagen) to depict the biological influence of the DE genes identified in all the comparisons carried out in the RNA-seq analysis. Significantly DE genes were analyzed through a functional clustering analysis to identify biological functions affected by those changes using Fisher’s exact test statistical analysis [false discovery rate (FDR)–corrected p value ≤ 0.05].

2.4.2.10

RT-qPCR validation analysis

The RNA from MDM (4 time points and controls) from the 49 animals was processed for reverse transcription, performed using 1 µg of total RNA with SuperScript II reverse transcriptase (Life Technologies Inc.). The primers were designed using Primer Express software (Thermo Fisher) (Supplementary Table 2.S1). Their sequences were validated using Primer-BLAST tool [85]. Optimizations of primers were performed for each gene by testing different concentrations of both forward and reverse primers, each ranging from 50 to 900 nM. Estimations of primer efficiencies were analyzed using the standard curves made from a serial dilution from the pool of cDNA encompassing all experimental conditions as described [86]. Aliquots of the different points were kept frozen and used once. The relative quantification of gene expression was determined using the 2-ΔΔCt method [87]. Normalization was performed using the geometric mean of PPIA and UXT, which were identified as being among the five most stable housekeeping genes of primary bovine macrophages [45]. Conditions for the qPCR were optimized for the housekeeping and target genes. Triplicate qPCR reactions were performed with the Fast SYBR Green Master Mix buffer (Thermo Fisher) in a final volume of 10 µL. Reactions were read on a 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher). The qPCR validation focused on the control, 4h and 8h time points because they had the greatest variation and biological meaning. The genes selected for

59

qPCR validation were identified as being present in multiple IPA top-ranking pathways and networks that could be involved in immune tolerance. The selected gene had a fold-change (FC) value over 4. The expression levels of the CCL2, CSF3, IL1A, IL10, HIF1A, IDO1 and NOS2 genes were evaluated to confirm the IPA pathways. Table 2.S1 : Primers sequences used in the qPCR validation Gene

Refseq mRNA

CSF3

NM_174028.1

IDO1

NM_001101866. 2

CCL2

NM_174006.2

HIF1 A

NM_174339.3

GPX4

NM_174770.3

GSR

NM_001114190. 2

IL1A

NM_174092.1

IL10

NM_174088.1

NOS2

NM_001076799. 1

PPIA

NM_178320.2

Primer name 1

Sequence ( 5'-3')

Tm

% G-C

CSF3_F334 CSF3_R596 IDO1_F868 IDO1_R999 CCL2_F140 CCL2_R275 HIF1A_F950 HIF1A_R1100 GPX4_F566 GPX4_R643 GSR_F632 GSR_R733 IL1A_F211 IL1A_R398 IL10_F386

CTGCCTGAACCAACTACACGG GGAAACGATGCAGCTGGGAA TGGGCATTCAGCACAGTATTG CACGGACCGAGGGCTTT CGCCTGCTGCTATACATTCAA GTCTGCACATAACTCCTTGCC GTGAACCCATTCCTCATCCATC GAGCGGCCCAAAAGTTCTTC TGCTGGGAAACGCCATCAAATG CTTCCATGGGACCATACCGC GTGCCAGCCTAGGAATAACC CAGCTATTTCCACGGCGATG GTCCCTGGATACCTCGGAAAC GTGCTGATCTGGGCTTGATGA TTCTGCCCTGCGAAAACAAG CGTTGTCATGTAGGTTTCTATGTAGTTGA T CTCGGAGTTTTCCCATGCA CGCTTATCCTTGACCCAATAGCT ATGCTGGCCCCAACACAA CCCTCTTTCACCTTGCCAAA TGGCAGAAGCTCTCAAGTTCATT

61,2 61,0 58,0 58,0 58,8 59,3 58,8 59,8 61,2 60,5 58,0 59,4 59,9 60,4 60,0

57,1 55,0 47,6 64,7 47,6 52,4 50,0 55,0 47,6 60,0 55,0 55,0 57,1 52,4 50,0

60,0

36,7

60,0 60,0 56,0 56,0 60,0

52,6 56,9 55,6 50,0 43,5

IL10_R522 NOS2_F2317 NOS2_R2453 PPIA_F317 PPIA_R417 UXT_F339

NM_001037471. 2 UXT_R443 CATGTGGATATGGGCCTTGAT 62,0 47,6 1 Lab internal primer name where the last number are the extremities of the amplicon on the mRNA sequence of each genes UXT

2.4.2.11

Statistical analysis

For RNA-seq data analysis, DE genes were defined as significant with a p-value below 0.05 after FDR (q value) correction using the approach of Benjamini and Hochberg [88] as recommended [89]. A fold change greater than 2 was considered DE to take into account the biological importance of gene expression difference. Uninfected 4h and 24h control samples were used as biological replicates to increase the statistical power.

60

The statistical analysis of qPCR results was performed using SAS/STAT software (SAS Canada, Toronto, Ontario, Canada). Since the relative expressions returned non-normal distribution for all studied genes, a non-parametric one criterion variance analysis was done using the Kruskal–Wallis test [90]. The differential gene expression was considered significant for the qPCR assay when the result of the Kruskal–Wallis test was below 0.05.

2.4.2.12

Lipid accumulation assay

The monocytes were isolated and differentiated into macrophages as described previously (section 2.3) with some modifications. The cells were seeded at a concentration of 5 × 105 per wells in 24-wells plates (Corning, New York, NY, USA). Following differentiation, macrophages were infected with MAP at a MOI of 10 as described in section 2.4 for 24 h, were washed using PBS, and cultured in complete media for an additional 5 days, as described elsewhere [34]. The lipids were stained using Oil red-O as described by Xu et al (2010) with a minor modification [91]. The Oil red-O stock solution was bought prepared at the 0.5%(w/v) concentration in isopropanol (Sigma). The same 0.3%(w/v) working solution was used, prepared by diluting the stock solution 6:4 with deionized water and filtered using a 0.22µM filter (EMD Millipore, Etobicoke, Ontario, Canada). The samples from one JD(+) cow and one JD(–) cow including all experimental infection conditions were simultaneously treated to eliminate any bias. The cells were stained at 37°C for 1min followed by a fading step performed with 60% isopropanol for 15s. The final washing step was performed three times for three minutes each using PBS and gently shaken at room temperature. Lipid Oil red-O staining was observed using the light microscopy channel of the Evos FL Auto microscope (Thermo Fisher). Photography and image processing were performed using the included EVOS FL Auto Software Revision 1.7 (Thermo Fisher).

61

2.4.3 Results

2.4.3.1

Infection efficiency

The capacity of primary MDMs from JD(−) and JD(+) cows to become infected by MAP was confirmed ex vitro by fluorescence microscopy. The progression of MAP infection was tracked using a fluorescent dye (auramine). As shown in Figure 2.2, MAP uptake by the macrophages was similar in both JD status groups at 8 h post-infection (hpi) and 24 hpi. The infection was found to be widespread at 8 hpi and 24 hpi, with no notable differences between the two groups, in which more than 90% of cells were infected (Supplementary Table 2.S2). As the infection progressed, the percentage of infected macrophages reached a plateau at 4 hpi and showed an analogous infection progression for both JD groups (data not shown). In the control samples, MAP was not detectable by either fluorescence microscopy or by qPCR. No MAP could be detected in the genomic extracts from the PBMC, the isolated monocytes, or the uninfected macrophages maintained in culture for up to 10 days (data not shown).

62

Figure 2.2 Evaluation of MAP uptake by macrophages from Johne’s disease negative (A) and Johne’s disease positive (B) cows. The infection efficiency was evaluated in vitro using fluorescence microscopy after 8h and 24h incubation with MAP. These images, which are representative of three independent experiments on three different cows, show control (CTL) uninfected cells and 8h or 24h MAP-infection time points. The images were merged from an observation of stained mycobacteria shown in green, nucleic acid stained (DAPI) in blue, and differential interference contrast at 630× magnification. Scale bar = 40 µm.

Table 2.S2 : Macrophages MAP infection percentage at each time point of the in vitro infection mesured using the fluorescence microscopy picture Time points

JD negative %

SD

JD positive SEM

%

SD

SEM

TNI 4h

0,0 95,5

± 0,0 ± 3,6

0,0 1,2

0,0 N/A

± ±

0,0 N/A

0,0 N/A

8h 24h

97,3 98,5

± 2,3 ± 1,6

0,8 0,5

97,0 95,5

± ±

1,4 5,3

0,5 2,2

63

2.4.3.2

Summary statistics for RNA-seq data

The 72 RNA-seq libraries generated an average of 109 million paired-end reads per library, with an average read length of 88 bases after trimming of adapters and poor-quality sequences. After alignment to the bovine reference genome, 62.8% of reads mapped at unique locations, whereas others mapped either to multiple locations, to ribosomal or to mitochondrial sequences. Among the 72 libraries, a mean of 9,691 assembled transcripts were identified and 96.8% were annotated (9,383 genes per library). No significant differences (p = 0.4207) between these numbers were observed based on JD status (Supplementary Table 2.S3). In addition, no significant differences were observed across the different time points, suggesting that the sequence read coverage was optimal even for macrophage samples challenged with MAP. A similar total number of genes was detected among the 72 samples, suggesting that 60 million reads per time point were sufficient to track the diversity of gene expression and that high-abundance genes did not mask lower-abundance genes. Among the sequenced transcripts, our RNA-seq library contains a substantial proportion of the reads (33.16%) were considered intergenic, i.e. outside the exons or introns (e.g. 5’- and 3′-UTR regions, or nascent transcription outside the annotated gene locus). A large proportion of reads (57.76%) were associated with the exons, and the remaining 8.96% were associated with intronic sequences. Table 2.S3 RNA-seq metrics mean for the 72 libraries of MDM from both JD status (± SD) JD status

Intragenic rate

Exonic rate Intronic rate

Intergenic

Transcripts

Genes

rate

Detected

Detected

JD(+)

0.67 ± 0.02 0.59 ± 0.02 0.08 ± 0.01 0.33 ± 0.02 9668 ± 341 9360 ± 328

JD(−)

0.66 ± 0.07 0.56 ± 0.06 0.10 ± 0.02 0.34 ± 0.07 9714 ± 123 9407 ± 118

64

2.4.3.3

Global sample comparison using PCA

In the present study, six animal replicates for both JD groups and for each time point were analyzed. In order to capture similarities and variations within this large multivariate dataset, the 72 RNA-seq datasets were subjected to PCA. These representations help identify the transcriptomic profiles that correlate in response to MAP infection. As shown in Figures 2.3A and 2.3B, JD(–) and JD(+) samples form distinct patterns. While a major correlation was observed among JD(–) samples (G–L, Figure 2.3A), a non-uniform pattern was observed in JD(+) samples (A–F, Figure 2.3B). The signature of the transcriptome of the macrophages maintained under the same in vitro culture conditions are also clearly different depending on whether they belong to one group or to the other. The effect of MAP infection was observed only for JD(–) macrophages (Figure 2.3A). With the exception of sample K (4h uninfected control), all the control samples from JD(−) cows were grouped together. In JD(–) macrophages, some samples clustered together and could efficiently distinguish the control and 24 hpi samples from the other MAP infection time points (Figure 2.3A). Surprisingly these concerted patterns in response to MAP infection were not observed in JD(+) macrophages (Figure 2.3B). The second PCA analysis clearly confirmed the general distinction between the two JD statuses (Figure 2.3C). The samples from each JD group are more closely clustered together than with the samples of the other JD status. This corroborates our observations of the molecular signature of the macrophages depicted by the first PCAs (Figures 2.3A and 2.3B), suggesting a predictable trend of response to MAP infection in JD(–) but not in JD(+) macrophages.

65

Figure 2.3 Principal component (PC) analysis of RNA-seq expression values from macrophages of Johne’s disease (JD) negative (JD(–)) cows (A), JD positive (JD(+)) cows (B) and analysis of macrophage from both JD status groups (C). (A) and (B) report the first (PC1) and second (PC2) components, while (C) represents the second (PC2) and third (PC3) components. JD(–) cows are designated by letters A-F and JD(+) cows by letters GL. Each graphs shows controls (CTL4h and 24h) and MAP infection (MAP1h, 4h, 8h and 24h) time points.

66

2.4.3.4

2.4.3.4.1

RNA-seq differential gene expression profiles

Effect of in vitro MAP infection of macrophages from JD(−) cows

In response to MAP infection, several DE genes were identified in macrophages from JD(–) cows. An important shift in gene expression was observed as early as 1 hpi, when 148 genes were found to be upregulated and 73 down-regulated, for a total of 221 DE genes (Figure 2.4A). The number of DE genes increased as the infection progressed, with a total of 839 DE genes after 4 h, 1,436 after 8h, and 1,269 after 24h. A notable proportion of up- and downregulated genes remained DE at 8 hpi and 24 hpi (Figure 2.4A). Interestingly, the number of down-regulated genes was very similar to the number of upregulated genes, suggesting a major transcriptome remodeling. Many genes responsible for the expression of interleukins (IL) and chemokines (CC), such as IL6, IL1A, CCL8, and CCL4, and the tumor necrosis factor (TNF) were upregulated (Table 2.1). Pentraxin 3 (PTX3) was one of the top 10 upregulated genes at 1 hpi, 4 hpi, and 8 hpi (Table 2.1). Several collagen alpha-chain protein genes, such as COL1A1, COL1A2, and COL6A1, were also found to be among the top 10 down-regulated genes. Those collagen alpha-chain genes actually represent half of the top 10 down-regulated DE genes at 1 hpi and 8 hpi in JD(–) macrophages.

Figure 2.4 Number of differently expressed (DE) genes following MAP infection compared to the controls in Johne’s disease (JD) negative (JD(–)) macrophages (A) and JD positive (JD(+)) macrophages(B). (C) Number of DE genes in macrophages from JD(+) cows compared to JD(–) macrophages at each control or infection time point.

67

1

Table 2.1 Top 20 DE genes after MAP infection vs. uninfected CTL samples of macrophages from JD(−) cows. Gene Symbol

1 h PI FC 3 2 q-value (log2)

Gene Symbol

4 h PI FC 2 (log2)

q-value

3

Gene Symbol

8 h PI FC 2 (log2)

q-value

3

Gene Symbol

24 h PI FC 2 (log2)

q-value3

IL6

6.53

0.0027

PTX3

8.63

0.0007

PTX3

8.43

0.0005

EDN1

7.19

0.0005

IL1A PTX3

5.84 5.76

0.0027 0.0027

EDN1 IL6

7.76 7.26

0.0007 0.0007

EDN1 IL6

8.05 7.46

0.0005 0.0005

IL6 CSF2

7.05 6.53

0.0005 0.0005

EDN1 F3

5.57 5.47

0.0027 0.0027

TNF CSF2

6.96 6.95

0.0007 0.0007

CSF2 LIF

7.27 7.00

0.0005 0.0023

CTSL WFDC18

6.24 6.14

0.0005 0.0005

TNF

5.40

0.0027

LIF

6.81

0.0007

CCL20

6.99

0.0005

IL1A

5.92

0.0005

NR4A1 CCL8

5.11 5.04

0.0027 0.0027

F3 CCL8

6.42 5.79

0.0007 0.0007

F3 CSF3

6.60 6.31

0.0005 0.0005

F3 KCNJ15

5.85 5.83

0.0005 0.0005

LIF RND1

4.82 4.75

0.0131 0.0027

IL1A CCL4

5.79 5.69

0.0007 0.0007

TNF FGF18

6.20 6.14

0.0005 0.0256

MT1A CSF3

5.82 5.77

0.0005 0.0005

MMP2

−4.62

0.0027

SLC40A1

−2.74

0.0007

EHHADH

−4.52

0.0005

MMP2

−5.34

0.0027

SPARC ACTA2

−5.25 −5.36

0.0027 0.0311

TFAP4 EHHADH

−2.76 −2.78

0.0156 0.0007

TNC SLC40A1

−4.73 −4.75

0.0005 0.0005

ALOX5 GJA1

−5.58 −5.61

0.0009 0.0005

TAGLN COL3A1

−6.37 −6.45

0.0131 0.0027

TLR5 S1PR1

−2.81 −2.89

0.0042 0.0007

COL3A1 COL1A2

−4.78 −4.84

0.0005 0.0005

S1PR1 FBN1

−5.80 −5.93

0.0005 0.0005

COL6A2

−6.54

0.0297

PDK4

−2.93

0.0007

COL1A1

−4.90

0.0005

SLC1A3

−6.06

0.0009

COL1A2 COL6A1

−6.79 −6.83

0.0027 0.0297

FLNC ANKRD1

−3.16 −3.60

0.0171 0.0257

S1PR1 COL6A2

−5.07 −5.07

0.0005 0.0097

SPIC SPARC

−6.61 −7.64

0.0062 0.0062

TNC COL1A1

−7.21 −8.01

0.0047 0.0196

PIK3IP1 GSTM3

−3.89 −4.22

0.0007 0.0072

COL6A1 PIK3IP1

−5.09 −5.48

0.0040 0.0005

COL1A1 COL1A2

−8.76 −9.04

0.0487 0.0051

1

Genes with a fold-change q-value (FDR-corrected p-value) greater than 0,05. Fold-change (FC) values are the ratio (log2) of FPKM values of MAP-infected MDMs vs. uninfected controls from JD(−) cows. 3 FDR-corrected p-value 2

2.4.3.4.2

Effect of in vitro MAP infection of macrophages from JD(+) cows

In macrophages from JD(+) cows, the effect of MAP infection on the transcriptome remodeling was trivial. Only 32 genes were found to be significantly affected in the presence of live MAP and those were at 4 hpi time point. Neither 1h incubation, nor 8h or 24h had a significant effect on gene expression from the six replicates in response to MAP infection (Figure 2.4B). The list of the top 20 affected genes under these conditions is shown in Table 2.2. The only significant upregulated gene observed was PTX3. The top 20 down-regulated genes included collagen alpha-chain protein gene, such as COL1A1, COL1A2, and COL3A3 as well as TNF superfamily member 18 (TNFSF18), which was the most down-regulated gene in JD(+) cows. The myosin heavy chain 10 (MYH10), the isoform of α-actin (ACTA2), and

68

COL12A1, another collagen alpha-chain gene, were also found down-regulated in the JD(+) cows but upregulated in JD(–) at the 4h time point. Table 2.2 Top DE genes1 (q-value ≤ 0.05) after MAP infection vs. uninfected CTL samples of macrophages from JD(+) cows. 4 h PI Gene Symbol

FC (log2)2

q-value3

PTX3 COL1A2 NT5E COL3A1 SERPINE2 LGR4 FBN1 NID2 NES GJA1 LAMA4 SFRP4 LUM CDH11 DCN PDGFRA CAV1 COL1A1 PTN TNFSF18

4.37 −5.32 −5.34 −5.42 −5.49 −5.55 −5.60 −5.70 −5.74 −5.83 −5.85 −5.88 −5.88 −6.01 −6.29 −6.37 −6.66 −6.96 −6.99 −7.63

0.0419 0.0333 0.0481 0.0206 0.0206 0.0333 0.0206 0.0206 0.0206 0.0206 0.0481 0.0333 0.0333 0.0206 0.0206 0.0419 0.0206 0.0206 0.0206 0.0206

1

Genes with a fold-change q-value (FDR-corrected p-value) greater than 0,05. Fold-change (FC) values are the ratio (Log2) of FPKM values of MAP-infected MDMs vs. uninfected controls from JD(−) cows. 3 FDR-corrected p-value. 2

69

2.4.3.4.3

Effect of JD status on MAP-infected macrophages

The expression profile of macrophages isolated from JD(–) and JD(+) cows were compared at each time-points. The proportions of up- and down-regulated genes for each condition are shown in Figure 2.4C. The status of the cow (JD positive or negative) affects the transcriptomic activity of uninfected (i.e control; CTL) macrophages, with 337 and 191 DE genes found at the 4h and 24h control time points respectively. When both control time points, i.e. CTL4h (n= 6) and CTL24h (n = 6), were combined as biological replicates (n = 12), the number of DE genes in uninfected controls from JD(–) and JD(+) cows increased to 868. In response to MAP infection, the DE genes between JD(+) and JD(−) macrophages increased as the infection progressed, with 294, 482, 778, and 691 DE genes at the 1 hpi, 4 hpi, 8 hpi, and 24 hpi time points, respectively. The top 10 up- and down-regulated DE genes at each time point are shown in Table 2.3. The genes responsible for the expression of collagen protein were among the top genes, having the highest expression gap when comparing JD(+) to JD(−) macrophages. For example, early as 1 hpi, COL1A2 in JD(+) macrophages was 10.97 times higher than its level found in JD(−) macrophages and, interestingly, COL1A2 remained the top upregulated gene at 24-hpi time point. Several collagen genes were downregulated in JD(−) macrophages by MAP while they were not affected in JD(+) macrophages. This explains the higher expression levels observed in JD(+) cows than in JD(−) cows. Similarly, the expression of the chemokine ligands, such as CCL8 and CCL3, and the chemokine C-X-C motif ligand CXCL10 was much lower in JD(+) cows (Table 2.3), because most of the chemokine genes (e.g. CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL20, CCL24, CXCL2, CXCL3, and CXCL13) were highly upregulated in JD(−) macrophages following infection (data not shown). Genes responsible for the expression of growth factor genes, such as colony-stimulating factor (CSF) 1, CSF2, and CSF3, and for rate-limiting the tryptophan catabolism, named indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO1), were among the top 10 downregulated genes in JD(+) cows compared to JD(−) cows (Table 2.3) also because these genes were highly upregulated in macrophages from JD(−) cows in response to MAP infection (data not shown).

70

71

0.0195 0.0018 0.0018

7.33

7.30

7.26

7.21

7.19

7.10 6.99

−2.22

−2.25

−2.36

FGF7

LUM

NOV

IL1RL1

C1QTNF3

SGCE PTN

MATK

FAM195A

HCRTR1

OOSP1

EEF1A2

SGCA

−3.19 −3.59

−2.98

−2.88

−2.71

ELMO3

FABP4

−2.62

TRIM47

0.0018 0.0144

0.0018

0.0018

0.0352

0.0018

0.0054

0.0284

0.0018

0.0018

0.0018

0.0054

0.0352

CYP1A2

OOSP1

SEMA3A

SGCA

DBC1

LOC515418

MATK

MCRIP2

−4.45

−3.19

−2.38

−2.29

−2.28

−2.28

−2.20

−1.97

−1.86

−1.78

ATP13A2 PARVB

10.11 9.96

SPARC MMP2

10.34

10.39

COL3A1 TAGLN

10.44

10.66

10.97

11.06

ACTA2

FMOD

COL1A2

COL6A1

12.04

12.12

TNC COL1A1

FC (log2)2

Gene Symbol

1 h PI

0.0470

0.0460

0.0025

0.0289

0.0102

0.0025

0.0046

0.0322

0.0102

0.0163

0.0025 0.0025

0.0426

0.0025

0.0415

0.0133

0.0025

0.0332

0.0148

0.0133

q-value3

CCL8

CYP1A2

IDO1

CSF2

IFIT3

LIF

EGR1

CSF1

CD69

HAS2

HMOX1 SMTNL2

SELP

OLFM1

TMEM182

CXCL9

EGLN3

TMEM45A

HES1

HSPA1A

Gene Symbol

−5.49

−4.28

−4.23

−4.22

−4.22

−3.88

−3.40

−3.26

−3.25

−3.24

2.97 2.96

3.01

3.02

3.03

3.26

3.49

3.53

3.93

5.08

FC (log2)2

4 h PI

0.0019

0.0219

0.0019

0.0019

0.0019

0.0019

0.0019

0.0019

0.0035

0.0019

0.0019 0.0019

0.0068

0.0203

0.0307

0.0131

0.0019

0.0019

0.0019

0.0019

q-value3

CCL8

IDO1

MT1A

CSF2

MGC139164

CTSL

CISH

LIF

ISG15

IFIT3

LAMA4 DPYSL3

COL1A2

LUM

SPARC

CDH11

COL3A1

COL6A2

ACTA2

COL6A1

Gene Symbol

−4.32

−4.30

−4.01

−3.96

−3.43

−3.26

−3.23

−3.22

−3.21

−3.20

6.79 6.78

6.88

7.06

7.15

7.15

7.18

7.24

7.30

7.40

FC (log2)2

8 h PI

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0012

0.0203 0.0096

0.0012

0.0039

0.0012

0.0150

0.0012

0.0066

0.0052

0.0012

q-value3

WFDC18

CTSL

TCN1

CCL3

KCNJ15

ABCG1

ALPL

MGC139164

CSF3

CXCL13

SERPINE2 CYR61

CDH11

TNC

COL12A1

GJA1

MMP2

FBN1

SPARC

COL1A2

Gene Symbol

−6.72

−5.33

−4.18

−3.61

−3.60

−3.54

−3.45

−3.41

−3.36

−3.31

7.63 6.94

7.82

8.18

8.77

9.14

9.20

9.97

10.71

11.76

FC (log2)2

24 h PI

0.0017

0.0017

0.0017

0.0017

0.0017

0.0154

0.0263

0.0059

0.0017

0.0017

0.0370 0.0434

0.0246

0.0017

0.0370

0.0017

0.0041

0.0017

0.0386

0.0241

q-value3

2

Genes with a fold-change q-value (FDR-corrected p-value) greater than 0,05. Fold-change (FC) values are the ratio (Log 2) of FPKM values of macrophages from JD(+) compared to JD(−) cows in MAP-infected and. uninfected time points. 3 FDR-corrected p-value.

1

0.0201

7.58

COL11A1

−2.50

0.0032

7.66

DNM1

0.0073

8.29

FAP

SFRP4 0.0018

q-value3

FC (log2)2

Gene Symbol

CTL

Table 2.3 Top 20 DE RNA-seq genes1 between MDMs of JD (+) cows vs. MDMs of JD (−) cows under different in vitro experimental conditions: uninfected controls (CTL) or different incubation periods in the presence of MAP, in order of log2 (fold change)1

2.4.3.5

2.4.3.5.1

Functional analysis

Functional analysis of DE genes in in vitro MAP infection in JD(−) cows

Canonical networks and pathways were identified for each time point using the DE genes. The results indicate that several immune response pathways were activated or repressed in JD(−) macrophages following MAP infection. Immune pathways were affected as early as 1 hpi and remained on the list of the canonical pathways throughout the infection (Table 2.4 and Supplementary Tables 2.S4-2.S6). MAP initiated a change in host pathways related to immunity, inflammation and wound healing in macrophages. Among the most important change was the Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis pathway that top ranked at 4 hpi by IPA (Supplementary Table 2.S5). Although it was progressively rated down as the infection progressed, it remained one of the top 10 regulated pathways at 24 hpi (Supplementary Table 2.S6). The Figure 2.5 presents the Role of macrophages in rheumatoid arthritis pathway which had the highest number of DE genes at the 8 hpi time point (Table 2.4). In this pathway, several DE genes converged through the NFκβ pathway. The top 30 most enriched pathways at 8 hpi are presented in Table 2.4. Others were also mapped by IPA to be constantly among the top pathways during the course of the infection, such as Differential regulation of cytokine production macrophages and T helper cells by IL17A and IL17F, the IL6, IL10, TNFR2, CD40, Toll-like receptor, and the TREM1 signaling pathways. Many of these pathways were clearly activated, as shown by a positive IPA z score (Table 2.4 and Supplementary Tables 2.S4-2.S6). Although these pathways were significantly over-represented at all infection time points, one was among the top-ranked pathways identified by IPA according to the RNA-seq fold-change values: Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation. This pathway, reported in Figure 6, not only reflects the importance of this activity at 8 hpi in JD(–) samples (Figure 2.6A), but also represents a top pathway observed at all other time points (Supplementary Tables 2.S4–2.S6).

72

Interestingly, lipid homeostasis pathways, including the PPAR signaling, LXR/RXR activation, and Hepatic cholestasis pathways, were challenged by MAP. Their high negative IPA z-score values suggest that the macrophages repress these pathways following MAP infection. Interestingly, ranking of the PPAR signaling and LXR/RXR activation pathways increased as the infection progress. The LXR/RXR activation pathway was in 39th, 35th, 12th, and 3rd position at 1, 4, 8, and 24 hpi respectively, suggesting an increasing impact on cholesterol efflux and lipogenesis pathways as MAP infection progressed. It is worth mentioning that when only down-regulated genes were considered, many significant pathways were associated with metabolism: amino acid degradation and biosynthesis (i.e. Valine degradation I, Glutaryl-CoA degradation, Tryptophan degradation III, Isoleucine degradation I, Mevalonate pathway I, Superpathway of serine and glycine biosynthesis I, and Folate transformations I) and lipid metabolism (Superpathway of cholesterol biosynthesis, Triacylglycerol biosynthesis, and Phospholipases). Some down-regulated genes were also significantly associated with oxidative stress response pathways (e.g. Superoxide radical degradation and NRF2-mediated oxidative stress response), while others activated the iNOS signaling pathway. The DNA damage response pathways (Role of BRCA1 in DNA damage response and Mismatch repair in eukaryotes) were also over-represented in down-regulated genes at the 4 hpi and 8 hpi time points (Supplementary Table 2.S7).

73

1 2

Table 2.4 Top 20 IPA pathways over-represented by DE genes at the 8-hpi time point in macrophages from JD(–) cows. Adj. 1 p-value 3.16E-11

Number of genes 43

3.16E-11

57

n.a.

IL10 signaling Atherosclerosis signaling TREM1 signaling IL6 signaling

3.98E-09 7.76E-09 2.24E-08 1.02E-07

23 31 23 28

n.a. n.a. 2.00 3.27

Production of nitric oxide and reactive oxygen species in macrophages

1.10E-07

36

2.00

Valine degradation I Role of IL17A in arthritis Virus entry via endocytic pathways TNFR2 signaling LXR/RXR activation Caveolar-mediated endocytosis signaling Death receptor signaling CD40 signaling Cholecystokinin/gastrin-mediated signaling PPAR signaling Toll-like receptor signaling IL12 signaling and production in macrophages

1.26E-07 2.57E-07 4.57E-07 4.68E-07 6.31E-07 6.46E-07 6.46E-07 6.76E-07 8.13E-07 8.32E-07 9.77E-07 9.77E-07

11 18 23 13 27 20 23 19 24 23 20 28

n.a. n.a. n.a. 1.90 −2.86 n.a. 1.04 0.00 2.04 −3.96 2.14 n.a.

Differential regulation of cytokine production in macrophages and T helper cells by IL17A and IL17F

1.00E-06

10

n.a.

Pathway Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis

3 4 5

2

z-score n.a.

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value IPA activation score (positive value means an activated pathway; negative value means an inhibited pathway; n.a., not available) 2

74

Table 2.S4 : Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes at 1hpi time point in macrophages from JD (–) cows. Pathways

Adj. pvalue 1

Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation

2,00E-14

22

n.a.

Differential Regulation of Cytokine Production in Macrophages and T Helper Cells by IL-17A and IL-17F

1,26E-11

9

n.a.

Differential Regulation of Cytokine Production in Intestinal Epithelial Cells by IL-17A and IL-17F TREM1 Signaling Atherosclerosis Signaling Dendritic Cell Maturation IL-10 Signaling Communication between Innate and Adaptive Immune Cells Toll-like Receptor Signaling TNFR2 Signaling Role of Macrophages, Fibroblasts and Endothelial Cells in Rheumatoid Arthritis Granulocyte Adhesion and Diapedesis Glucocorticoid Receptor Signaling Agranulocyte Adhesion and Diapedesis IL-17A Signaling in Fibroblasts Altered T Cell and B Cell Signaling in Rheumatoid Arthritis IL-6 Signaling Role of IL-17A in Arthritis Role of Pattern Recognition Receptors in Recognition of Bacteria and Viruses Crosstalk between Dendritic Cells and Natural Killer Cells HMGB1 Signaling MIF Regulation of Innate Immunity Role of Hypercytokinemia/hyperchemokinemia in the Pathogenesis of Influenza iNOS Signaling CD40 Signaling Production of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in Macrophages PPAR Signaling TNFR1 Signaling Hepatic Cholestasis Role of Cytokines in Mediating Communication between Immune Cells

1,17E-10 1,17E-10 3,98E-10 5,50E-10 8,13E-09 9,33E-09 1,62E-08 1,95E-08 1,95E-08 2,75E-08 3,47E-08 5,75E-08 6,31E-08 6,31E-08 9,77E-08 1,12E-07 2,29E-07 7,41E-07 1,26E-06 3,98E-06 6,03E-06 6,03E-06 6,61E-06 8,51E-06 1,05E-05 1,10E-05 1,86E-05 2,24E-05

9 13 15 17 11 12 11 8 19 15 18 15 8 11 12 9 12 10 11 7 7 7 8 12 9 7 11 7

n.a. n.a. n.a. 2,18 n.a. n.a. 1,89 1,63 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 2,31 n.a. 2,65 n.a. 3,32 1,89 n.a. 2,45 0,38 2,89 -3,00 1,63 n.a. n.a.

1 2

Number z-score 2 of genes

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

75

Table 2.S5: Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes at 4hpi time point in macrophages from JD (–) cows. Pathways Role of Macrophages, Fibroblasts and Endothelial Cells in Rheumatoid Arthritis Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation IL-10 Signaling TREM1 Signaling IL-6 Signaling TNFR2 Signaling Altered T Cell and B Cell Signaling in Rheumatoid Arthritis Dendritic Cell Maturation Role of IL-17A in Arthritis Differential Regulation of Cytokine Production in Macrophages and T Helper Cells by IL-17A and IL-17F Differential Regulation of Cytokine Production in Intestinal Epithelial Cells by IL-17A and IL-17F CD40 Signaling Granulocyte Adhesion and Diapedesis Toll-like Receptor Signaling IL-12 Signaling and Production in Macrophages Communication between Innate and Adaptive Immune Cells Agranulocyte Adhesion and Diapedesis Role of Osteoblasts, Osteoclasts and Chondrocytes in Rheumatoid Arthritis Atherosclerosis Signaling PPAR Signaling Role of Pattern Recognition Receptors in Recognition of Bacteria and Viruses NF-κB Signaling Role of Hypercytokinemia/hyperchemokinemia in the Pathogenesis of Influenza iNOS Signaling Hepatic Cholestasis TNFR1 Signaling Production of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in Macrophages TWEAK Signaling Acute Phase Response Signaling Crosstalk between Dendritic Cells and Natural Killer Cells 1 The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value 2

Adj. Number z-score 2 p-value 1 of genes 1,0E-14

48

n.a.

1,6E-14 6,3E-13 5,0E-12 2,0E-11 9,3E-10 9,3E-10 2,3E-09 5,5E-09

37 22 22 26 13 21 29 16

n.a. n.a. 2,24 3,40 1,90 n.a. 3,40 n.a.

8,7E-09

10

n.a.

8,7E-09

11

n.a.

8,7E-09 8,7E-09 8,9E-09 8,9E-09 2,6E-08 2,6E-08

17 28 18 24 19 28

0,50 n.a. 2,50 n.a. n.a. n.a.

4,2E-08

30

n.a.

4,7E-08 5,8E-08

22 19

n.a. -3,90

5,8E-08

22

2,50

5,8E-08

26

1,80

1,2E-07

13

n.a.

1,2E-07 2,8E-07 4,8E-07

13 24 13

2,31 n.a. 1,73

4,8E-07

25

1,80

5,4E-07 5,5E-07 6,5E-07

11 24 17

0,30 2,40 n.a.

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

76

Table 2.S6: Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes at 24hpi time point in macrophages from JD(–) cows. Pathways Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation Atherosclerosis Signaling LXR/RXR Activation Granulocyte Adhesion and Diapedesis Superpathway of Geranylgeranyldiphosphate Biosynthesis I (via Mevalonate) Role of Macrophages, Fibroblasts and Endothelial Cells in Rheumatoid Arthritis Differential Regulation of Cytokine Production in Intestinal Epithelial Cells by IL-17A and IL-17F IL-10 Signaling Differential Regulation of Cytokine Production in Macrophages and T Helper Cells by IL-17A and IL-17F Spermine and Spermidine Degradation I Agranulocyte Adhesion and Diapedesis TREM1 Signaling PPAR Signaling Virus Entry via Endocytic Pathways Hepatic Cholestasis IL-6 Signaling Role of Tissue Factor in Cancer Leukocyte Extravasation Signaling Role of Osteoblasts, Osteoclasts and Chondrocytes in Rheumatoid Arthritis Folate Transformations I Ceramide Degradation Zymosterol Biosynthesis Caveolar-mediated Endocytosis Signaling Altered T Cell and B Cell Signaling in Rheumatoid Arthritis LPS/IL-1 Mediated Inhibition of RXR Function HMGB1 Signaling Induction of Apoptosis by HIV1 Communication between Innate and Adaptive Immune Cells TWEAK Signaling Acute Phase Response Signaling 1 The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value 2

Adj. Number z-score 2 1 p-value of genes 2,63E-09 4,07E-09 5,62E-09 5,62E-09

38 30 29 36

n.a. n.a. -2,29 n.a.

6,31E-09

4

n.a.

1,02E-08

48

n.a.

8,91E-08

12

n.a.

4,68E-07

19

n.a.

7,41E-07

10

n.a.

7,41E-07 7,41E-07 8,13E-06 1,17E-05 2,00E-05 2,00E-05 2,14E-05 3,24E-05 3,31E-05

2 33 18 20 19 27 22 21 30

n.a. n.a. n.a. -3,58 n.a. n.a. 2,40 n.a. 0,85

3,31E-05

32

n.a.

5,01E-05 5,01E-05 5,01E-05 5,01E-05 5,01E-05 6,31E-05 8,91E-05 1,05E-04 1,95E-04 2,29E-04 2,29E-04

6 3 2 16 18 31 21 14 17 10 25

n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 1,27 1,53 1,39 n.a. 0,63 1,96

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

77

Figure 2.5 IPA second most enriched pathway by DE genes at 8hpi compared to controls in JD(-) macrophages: Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis pathway. Shades of green represent the RNA-seq upregulation fold-change values, and shades of red represent the down-regulation fold-change values of MAP infected macrophages.

78

Figure 2.6 Early signaling events in hepatic stellate cells (also known as fat storing cells) in primary MDM: the IPA top-ranked “Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation” pathway at 8h after MAP infection of macrophages from JD(–) cows compared to controls (A) and between the uninfected macrophages from Johne’s disease positive and negative cows, i.e. CTL samples (B), and at 8 hpi with MAP (C). Shades of green represent gene expression up-regulation (fold-change), and shades of red represent the down-regulation.

79

Table 2.S7 : IPA pathways over-represented by down-regulated DE genes in macrophages from JD(−) cows following MAP infection compared to uninfected macrophages (CTL). Pathways

Adj. p-value 1

Number z-score 2 of genes

Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation Intrinsic Prothrombin Activation Pathway NRF2-mediated Oxidative Stress Response

4,07E-05 2,29E-03 1,35E-02

8 3 5

n.a. n.a. -0,816

Role of BRCA1 in DNA Damage Response

5,13E-03

8

n.a.

Mismatch Repair in Eukaryotes Hereditary Breast Cancer Signaling

1,86E-02 2,69E-02

4 9

n.a. n.a.

Valine Degradation I Glutaryl-CoA Degradation Tryptophan Degradation III (Eukaryotic) Isoleucine Degradation I Mevalonate Pathway I Superpathway of Serine and Glycine Biosynthesis I Folate Transformations I Geranylgeranyldiphosphate Biosynthesis I (via Mevalonate) Ketolysis 24hpi Tryptophan Degradation III (Eukaryotic) Valine Degradation I Isoleucine Degradation I Triacylglycerol Biosynthesis phagosome formation NRF2-mediated Oxidative Stress Response Eicosanoid Signaling EIF2 Signaling Atherosclerosis Signaling Glutaryl-CoA Degradation

4,79E-04 4,79E-04 1,70E-03 1,70E-03 1,45E-02 3,09E-02 3,47E-02 4,79E-02 5,00E-02

7 6 6 6 4 3 4 4 3

n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

3,89E-06 8,13E-06 9,55E-06 5,01E-05 3,80E-03 4,90E-03 6,31E-03 1,05E-02 1,58E-02 3,55E-02

7 6 6 5 10 11 6 15 11 7

n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. -0,816 n.a. -2,646 n.a. n.a.

1hpi

4hpi

8hpi

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value

2

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

80

2.4.3.5.2

Functional analysis of DE genes in in vitro MAP infection in JD(+) cows

Because there was few DE genes detected (Table 2.2), no marked difference for macrophages from JD(+) infected macrophages was observed except for eight significantly affected pathways at 4hpi (Supplementary Table 2.S8). According to IPA, the only upregulated gene, PTX3 (Table 2.2), was involved in a pathway called Role of pattern recognition receptors in recognition of bacteria and viruses (p = 0.006). At 4 hpi, a high proportion of collagen chain genes was found among the 31 down-regulated genes in JD(+) macrophages and contributed to enriching four pathways: Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation (top-ranked), Intrinsic prothrombin activation, Atherosclerosis, and Dendritic cell maturation. Network map analysis also suggested that MAP-infected macrophage activities intersect with the Cellular assembly and organization and Cellular function and maintenance networks (Supplementary Table 2.S9-2.S11).

Table 2.S8 : IPA pathways over-represented by DEG at 4hpi time point compared to CTL in MDM from JD (+) cows. Adj. pvalue 1

Number of genes

z-score

Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation

9,77E-07

7

n.a

Intrinsic Prothrombin Activation Pathway

5,37E-04

3

n.a

Atherosclerosis Signaling

2,29E-02

3

n.a

Cellular Effects of Sildenafil (Viagra)

2,29E-02

3

n.a

RhoGDI Signaling

3,72E-02

3

n.a

Dendritic Cell Maturation

3,72E-02

3

n.a

ILK Signaling

3,72E-02

3

n.a

Integrin Signaling

4,07E-02

3

n.a

Pathways

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value

2

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

2

81

Table Topnetworks networksofofthe theIPA IPAanalysis analysis over-represented all DE genes following Table2.S9 S12 :: Top over-represented by by all DE genes followingininfection in JD(−) andJD between status time points. infection JD(–) MDM andMDM between status JD time points.

JD status (+/–) in CTL

JD(–) 24hpi / CTL

JD(–) 8hpi / CTL

JD(–) 4hpi / CTL

JD(–) 1hpi / CTL

Networks Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Cancer, Connective Tissue Disorders, Organismal Injury and Abnormalities Cancer, Organismal Injury and Abnormalities, Cellular Development Amino Acid Metabolism, Post-Translational Modification, Small Molecule Biochemistry Organismal Injury and Abnormalities, Cell Morphology, Hematological System Development and Function Cellular Development, Hematological System Development and Function, Hematopoiesis Cell Death and Survival, Cardiovascular Disease, Developmental Disorder DNA Replication, Recombination, and Repair, Cell Cycle, Cancer Cellular Movement, Immune Cell Trafficking, Cell-To-Cell Signaling and Interaction Cellular Development, Cellular Growth and Proliferation, Hematological System Development and Function Amino Acid Metabolism, Developmental Disorder, Hereditary Disorder Cell Death and Survival, Inflammatory Response, Cellmediated Immune Response Cancer, Gastrointestinal Disease, Hepatic System Disease Embryonic Development, Lymphoid Tissue Structure and Development, Organ Development Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry, Carbohydrate Metabolism Gene Expression, Protein Synthesis, Molecular Transport Connective Tissue Disorders, Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance Cardiovascular Disease, Developmental Disorder, Hematological Disease Cancer, Cellular Development, Organismal Injury and Abnormalities Embryonic Development, Organ Development, Organismal Development Amino Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Vitamin and Mineral Metabolism Cellular Growth and Proliferation, Hematological System Development and Function, Hematopoiesis Hair and Skin Development and Function, Embryonic Development, Organ Development

Score1

Focus M olecules

35

21

31

19

24

16

24

16

22

15

43

31

41

30

34

27

34

27

32

26

41

33

41

33

41

33

41

33

38

32

42

33

42

33

38

31

38

31

36

30

43

31

34

27

34

27

82

JD status (+/–) in JD status (+/–) in CTL 1hpi JD status (+/–) in 8hpi JD status (+/–) in 4hpi JD status (+/–) in 24hpi 1

Amino Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Vitamin and Mineral Metabolism Cellular Growth and Proliferation, Hematological System Development and Function, Hematopoiesis Hair and Skin Development and Function, Embryonic Development, Organ Development Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Digestive System Development and Function Post-Translational Modification, Cell Cycle, DNA Replication, Recombination, and Repair Dermatological Diseases and Conditions, Inflammatory Disease, Skeletal and Muscular Disorders Cellular Movement, Cancer, Gastrointestinal Disease Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance, Tissue Development Cellular Movement, Cancer, Organismal Injury and Abnormalities Gastrointestinal Disease, Hepatic System Disease, Liver Cholestasis Developmental Disorder, Hereditary Disorder, Metabolic Disease Cellular Function and Maintenance, Cellular Movement, Hematological System Development and Function Antimicrobial Response, Inflammatory Response, PostTranslational Modification Cardiovascular System Development and Function, Organismal Development, Cardiovascular Disease DNA Replication, Recombination, and Repair, Cancer, Organismal Injury and Abnormalities Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry, Drug Metabolism Cell Death and Survival, Cancer, Organismal Injury and Abnormalities Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Movement, Hematological System Development and Function Tissue Development, Dermatological Diseases and Conditions, Cell-To-Cell Signaling and Interaction Cell-mediated Immune Response, Cellular Movement, Hematological System Development and Function Developmental Disorder, Hereditary Disorder, Skeletal and Muscular Disorders Cellular Movement, Immune Cell Trafficking, Tissue Morphology Endocrine System Disorders, Gastrointestinal Disease, Metabolic Disease Energy Production, Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry Cell Morphology, Connective Tissue Development and Function, Cancer

43

31

34

27

34

27

34

27

34

27

40

24

40

24

35

22

33

21

33

21

51

31

44

28

37

25

30

22

30

22

31

25

31

25

30

24

30

24

28

23

44

30

33

25

33

25

31

24

31

24

Network score calculated using p-value of individual genes (score = -log(p-value))

83

Table S13 :: Top over-represented by by up-regulated DE DE genes Table 2.S10 Topnetworks networksofofthe theIPA IPAanalysis analysis over-represented up-regulated genes following infection in JD(−) MDM and between JD status time points. following infection in JD(–) MDM and between JD status time points.

JD(–) 24hpi / CTL

JD(–) 8hpi / CTL

JD(–) 4hpi / CTL

JD(–) 1hpi / CTL

Networks Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Cell Signaling, Organismal Injury and Abnormalities, Protein Synthesis Hematological System Development and Function, Tissue Morphology, Cell Death and Survival Cellular Development, Hematological System Development and Function, Hematopoiesis Carbohydrate Metabolism, Drug Metabolism, Small Molecule Biochemistry Hematological System Development and Function, Tissue Morphology, Cellular Development Cell Death and Survival, Cellular Movement, Hematological System Development and Function Infectious Diseases, Cell Death and Survival, Gastrointestinal Disease Inflammatory Response, Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Inflammatory Disease Gene Expression, Organismal Injury and Abnormalities, Cellular Development Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Carbohydrate Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry Infectious Diseases, Cell Death and Survival, Embryonic Development Carbohydrate Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Skeletal and Muscular System Development and Function Hematological System Development and Function, Humoral Immune Response, Tissue Morphology Cancer, Hematological Disease, Immunological Disease Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Cancer, Endocrine System Disorders, Gastrointestinal Disease Hematological System Development and Function, Tissue Morphology, Humoral Immune Response Cell Death and Survival, Cellular Movement, Hematological System Development and Function

Score1

Focus M olecules

38

21

36

20

24

15

22

14

20

13

42

28

42

28

35

25

33

24

31

23

53

34

40

29

40

29

38

28

36

27

33

25

33

25

29

23

29

23

29

23

84

JD status (+/–) in 1hpi JD status (+/–) in CTL JD status (+/–) in 4hpi JD status (+/–) in 8hpi JD status (+/–) in 24hpi 1

Dermatological Diseases and Conditions, Inflammatory Disease, Skeletal and Muscular Disorders Cardiac Hypertrophy, Cardiovascular Disease, Developmental Disorder Cellular Movement, Organismal Functions, Organismal Injury and Abnormalities Cancer, Connective Tissue Disorders, Organismal Injury and Abnormalities Cell Cycle, Cellular Assembly and Organization, DNA Replication, Recombination, and Repair Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance, Cellular Movement Connective Tissue Disorders, Cancer, Organismal Injury and Abnormalities Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance, Tissue Development Cell Death and Survival, Amino Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry Nucleic Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Cell-ToCell Signaling and Interaction Cell Cycle, DNA Replication, Recombination, and Repair, Cardiovascular Disease Embryonic Development, Lymphoid Tissue Structure and Development, Organ Development

47

30

47

30

40

27

35

25

31

23

39

23

37

22

34

21

28

18

28

18

45

26

38

23

Developmental Disorder, Hereditary Disorder, Metabolic Disease

36

22

Cardiovascular Disease, Cellular Compromise, Cellular Function and Maintenance

33

21

Cardiac Arrythmia, Cardiovascular Disease, Hereditary Disorder

33

21

Cancer, Neurological Disease, Organismal Injury and Abnormalities

52

31

Cell Cycle, DNA Replication, Recombination, and Repair, Cancer

33

23

Cancer, Organismal Injury and Abnormalities, Cellular Movement Cell Morphology, Connective Tissue Development and Function, Skeletal and Muscular System Development and Function Embryonic Development, Organ Development, Organ Morphology

33

23

31

22

29

21

Energy Production, Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry

38

24

38

24

36

23

36

23

29

20

Cellular Assembly and Organization, Cardiovascular Disease, Hereditary Disorder Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Vitamin and Mineral Metabolism Neurological Disease, Embryonic Development, Organ Development Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance, Tissue Development

Network score calculated using p-value of individual genes (score = -log(p-value))

85

Table : Top networks of the analysis over-represented by down-regulated DE Table2.S11 S14 : Top networks of the IPAIPA analysis over-represented by down-regulated DE genes genes following infection JD(–) and MDM and between status time points. following infection in JD(−)inMDM between JD statusJD time points. Score1

Focus M olecules

31

17

28

16

19

12

2

1

59

35

55

34

19

17

17

16

17

16

46

35

46

35

46

35

46

35

Cellular Movement, Tissue Development, Cell Morphology

25

25

Amino Acid Metabolism, Drug Metabolism, Molecular Transport Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Movement, Hematological System Development and Function Energy Production, Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Vitamin and Mineral Metabolism Cellular Assembly and Organization, Tissue Development, Cellular Growth and Proliferation Lipid Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Molecular Transport Cancer, Organismal Injury and Abnormalities, Reproductive System Disease

49

35

49

35

49

35

49

35

49

35

60

35

19

17

19

17

Carbohydrate Metabolism, Cancer, Cell Death and Survival Hematological Disease, Cell Morphology, Cellular Assembly and Organization

19

17

18

16

JD status (+/–) in CTL

JD(–) 24hpi / CTL

JD(–) 8hpi / CTL

JD(–) 4hpi / CTL

JD(–) 1hpi / CTL

Networks Connective Tissue Disorders, Cancer, Organismal Injury and Abnormalities Cellular Growth and Proliferation, Cell Cycle, Cell-To-Cell Signaling and Interaction Cellular Movement, Immune Cell Trafficking, Cell-To-Cell Signaling and Interaction DNA Replication, Recombination, and Repair, Cell Cycle, Cellular Assembly and Organization Dermatological Diseases and Conditions, Inflammatory Disease, Skeletal and Muscular Disorders DNA Replication, Recombination, and Repair, Cell Cycle, Cancer Molecular Transport, Cellular Movement, Reproductive System Development and Function Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Cell Death and Survival Carbohydrate Metabolism, Protein Synthesis, Lipid Metabolism Dermatological Diseases and Conditions, Inflammatory Disease, Skeletal and Muscular Disorders Energy Production, Lipid Metabolism, Small Molecule Biochemistry Hematological System Development and Function, Tissue Morphology, Embryonic Development Cardiovascular System Development and Function, Amino Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry

86

JD status (+/–) in 1hpi JD status (+/–) in 4hpi JD status (+/–) in 8hpi JD status (+/–) in 24hpi 1

Cell Death and Survival, Inflammatory Disease, Inflammatory Response Cell Death and Survival, Gastrointestinal Disease, Hepatic System Disease Carbohydrate Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry Nutritional Disease, Organismal Injury and Abnormalities, Skeletal and Muscular Disorders Cancer, Cellular Function and Maintenance, Hematological Disease Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Inflammatory Response, Cellular Movement, Immune Cell Trafficking Cell Morphology, Neurological Disease, Cell Death and Survival Carbohydrate Metabolism, Small Molecule Biochemistry, Cellular Movement Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Assembly and Organization, Cellular Function and Maintenance Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Cellular Growth and Proliferation, Connective Tissue Development and Function Cellular Movement, Immune Cell Trafficking, Inflammatory Response Inflammatory Response, Cellular Movement, Immune Cell Trafficking Inflammatory Response, Hematological System Development and Function, Tissue Morphology Drug Metabolism, Nucleic Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking Inflammatory Response, Hematological System Development and Function, Tissue Morphology Cellular Growth and Proliferation, Carbohydrate Metabolism, Inflammatory Response Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking

25

13

20

11

2

1

2

1

2

1

65

35

65

35

53

31

16

14

13

12

57

35

57

35

57

35

57

35

17

16

57

35

57

35

57

35

57

35

23

20

Network score calculated using p-value of individual genes (score = -log(p-value))

87

2.4.3.5.3

Functional analysis of DE genes in uninfected macrophages from different

JD status

To identify canonical pathways and network maps that differentiate the basal transcriptome activity from JD(+) and JD(−) cows, the 868 DE genes in the uninfected CTL macrophages (Figure 2.4C) were analyzed by IPA. Interestingly, the canonical pathways showed similarities with the one identified for JD(−) macrophages in response to MAP infection. Whereas no pathway was found to be significant using down-regulated genes alone, a clear effect of JD status [i.e. JD(+) versus JD(−)] was observed using all DE genes for the functional analysis. The list of the top 20 affected pathways is shown in Table 2.5. The profile of Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation in the uninfected JD(+)/JD(–) macrophages (Figure 2.6B) was highly similar to the profile observed for the MAP-infected vs uninfected JD(−) macrophages (Figure 2.6A). The genes that were down-regulated following MAP infection in JD(−) macrophages were upregulated in uninfected JD(+) macrophages compared to JD(−) samples, or vice-versa. The Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis was top-ranked for the comparison of uninfected JD(+)/JD(–) macrophages (Table 2.5). The immune IL6 and NFκB signaling, and Dendritic cell maturation pathways were also activated (positive IPA z-score) in uninfected JD(+) macrophages relative to the situation observed in uninfected JD(–) macrophages. The Mitochondrial dysfunction and chronic diseases related pathways, such as the Role of macrophages in rheumatoid arthritis, Atherosclerosis signaling, and Multiple sclerosis pathogenesis pathways, were identified. Lipid metabolism pathways like LXR/RXR activation and Superpathway of cholesterol biosynthesis were also significantly enriched by DE genes in control sample from JD(+) compared to JD(–) cows. Notably, the LXR/RXR activation pathway, which ranked the 6th most enriched pathway position, brings together a large number of DE genes (Figure 2.7). Additionally, the top-ranked network using down-regulated genes was Lipid metabolism, molecular transport, and small molecule biochemistry (Supplementary Table 2.S11).

88

1 2

Table 2.5: Top 20 IPA pathways over-represented by DE genes in macrophages from JD(+) compared to JD(–) cows at the control (CTL) time point. Pathway Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation Semaphorin signaling in neurons Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells in rheumatoid arthritis Granulocyte adhesion and diapedesis Inhibition of matrix metalloproteases LXR/RXR activation Axonal guidance signaling Role of tissue factor in cancer Acute phase response signaling ILK signaling Agranulocyte adhesion and diapedesis Colorectal cancer metastasis signaling HMGB1 signaling Intrinsic prothrombin activation pathway Atherosclerosis signaling TREM1 signaling IL6 signaling Ephrin receptor signaling Role of osteoblasts, osteoclasts and chondrocytes in rheumatoid arthritis Differential regulation of cytokine production in intestinal epithelial cells by IL17A and IL17F

3 4 5

Adj. 1 p-value 7.94E-14 2.45E-05

Number of genes 37 13

z-score2

4.57E-05

32

n.a.

2.45E-04 1.55E-03 1.66E-03 1.66E-03 1.70E-03 2.24E-03 2.40E-03 2.69E-03 2.69E-03 2.88E-03 3.63E-03 3.63E-03 4.90E-03 4.90E-03 4.90E-03

22 9 16 36 15 19 20 20 23 15 7 15 11 14 18

n.a. n.a. −0.58 n.a. n.a. 2.18 2.52 n.a. 2.13 1.07 n.a. n.a. n.a. 2.14 n.a.

4.90E-03

21

n.a.

5.01E-03

6

n.a.

n.a. n.a.

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value IPA activation score (positive value means an activated pathway; negative value means an inhibited pathway; n.a., not available) 2

89

Figure 2.7 IPA LXR/RXR activation pathway significantly enriched by DE genes. Shades of red represent inhibited genes of the pathway in uninfected CTL macrophages from JD(+) compared to JD(–) cows, while shades of green represent upregulated genes as reported by the RNA-seq anlaysis.

90

2.4.3.5.4

Functional analysis of DE genes in MAP-infected macrophages from

different JD status

The canonical pathways identified for the comparisons between JD(+) and JD(−) macrophages at each infection time point showed similarities to the response observed using DE genes of in vitro infection in JD(−). At 1 hpi, few pathways were identified using the 221 DE genes. Whereas the already mentioned Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation pathway still ranked first, the Inhibition of matrix metalloproteinases ranked second among the 12 significant pathways (Supplementary Table 2.S12). The position of many pathways related to cholesterol biosynthesis, including important regulators of fatty acid (e.g. LXR/RXR activation and PPAR signaling), increased as the infection progressed to 24 hpi. The top-ranked pathway remained the Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation pathway at 4h, 8h, and 24h post-infection. It is followed by Role of macrophages in rheumatoid arthritis and other chronic disease–related pathways, and the IL17A/IL10/IL6 signaling pathways. The top pathways associated with JD(+) vs. JD(−) macrophages at 8 hpi are shown in Table 2.6. The DE genes at 8hpi had a major influenced on the Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation pathway (Figure 2.6C). These pathways are representative of those found at 4 hpi (Supplementary Table 2.S13) or at 24 hpi (Supplementary Table 2.S14) and of those found in JD(−) macrophages experimentally challenged with MAP (Table 2.4 and Supplementary Tables 2.S4-2.S6).

91

Table 2.S12: Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes between macrophages from JD(–) cows compared to macrophages from JD(+)cows at 1hpi. Pathways

Adj. p-value 1

Number of genes

z-score 2

Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation

2,51E-12

22

NaN

Inhibition of Matrix Metalloproteases

1,32E-04

7

NaN

ILK Signaling

1,02E-03

12

2,71

Intrinsic Prothrombin Activation Pathway

3,16E-03

5

NaN

Role of Tissue Factor in Cancer

8,13E-03

8

NaN

Atherosclerosis Signaling

1,55E-02

8

NaN

Caveolar-mediated Endocytosis Signaling

1,82E-02

6

NaN

Guanosine Nucleotides Degradation III Urate Biosynthesis/Inosine 5'-phosphate Degradation

2,45E-02

3

NaN

2,45E-02

3

NaN

Semaphorin Signaling in Neurons

2,45E-02

5

NaN

Adenosine Nucleotides Degradation II

4,07E-02

3

NaN

PCP pathway

4,27E-02

5

NaN

Purine Nucleotides Degradation II (Aerobic)

5,62E-02

3

NaN

Axonal Guidance Signaling

5,75E-02

14

NaN

Agranulocyte Adhesion and Diapedesis

9,12E-02

8

NaN

Integrin Signaling

1,24E-01

8

2,65

Glioma Invasiveness Signaling

1,27E-01

4

1,00

Virus Entry via Endocytic Pathways

1,27E-01

5

NaN

Oncostatin M Signaling

1,49E-01

3

NaN

Inhibition of Angiogenesis by TSP1

1,49E-01

3

NaN

IGF-1 Signaling

1,49E-01

5

NaN

Granulocyte Adhesion and Diapedesis

1,49E-01

7

NaN

Calcium Signaling

1,49E-01

7

NaN

HIF1α Signaling

1,57E-01

5

NaN

Aryl Hydrocarbon Receptor Signaling

1,57E-01

6

NaN

Macropinocytosis Signaling

1,61E-01

4

NaN

Epithelial Adherens Junction Signaling

1,70E-01

6

NaN

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value

2

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

92

1 2

3 4 5

Table 2.6: Top 20 IPA pathways over-represented by DE genes in macrophages from JD(+) compared to JD(–) cows at the 8hpi time point. Adj. Number 2 Pathways z-score 1 p-value of genes Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation 1.26E-14 36 n.a. Role of macrophages, fibroblasts and endothelial cells 6.31E-11 40 n.a. in rheumatoid arthritis Differential regulation of cytokine production in macrophages and T helper cells by IL17A and IL17F

1.00E-08

10

n.a.

Differential regulation of cytokine production in intestinal epithelial cells by IL17A and IL17F

1.00E-08

11

n.a.

Role of osteoblasts, osteoclasts and chondrocytes in rheumatoid arthritis

1.66E-08

30

n.a.

Atherosclerosis signaling IL10 signaling TNFR2 signaling PPAR signaling Agranulocyte adhesion and diapedesis Granulocyte adhesion and diapedesis IL6 signaling HMGB1 signaling IL-12 Signaling and Production in Macrophages Dendritic Cell Maturation Acute Phase Response Signaling IL-17A Signaling in Fibroblasts TREM1 Signaling MIF Regulation of Innate Immunity LXR/RXR Activation

2.57E-08 7.76E-08 1.00E-07 1.95E-07 5.62E-07 6.03E-07 8.13E-07 1.32E-06 1.48E-06 2.00E-06 3.47E-06 5.75E-06 7.24E-06 2.51E-05 2.51E-05

22 16 11 18 25 24 19 19 20 23 22 10 14 10 17

n.a. n.a. −1.67 2.83 n.a. n.a. −2.36 −0.94 n.a. -1.71 -1.15 n.a. n.a. -0.63 3.00

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value IPA activation score (positive value means an activated pathway; negative value means an inhibited pathway; n.a., not available) 2

93

Table 2.S13 : Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes in macrophages from JD(–) cows compared to JD(+) macrophages at 4hpi.

1

Numbe z-score r of 2 genes

Pathways

Adj. p-value 1

Differential Regulation of Cytokine Production in Intestinal Epithelial Cells by IL-17A and IL-17F

6,61E-06

8

n.a.

Atherosclerosis Signaling

1,58E-05

15

n.a.

Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation Differential Regulation of Cytokine Production in Macrophages and T Helper Cells by IL-17A and IL-17F

7,08E-05

17

n.a.

1,45E-04

6

n.a.

TREM1 Signaling Role of Macrophages, Fibroblasts and Endothelial Cells in Rheumatoid Arthritis

3,80E-04

10

n.a.

5,25E-04

20

n.a.

HMGB1 Signaling

6,61E-04

12

-0,91

Granulocyte Adhesion and Diapedesis

1,66E-03

14

n.a.

Hematopoiesis from Pluripotent Stem Cells

2,69E-03

7

n.a.

Agranulocyte Adhesion and Diapedesis

2,69E-03

14

n.a.

IL-10 Signaling

3,89E-03

8

n.a.

Altered T Cell and B Cell Signaling in Rheumatoid Arthritis Role of Cytokines in Mediating Communication between Immune Cells

3,98E-03

9

n.a.

5,37E-03

7

n.a.

LXR/RXR Activation Role of Osteoblasts, Osteoclasts and Chondrocytes in Rheumatoid Arthritis Role of Hypercytokinemia/hyperchemokinemia in the Pathogenesis of Influenza

8,32E-03

10

2,12

8,32E-03

14

n.a.

8,51E-03

6

n.a.

Airway Pathology in Chronic Obstructive Pulmonary Disease

1,20E-02

3

n.a.

Ovarian Cancer Signaling

1,26E-02

10

n.a.

Colorectal Cancer Metastasis Signaling

1,41E-02

14

-0,91

IL-17A Signaling in Fibroblasts

1,74E-02

5

n.a.

Aryl Hydrocarbon Receptor Signaling

1,82E-02

10

n.a.

Acute Phase Response Signaling

2,09E-02

11

-0,63

VDR/RXR Activation Role of Pattern Recognition Receptors in Recognition of Bacteria and Viruses

2,57E-02

7

n.a.

2,82E-02

9

-1,34

Hematopoiesis from Multipotent Stem Cells

2,95E-02

3

n.a.

NRF2-mediated Oxidative Stress Response

2,95E-02

11

1,34

Isoleucine Degradation I

3,98E-02

3

n.a.

Colanic Acid Building Blocks Biosynthesis

3,98E-02

3

n.a.

Role of Tissue Factor in Cancer

3,98E-02

8

n.a.

Glucocorticoid Receptor Signaling

3,98E-02

14

n.a.

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value

2

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

94

Table 2.S14: Top 30 IPA pathways over-represented by DE genes in macrophages from JD(+) cows compared to JD(–) macrophages at 24hpi time point. Pathways

Adj. Numbe z-score p-value r of 2 1 genes

Hepatic Fibrosis / Hepatic Stellate Cell Activation

2,00E-13

33

n.a.

Superpathway of Cholesterol Biosynthesis Differential Regulation of Cytokine Production in Macrophages and T Helper Cells by IL-17A and IL-17F

1,58E-10

13

n.a.

5,01E-09

10

n.a.

Granulocyte Adhesion and Diapedesis Differential Regulation of Cytokine Production in Intestinal Epithelial Cells by IL-17A and IL-17F

4,47E-08

25

n.a.

6,76E-08

10

n.a.

Atherosclerosis Signaling

1,62E-07

20

n.a.

LXR/RXR Activation

4,90E-07

19

2,67

Agranulocyte Adhesion and Diapedesis

4,90E-07

24

n.a.

IL-10 Signaling Role of Macrophages, Fibroblasts and Endothelial Cells in Rheumatoid Arthritis Role of Osteoblasts, Osteoclasts and Chondrocytes in Rheumatoid Arthritis

1,05E-06

14

n.a.

1,05E-06

30

n.a.

1,38E-06

25

n.a.

Cholesterol Biosynthesis I

1,45E-06

7

n.a.

Cholesterol Biosynthesis II (via 24,25-dihydrolanosterol)

1,45E-06

7

n.a.

Cholesterol Biosynthesis III (via Desmosterol)

1,45E-06

7

n.a.

IL-17A Signaling in Fibroblasts

2,57E-06

10

n.a.

TNFR2 Signaling

4,90E-06

9

-1,13

LPS/IL-1 Mediated Inhibition of RXR Function

1,32E-05

23

-1,63

Acute Phase Response Signaling

4,68E-05

19

-1,21

Role of Tissue Factor in Cancer

4,79E-05

15

n.a.

IL-6 Signaling

8,91E-05

15

-2,67

Ketogenesis

1,48E-04

5

n.a.

PPAR Signaling Superpathway of Geranylgeranyldiphosphate Biosynthesis I (via Mevalonate)

1,70E-04

13

2,50

1,78E-04

6

n.a.

Hepatic Cholestasis

3,02E-04

17

n.a.

Induction of Apoptosis by HIV1

3,09E-04

10

-1,27

Glutaryl-CoA Degradation

3,47E-04

5

n.a.

April Mediated Signaling

3,47E-04

8

-1,41

TREM1 Signaling

3,72E-04

11

n.a.

Inhibition of Matrix Metalloproteases

3,89E-04

8

n.a.

ILK Signaling

4,17E-04

18

0,73

1

The Benjamini–Hochberg multiple testing adjusted p-value

2

IPA activation score (positive = pathway activation, negative = pathway inhibition)

1 95

2.4.3.6

qPCR and RNA expression comparison

To validate the top two pathways, namely Role of macrophages in rheumatoid arthritis (Figure 2.5) and Hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation (Figure 2.6), the chemokine ligand CCL2, also known as macrophage inhibitory factor (MIF-1), IL1A (IL 1α), IL10, and CSF3, also known as granulocyte macrophage CSF (GM-CSF), were quantified by qPCR using a larger cohort of JD(+) and JD(–) animals. All these genes were confirmed to be DE after MAP infection. They were also compared to the respective fold change obtained in RNA-seq analysis in Figure 2.8. In uninfected JD(−) macrophages, IL10, CCL2, CSF3, and IL1A were upregulated, with gene expression levels reaching respectively 4-, 18-, 70-, and 145-fold change at 8 hpi. In contrast, in JD(+) macrophages, no change in expression was detected for CCL2 (Figure 2.8A), and only slight changes in expression were observed for CSF3 (Figure 2.8B) and IL1A (Figure 2.8C). A similar pattern was found for IL10 (Figure 2.8D), with <2-fold change increase at 4 hpi and 8 hpi in JD(+) macrophages while a modest significant 3- and 5-fold increase was observed in JD(−) macrophages, respectively. As observed with the RNA-seq data from the analysis of the CTL samples, the steady-state expression level in the unchallenged macrophages of most of the genes tested in JD(+) was more elevated than for the JD(−) genes. This difference was confirmed for CCL2, CSF3, IL1A and IL10 using the normalized gene expression. Their respective basal expression levels in uninfected JD(+) macrophages were respectively 6-, 18-, 31- and 3-fold more abundant than in uninfected JD(−) macrophages. Although not shown in Figure 2.8, the other genes tested in qPCR also showed interesting results (Supplementary Figure 2.S1). The nitric oxide synthase 2 (NOS2) gene, a marker of the oxidative stress response pathways and associated with immune tolerance, was also part of the Role of macrophages in rheumatoid arthritis (Figure 2.5), HIF1α, ILK, and LXR/RXR activation pathways. NOS2 expression was largely upregulated after MAP infection, reaching a more than 40-fold increase at 8 hpi in JD(−) macrophages, which is even higher than the

96

increase measured by RNA-seq. As in the RNA-seq results, this gene was also less prone to respond to MAP infection (<5-fold change) in JD(+) macrophages. This pattern was also observed for hypoxia-inducible factor 1 sub-unit alpha (HIF1A), which is a marker of the HIF1α and ILK pathways. In RNA-seq, the stimulation of HIF1A in response to in vitro MAP infection was significantly lower and not biologically relevant in JD(+) macrophages (Supplementary Figure S1). The gene coding for indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO1), an enzyme involves in tryptophan catabolism that is part of the Tryptophan degradation III pathway, was confirmed DE in infected JD(−) macrophages. Again, although a strong increase was observed in JD(−) macrophages at both 4 hpi (35-foldchange) and 8 hpi (125fold change), the IDO1 response to MAP infection was not biologically relevant (fold-change < 2) for JD(+) macrophages as shown by the RNA-seq results. As for the other genes, the qPCR results reveals that IDO1 was also found to be highly upregulated in JD(+) controls compared to its JD(–) counterpart. Our RNA-seq expression data also indicated that some down-regulated genes, such as glutathione-disulfide reductase (GSR), enriched the NRF2-mediated oxidative stress response pathway. The down-regulation of GSR was however not found statistically significant by qPCR. This gene was also part of the Glutathione redox reactions I pathway, which include glutathione peroxidase (GPX) 3 and GPX4. Interestingly, in qPCR, GPX4 was confirmed to be down-regulated nearly 2-fold in response to MAP infection in JD(−) macrophages at both 4 hpi and 8 hpi, and its expression remained unaffected in JD(+) macrophages.

97

Figure 2.8 qPCR validation of DE genes for (A) CCL2, (B) CSF3, (C) IL1A, and (D) IL10. Results are reported for both the RNA-seq data and qPCR results. The fold-change (log2) values are given for the 4h or 8h MAP-infection samples compared respectively to the control samples. Analysis was performed for each group separately: Johnes disease (JD) negative and JD positive cows (left panels). The JD status effect is shown for the corresponding samples: uninfected CTL samples, the 4hpi time points, or the 8hpi time points from JD(+) compared to JD(–) cows (right panels). An asterisk indicates a statistical value less than 0.05 in each experiment. The dotted lines represent the biological significance threshold of 2 fold-change.

98

Figure 2.S1 qPCR validation of (A) IDO1, (B) HIF1A, (C) NOS2, (D) GSR and (E) GPX4 differential gene expression obtained in RNA-seq. The gene expression log2 (fold-change) values is presented for the ex vivo 4h and 8h MAP infection samples compared to uninfected samples and for the JD(+) compared to JD(–) samples at the control(CTL) and 4h and 8h MAP infection time points. An asterisk indicates a statistical value less than 0.05 in each experiment methodology. The dotted lines represent the biological significance threshold of 2 fold-changes used in this study. 99

2.4.3.7

Lipid accumulation assay

Since several pathways pointed into the direction of fatty acid metabolism (e.g. LXR/RXR activation and PPAR signaling), cholesterol biosynthesis, and to the hepatic stellate cell (also known as fat-storing cells), the accumulation of lipids in MAP-infected macrophages was monitored using a lipid Oil red-O staining assay. A representative result is shown in Figure 2.9. Microscopy analysis of uninfected macrophages from JD(+) cows cultured for 5 days in complete media revealed an increased level of stained lipid droplets compared to the level observed in JD(–) macrophages. In JD(+) macrophages, the staining levels were similar irrespectively to MAP infection treatment suggesting that JD(+) CTL macrophages already accumulated lipids even before being challenged in vitro. Furthermore, the accumulation of lipids in MAP infected macrophages from both JD(–) and JD(+) cows correlated with the presence of clusters as shown in lower 200× magnification (Figure 2.9A). Their granulomatous appearance suggests high endogenous lipid droplets clearly observed at the 400× magnification (Figure 2.9B) while very few lipid droplets were visible in untreated JD(– ) macrophages. The effect of the infection was only apparent for JD(–) macrophages. For the uninfected cells from JD(–) cows, the Oil red-O stain was mostly seen around the cells suggesting that cytoplasmic membrane was the main stained component. This contrasted to MAP infected macrophages where lipid droplets accumulated throughout the cytosol of most cells. Interestingly, some macrophages from JD(+) cows assumed the morphological appearance of foam cells with Oil red-O lipid droplets (Figure 2.9B, arrows). These larger cells shown a visual abundance of high concentration of lipid droplets grossly correlated with the morphological appearance of foam cells.

100

Figure 2.9 Lipid accumulation assay using Oil red-O staining. The staining is shown for macrophages from Johne’s disease negative (JD(–)) and positive (JD(+)) cows and for uninfected (CTL) or MAP-infected (5 days) experimental condition. The images were observed at (A) 200× magnification (scale bar = 200µm) and at (B) a 400× magnification (scale bar = 100µm). Arrows show macrophages with a classical foam cell morphology.

101

2.4.4 Discussion

2.4.4.1

Lipid homeostasis

Understanding the immune response of ruminants to MAP infection remains a challenge. Even though MAP belongs to the family Mycobacteriaceae and is classified under the nontuberculous group of bacilli, JD has many features of pathogenesis in common with tuberculosis, which is likewise caused by mycobacteria. In the case of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection, the metabolism of host cells is affected at the level of both lipid homeostasis and catabolic and anabolic pathways [92]. The importance of lipids derived from the host in mycobacterial pathogenesis at the host:pathogen interface has been identified for Mtb and recently also suggested for MAP [93]. In light of this, our results and the relevant literature on other mycobacterial diseases provide support for the role of host lipid metabolism in the pathogenicity of MAP. The highlight of this study is the importance of the “hepatic fibrosis / hepatic stellate cell activation” pathway in primary macrophages from JD(+) cows and also in macrophages from JD(−) cows in response to MAP infection (Figure 6). A priori, this pathway appears irrelevant for JD macrophages. Indeed, it has been extensively associated with human hepatic steatosis, liver injury, fibrosis, and non-alcoholic fatty liver disease. Nevertheless, these phenomena are also often related to macrophage infiltration and chronic inflammation (i.e. cirrhosis). Interestingly, stellate cells are also described as fatstoring cells [94]. The pro-fibrotic pattern observed in the hepatic fibrosis pathway, notably as a result of the induction of collagen polypeptides, was previously described for foam cells [95]. Our deep transcriptome sequencing analysis revealed that primary macrophages from JD(+) displayed a basal cellular metabolism affecting collagen polypeptides. The presence of foamy cells in our MAP-infected macrophage cultures showed similarities with the foamy macrophages reported from tuberculous patients’ granulomas [96]. It is less clear, however, how this steady state in JD(+)-exposed but uninfected primary macrophages affects the pathogenicity of MAP.

102

In JD(+) cows, the repression of the PPAR signaling and LXR/RXR activation pathways (negative IPA z score, Table 2.5) reveals mechanisms by which host immunity alters the microenvironment of macrophages. The LXR gene is responsible for the transcriptional control of many genes that regulate lipid uptake, efflux, and homeostasis [97]. Within this LXR/RXR activation pathway (Figure 2.7), the myosin regulatory light chain-interacting protein gene (MYLIP) was down-regulated in the MAP-infected macrophages and in the JD(+) CTL samples but not in the JD(−) CTL samples. A reduction in the ubiquitination of the LDL receptor by this enzyme might increase the cell-surface LDL receptor level, resulting in the increased lipid accumulation observed in JD(+) macrophages. By suppressing the downregulated nuclear receptor subfamily LXR gene (NR1H4) in JD(−) macrophages, MAP might reduce cholesterol efflux in a process termed reverse cholesterol transport. The ABC lipid transporter A3 is involved in the movement of cholesterol, lipid homeostasis, and inflammation [98]. In our study, ABCA3 was up-regulated in the infected JD(−) macrophages and remained elevated at the 24 hpi time point. The down-regulation of MYLIP and NR1H4, together with the increased expression of ABCA3, LDL and HDL related genes, induces sterol deposits in macrophages and points to premature inflammation that mimics atherosclerosis [99]. Lipid accumulation can also be induced by pentraxin 3 (PTX3) [100]. PTX3 was already up-regulated in the CTL macrophages from the JD(+) cows. In human macrophages, this proatherogenic protein promotes the uptake of oxidized LDL while inhibiting cholesterol efflux and decreasing the expression of both PPAR and LXR [100]. Although PTX3 was not associated with IPA PPAR and LXR/RXR pathways, the literature and our results suggest that PTX3 is part of the classic PPARγ-LXRα-ABC transporter pathway for metabolizing cholesterol. It is worthy of note that PTX3 was one of the top five up-regulated genes at almost all infection time points and it was the only up-regulated gene in the infected JD(+) macrophages. This finding is particularly interesting considering that MAP localizes to cholesterol-rich compartments in macrophages [32]. Our data suggest that macrophages can undergo a transformation that could lead to a foam-cell phenotype as a consequence of lipid and cholesterol uptake in MAP-infected macrophages. Given that cholesterol impairs

103

phagosome maturation [101] and that foamy macrophages constitute a nutrient-rich reservoir for Mtb [96], the basal cellular metabolism affecting lipid homeostasis in JD(+)-exposed but uninfected blood circulating monocytes would increase the bacterium’s survival and MAP persistence in JD cows.

2.4.4.2

Immune response

Relatively little is known about how MAP modulates the immune response so as to ensure that cell stimulation cannot orchestrate an effective humoral immune response. In unexposed JD(−) macrophages, MAP infection induced an acute immune response characterized by increased expression of genes that encode for cytokines, interleukins, and growth factors. The top DE genes with the highest up-regulation fold change included many interleukins (IL6, IL1A), chemokines (CCL8, CCL4, CCL20), and colony-stimulating factors (CSF2, CSF3). Pathways such as IL-10 signaling, IL6 signaling, NF kB signaling, acute phase response signaling, and differential regulation of cytokine production in macrophages and T helper cells by IL-17A and IL-17F showed strong regulation of immunity-related genes during early infection. Our results for MAP-infected JD(−) macrophages confirmed previous findings obtained by Casey et al. (2015) at 2 hpi but drastically differed from the 6 hpi time point in the same study [57]. Notably, the IL-10 signaling pathway ranked 149th at 6 hpi in that study, whereas, in ours, it was among the top regulated pathways for almost all infection time points. We observed a more consistent and continuous progression of the infection in terms of the number and composition of DE genes and their associated pathways. We can advance a plausible explanation for this difference, namely that frozen aliquots of MAP were used by those authors for in vitro infection, as opposed to the live MAP used in our study. The discrepancy between the 6 hpi time point found in Casey et al. [57] and in our study may be attributable to the fact that macrophages are better at removing dormant MAP pathogens. In our study, the IL-10 signaling pathway was still one of the top 10 pathways at 24 hpi, which is in agreement with another study identifying IL-10 signaling as a canonical pathway targeted by MAP to control the immune response [46]. We believe that our results adequately reflect

104

the initial events involving live and active MAP during the initial 24-h infection period. By mobilizing immunity-related genes, the host attempts to control the invading pathogen; however, MAP sustains the IL-10 signaling pathway, indicating that it also has an immunosuppressive effect. Interestingly, the basal transcriptomic level of the immunity-related genes was generally higher in JD(+) macrophages than in the unexposed JD(−) macrophages. How a systemic and chronic inflammation is established has not yet been determined. One additional piece of evidence may be the impact of the IL-17 on the chronic immune response. Recent studies report a higher blood protein level of IL-17 in naturally infected JD cows [45], in a bovine tuberculosis model [102], and in healthy human PBMCs in response to non-tuberculous mycobacteria [103-104]. These results suggest the involvement of another player in the classical Th1/Th2 infection response. We and other authors [57] found that the differential regulation of cytokine production in intestinal epithelial cells by IL17A and IL17F pathway was affected by MAP infection in JD(−) macrophages. This pathway ranked second as early as 1 hpi in response to MAP infection and was still among the top 10 pathways at the 24 hpi time point. In the last few years, several human autoimmune and inflammatory disorders, such as inflammatory bowel disease, rheumatoid arthritis, allergic asthma, and psoriasis [105-108], have been associated with IL17. The presence of this proinflammatory cytokine is persistent locally, causing dysfunction of the tissue. Interestingly, exposure to IL17A leads to the generation of lipid-rich foam cells [109]. As described above, this is also a phenotype that we observed in our lipid staining assay and our gene expression results. It is thus of interest that we identified those IL17-associated pathways in MAP-infected macrophages (e.g. role of macrophages, fibroblasts, and endothelial cells in rheumatoid arthritis, atherosclerosis signaling, and role of IL17A in arthritis pathways). The rheumatoid arthritis pathway was greatly impacted by MAP either by in vitro infection in the JD(−) macrophages but also by the JD status of cows when comparing the controls of both JD status groups. While the mechanisms triggering autoimmune disease are complex, it is well documented that lipoarabinomannan from MAP alters the inflammatory response by bovine macrophages and sustains the bacterium’s survival [110] which could induce the TLR cascade seen in the

105

pathway enriched in our analysis (Figure 2.5). It remains unknown whether MAP is actively driving Th17 differentiation, but evidence continues to mount for the involvement of MAP in those numerous human chronic diseases. Although many studies only focus on the immune genes, the intracellular metabolic pathways in immune cells, called immunometabolism, are attracting increasing interest in studies on clinical disease [111]. It was already shown that the metabolomics profile of experimentally infected calves is different from that of uninfected cows [51]. In JD(+) sheep, the expression of IDO1, which encodes a heme enzyme catalyzing the first and rate-limiting step in tryptophan catabolism, was significantly increased in the affected tissues, particularly at the site of primary infection [112]. Our results showed that IDO1 was drastically upregulated in the infected JD(−) macrophages and its expression was further increased as the infection progressed. However, the most striking observation was the elevated expression of this gene in control macrophages from JD(+) cows in the absence of any apparent infection. Depletion of local tryptophan stores in host macrophages by the IDO1 protein may not be detrimental to MAP since it synthesizes is own L-tryptophan. Thus, it appears that the increase in IDO1 benefits the pathogen through its immunosuppressive effects on host immune responses [113114]. A change of the homeostatic serum concentrations of several metabolites as a result of MAP infection was previously reported in experimentally infected calves [51]. In particular, significant variations in the amino acid concentrations of calf serum were observed. In our data, infection of JD(−) macrophages affected many metabolic processes. Indeed, downregulated genes targeted mainly metabolic processes, such as amino acid production, cholesterol biosynthesis, and mitochondrial dysfunction pathways (Supplementary Table 2.S11). Interestingly, the uninfected JD(+)-exposed macrophages showed a similar profile. The number of down-regulated metabolic functions was considerable. The top enriched IPA networks include: amino acid metabolism, small molecule biochemistry, vitamin and mineral metabolism, lipid metabolism, small molecule biochemistry, and digestive system development and function networks. These pathways suggest that JD induces long-lasting metabolic changes in macrophages, a shift also observed in the circulating blood metabolites

106

of experimentally infected calves [51]. This finding suggests that MAP can, for its own purposes, alter not only the circulating metabolite content, but also the metabolic functions of blood-circulating monocytes from a JD host. This further suggests that paratuberculosis modulates the immunometabolism status of the circulating monocytes and/or macrophages that are called on to become antigen-presenting cells in the peripheral tissues, thereby affecting their role as sentinels of the immune system.

2.4.4.3

Perspective of immune tolerance status

Macrophages, the most abundant intestinal mononuclear phagocytes, play a critical role in shaping immune responses. The response to MAP infection clearly differs depending on the JD status of cows. The PCA of the transcriptome summarizes this differential response of the macrophages (Figure 2.1). While in vitro MAP infection in JD(−) macrophages induced a defined pattern, JD(+) macrophages produced unexpected transcriptomic profiles. Their response was not orchestrated, and JD(+) samples showed an inconsistent pattern scattered irrespective of the infection time point. Our data suggest that circulating monocytes from JD(+) cows present a distinct functional outcome upon differentiation. The in situ impact of this pre-formatted status at the intestinal sites requires further study. Most of the studies on immune response following MAP infection used healthy animals that were artificially infected or exposed to MAP for a limited time through ileal cannulation surgery. In our study, the serum positive JD(+) cows were naturally infected and were excreting live MAP in their feces. As animals become infected early in life, it is believed that these infectious cows (> five years old) were exposed to MAP for a long time. The in vitro experiments using monocytes isolated from JD(−) and JD(+) cows and differentiated into macrophages using the same protocol were conducted in similar conditions including the same strain of MAP. There is no technical reason for the difference observed in the JD(+) macrophages. This is the first study to report a distinct transcriptomic profile for JD(+) exposed macrophages. Different hypotheses have been considered in an effort to explain these unexpected results. The JD(+) macrophages may be altered as a consequence of an immunometabolic disorder, as

107

described above. The relatively new concept of memory of the innate immune system has been considered as an alternative hypothesis. Although immune memory has classically been considered an exclusive trait of the adaptive immune system, a paradigm shift has revealed the existence of memory-type behavior in innate immune cells. The phenomena of trained immunity and tolerance are examples of such innate-type memory [115]. While trained immunity provides more effective protection upon restimulation, tolerance causes these cells to enter a long-term refractory state, such that they do not mount a pro-inflammatory response to subsequent stimulation [116]. Notably, chromatin structure and epigenetic modifications are crucial factors allowing such processes to occur and to be sustained. The tolerance immune response is known to be preferentially induced by pathogens or their ligands recognized by TLRs, while trained immunity is induced more by NOD-like receptor stimulation. Macrophages recognize MAP in part through their mannose receptors and TLR2 and TLR4. Interestingly, mycobacteria cell wall components like mannosylated lipoarabinomannan were previously found to induce tolerance in primary human macrophages [117]. This mycobacterial ligand present on MAP modulates bovine macrophage function by inducing rapid and prolonged IL-10 expression as well as transient expression of proinflammatory cytokine [118]. While the unexposed macrophages from JD(−) cows upregulated pro-inflammatory genes following MAP infection, the exposed macrophages from the JD(+) cows could not orchestrate coordinated gene expression in response to MAP infection. They remained recalcitrant to secondary contact with MAP. The tolerant-like status of those JD(+) macrophages was clearly observed in several genes (e.g. CCL2, IL-10 and IL1A). For example, IL-1A fold change between in vitro infected samples and control samples was 30 times lower in JD(+) macrophages than in JD(–) macrophages. Overall, these results highlight the non-responsiveness of JD(+) exposed macrophages to MAP restimulation. Altogether, they support the hypothesis that circulating monocytes from JD(+) cows are oriented toward an immune tolerance state, possibly because their exposure to virulence factors such mannosylated lipoarabinomannan facilitates JD progression. Whether or not an epigenetic imprint in blood-circulating monocytes remains to be elucidated, our results show

108

that primary JD(+)-exposed macrophages apparently acquire and maintain an unresponsive state even when re-exposed to the causative pathogen of host infection. In conclusion, our study highlights potential functional roles for genes that were not previously been implicated in the host response to infection with MAP bacilli. While some classical pro-inflammatory genes were found to enrich immune pathways, others were associated to lipid homeostasis and metabolism related pathways. Interestingly, similar pathways were also affected in uninfected macrophages isolated from cows with a longstanding JD infection. Moreover, the present study describes a deep transcriptomic survey of uninfected JD(+)-exposed macrophages which suggests that a pro-fibrotic pattern and a foamcell phenotype participate in chronic JD inflammation. Finally, our results suggest that bloodcirculating monocytes from JD(+) cows were already in a recalcitrant state similar to innate immune-memory tolerance-type behavior. Our findings raise many questions and highlight areas of opportunity for future research on this disease. The functional impact of the gene expression changes occurring at the protein and phenotypic levels should be investigated more thoroughly in follow-up studies. In order to identify the nature of the nonspecific effects of paratuberculosis on macrophages, researchers now clearly need to consider epigenetic programming and innate immune tolerance in their future investigations.

2.4.5 Conflict of interest statement The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

2.4.6 Author contributions NB designed the study. NB and GF supervised the animal diagnosis. NB supervised and OA performed the cell culture, qPCR and bioinformatics analysis. NB and OA analyzed the data and wrote the manuscript. NG and EIA contributed to the interpretation of the results. All

109

authors read and approved the final manuscript. NB was the principal investigator of the project.

2.4.7 Funding This study was funded by a Collaborative Research and Development grant from the Dairy Cattle Genetics Research and Development (DairyGen) Council of Canada, the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Project CRDPJ 441719), and Agri-Food and Agriculture Canada (Project AAFC J0000-79). Special thanks are due to the veterinarians and dairy farmers for their valuable collaboration.

2.4.8 Acknowledgements The authors are grateful to Pier-Luc Dudemaine for performing the cell culture and the preliminary analysis using the bioinformatics pipeline. We thank Catherine Thibault for building the cDNA libraries and Steve Méthot for performing statistical analysis of qPCR data. The authors wish to acknowledge Alexandre Montpetit from MUGQIC (Montréal, Canada) and Jean-François Lucier and Jules Gagnon of the Université de Sherbrooke (Sherbrooke, Canada) for providing bioinformatics services and support. We thank the staff of the Université de Sherbrooke Centre for Scientific Computing and Compute Canada for granting access to the MP2 high-performance computing cluster.

110

2.4.9 References 1. Tiwari, A., Vanleeuwen, J.A., Mckenna, S.L., Keefe, G.P., and Barkema, H.W. (2006). Johne's disease in Canada Part I: clinical symptoms, pathophysiology, diagnosis, and prevalence in dairy herds. Can Vet J. 47, 874-882. 2. Chiodini, R.J., Van Kruiningen, H.J., and Merkal, R.S. (1984). Ruminant paratuberculosis (Johne's disease): the current status and future prospects. Cornell Vet. 74, 218-262. 3. Beard, P.M., Daniels, M.J., Henderson, D., Pirie, A., Rudge, K., Buxton, D., et al. (2001). Paratuberculosis infection of nonruminant wildlife in Scotland. J Clin Microbiol. 39, 15171521. doi:10.1128/JCM.39.4.1517-1521.2001 4. Kennedy, D.J., and Benedictus, G. (2001). Control of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in agricultural species. Rev Sci Tech. 20, 151-179. 5. Clarke, C.J. (1997). The pathology and pathogenesis of paratuberculosis in ruminants and other species. J Comp Pathol. 116, 217-261. 6. Whitlock, R.H., and Buergelt, C. (1996). Preclinical and clinical manifestations of paratuberculosis (including pathology). Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12, 345-356. 7. Jubb, T.F., Sergeant, E.S., Callinan, A.P., and Galvin, J. (2004). Estimate of the sensitivity of an ELISA used to detect Johne's disease in Victorian dairy cattle herds. Aust Vet J. 82, 569573. 8. Fecteau, M.E., and Whitlock, R.H. (2011). Treatment and chemoprophylaxis for paratuberculosis. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 27, 547-557, v. doi:10.1016/j.cvfa.2011.07.002 9. Park, H.T., and Yoo, H.S. (2016). Development of vaccines to Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection. Clin Exp Vaccine Res. 5, 108-116. doi:10.7774/cevr.2016.5.2.108

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CHAPITRE 3 DISCUSSION ET CONCLUSION GÉNÉRALE

La paratuberculose est une maladie qui affecte de nombreux troupeaux de vaches laitières et qui engendre d’importantes pertes économiques pour les producteurs. Bien que les évènements clés de progression de la maladie soient de plus en plus connus, de nombreuses questions demeurent en suspens, en l’occurrence les causes menant à l’établissement ou non de la paratuberculose chez les vaches laitières. La quasi-totalité des études tentant de décrire les phénomènes d’infection et de survie de MAP dans les cellules immunitaires se concentre sur l’impact d’une infection par MAP en utilisant des lignées cellulaires humaines ou bovines. Celles-ci sont transformées, immortalisées et peuvent donc différer grandement de cellules provenant des vaches laitières naturellement infectées. La lignée de macrophages bovins BoMac développée dans les années 1990 (Stabel and Stabel, 1995) en est un exemple. La capacité phagocytaire des BoMac est nettement inférieure à celle observée chez les monocytes primaires ou les macrophages dérivés de monocytes (Woo et al., 2006). D’autres études utilisent des cellules primaires et ainsi se rapprochent beaucoup plus de la réalité biologique d’un animal. Cependant, ces études vont majoritairement utiliser des échantillons de tissus ou de cellules provenant de vaches diagnostiquées négatives pour la paratuberculose. Ces études examinent uniquement l’impact d’une infection in vitro par MAP sur des échantillons provenant d’animaux n’ayant jamais rencontré le pathogène. Il faut rapporter le modèle intéressant développé par l’équipe du Dr Philip Griebel qui fait appel à une intervention chirurgicale pour étudier l’effet in vivo de l’infection bien localisée à l’intestin (Gerdts et al., 2001 ; Charavaryamath et al., 2013). L’infection se fait sur des sujets sains et l’étude de cet effet à long terme n’est pas envisageable. Il est alors très approprié d’étudier les conséquences d’une infection in vitro par MAP sur des cellules immunitaires primaires provenant de vaches diagnostiquées négatives, mais également provenant de vaches positives pour la paratuberculose. Ainsi, l’impact à long terme d’une infection sur les cellules et le système immunitaire en général de vaches atteintes de paratuberculose n’est pas omis. Un autre aspect 126

qui n’est pas négligeable est le choix de la souche de MAP utilisée pour les infections. Plusieurs études rapportent des essais avec la souche K10 (ATCC BAA-968) qui a servi au séquençage du génome de MAP (Wynne et al., 2010). Bien que cette souche soit une référence, l’analyse comparative du transcriptome a démontré que la réponse de macrophages à l’infection avec cette souche K10 diffère de souches isolées de vaches naturellement infectées (Kabara et al., 2010). Les auteurs concluent que cette souche n’est pas représentative et souhaitable pour ce type d’analyse. Dans l’étude qui nous concerne, nous avons choisi une souche dite « de champ » puisqu’elle a été isolée d’une vache naturellement infectée. Bien que son génome n’ait pas été séquencé, elle répond aux critères de l’espèce MAP, tant au niveau de la croissance microbiologique que par son génotype établi à l’aide de marqueur génétique tel que les répétitions en tandem de nombres variables d’unités de répétitions intercalées de type mycobactériales (résultats non présentés) (Overduin et al., 2004 ; Han et al., 2007 ; Thibault et al., 2007 ; Castellanos et al., 2010 ; van Hulzen et al., 2011). Un dernier paramètre non négligeable concerne la viabilité de MAP pour l’infection in vitro. Ainsi, nous avons choisi de maintenir une culture fraîche de la souche et d’avoir ainsi une mycobactérie viable et fonctionnelle. En effet, l’utilisation de doses infectieuses de MAP maintenues congelées n’est pas souhaitable. Il a été démontré que la viabilité de MAP diminue de façon significative lors de stockage à long terme à -70 °C à partir de la troisième semaine de congélation (Richards and Thoen, 1977). L’objectif de ce projet était d’étudier les macrophages de sujets sains et atteints de paratuberculose afin de caractériser les différences au niveau de l’expression génique pour l’ensemble des gènes. L’originalité de ce projet réside en grande partie dans l’utilisation de macrophages primaires provenant de vaches diagnostiquées positives pour la paratuberculose en plus des vaches ayant obtenu un diagnostic négatif. L’évaluation des niveaux d’expression génique a été réalisée grâce au RNA-seq. Comme faire une analyse de ce type sur une très grande population est très coûteux et nécessite beaucoup de ressource informatique et de temps d’analyse, seulement 12 animaux ont été sélectionnés pour l’analyse du transcriptome par RNA-seq. Par la suite, une validation à l’aide de la qPCR incluant 37 animaux

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additionnels a été réalisée pour confirmer le niveau d’expression des gènes identifiés comme différentiellement exprimés et représentatifs de voies biologiques importantes. Mon étude fournit une description exhaustive des gènes différentiellement exprimés (DE) et des voies métaboliques et biologiques associées à l’infection par MAP pendant la première période de 24 h suivant l’infection de macrophages primaires de vache négative et positives pour la paratuberculose. Nos résultats obtenus de macrophages de vaches négatives concordent en grande partie avec ceux obtenus dans d’autres études (Casey et al., 2015 ; Magombedze et al., 2015). Ceci confirme la validité de notre modèle d’infection. Il a été possible d’identifier près de 1500 gènes différentiellement exprimés suite à une infection de huit heures avec MAP. Chez les vaches négatives, la proportion de gènes différentiellement exprimés augmente avec le temps d’infection sauf pour le temps 24 h où il y a une décroissance du nombre de gènes par rapport à huit heures. Cela pourrait s’expliquer par la réponse pro-inflammatoire induite par MAP qui commence à s’estomper dans les cellules. Les principales voies métaboliques affectées par l’infection par MAP chez les vaches négatives sont reliées au système immunitaire, au métabolisme des acides aminés et l’homéostasie des lipides. On compte entre autres la voie de signalisation de l’interleukine 10 et de l’interleukine 6 parmi les 5 voies biologiques les plus affectées après huit heures d’infection. Un fait intéressant est également la présence de voies associées à des maladies auto-immunes telles que l’arthrite rhumatoïde. L’augmentation de l’expression des gènes suivant l’infection par MAP a également été confirmée par qPCR sur une plus grande population. L’infection de MAP in vitro chez les vaches positives pour la paratuberculose a eu un effet complètement différent. En effet, l’infection n’a pas provoqué de changement statistiquement valable dans l’expression des gènes suggérant que ces cellules soient déjà dans un état proinflammatoire, à l’exception d’un petit groupe de gènes différentiellement exprimés (n=32) après quatre heures d’infection. A priori, ce résultat nous semblait inquiétant. Nous avons revu les étapes expérimentales. Alors, ce qui est étonnant c’est que l’isolement des cellules, leur culture, les infections par MAP ont tous été faits selon les mêmes protocoles et répartis sur

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plusieurs mois de façon indifférente de leur statut. De plus, les validations qPCR effectuées sur un panel de 9 gènes ont confirmé l’état réfractaire à l’infection par MAP. Malgré des résultats significatifs en qPCR qui ne l’étaient pas en RNA-seq, les différences de niveaux d’expression entre les contrôles et les échantillons infectés étaient beaucoup plus faibles que pour les mêmes conditions chez les vaches négatives. Alors, avec tout cela j’ai confiance que le phénomène que l’on a observé chez les vaches positives pour la paratuberculose est bien réel. Finalement, j’ai également comparé les différences d’expression génique entre les échantillons provenant de vaches négatives et positives, soit entre les échantillons contrôles ou de macrophages infectés par MAP. Il est intéressant de noter que le niveau d’expression basal de plusieurs gènes reliés à l’immunité était plus élevé chez les macrophages non infectés provenant de vache positive à la paratuberculose à comparer au niveau observé chez les négatives. Ce niveau d’expression plus élevé était toutefois inférieur au niveau observé à la suite de l’infection par MAP chez les vaches négatives. Nos résultats suggèrent que les macrophages provenant de vaches positives seraient déjà dans un état légèrement proinflammatoire constant avant même être stimulés par MAP. Cet état pro-inflammatoire aurait un effet dommageable pour l’hôte au long terme. Cet état de pro-inflammation est visible avec un nombre plus important de gènes relié aux voies de signalisation telles que celle de réponse en phase aiguë et celles des interleukines IL-6 et IL-10. Ces changements dans la réponse immunologique et métabolique des monocytes et/ou des macrophages circulant seraient donc modifiés de façon durable ce qui pourrait expliquer la survie de MAP à long terme dans l’organisme et sa réplication abondante en phases plus avancées de la paratuberculose. La différence dans l’immunorégulation des macrophages était la première des 5 observations principales tirées de nos données. Les autres grandes observations sont l’impact de MAP et de la paratuberculose sur : les maladies autoimmunitaires, le métabolisme des acides aminés, l’homéostasie des lipides et finalement une concordance avec le concept de mémoire de l’immunité innée.

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Des liens entre MAP et plusieurs maladies auto-immunes sont présents dans la littérature scientifique, mais la majorité des liens établis sont indirects. Par exemple, des variations génétiques sur le gène SLC11A1 ont été étudiées dans le cadre de l’arthrite rhumatoïde (Ates et al., 2009) et des polymorphismes de ce gène entraînent également une susceptibilité accrue de développer la paratuberculose (Ruiz-Larranaga et al., 2010b). De plus, des mycobactéries et des protéines de choc thermique de mycobactérie ont été découvertes chez des patients atteints de l’arthrite rhumatoïde (Kempsell et al., 2001) (Sechi and Dow, 2015). Ce qui est remarquable dans notre étude est le lien établi entre la voie biologique du rôle des macrophages dans l’arthrite rhumatoïde, largement enrichie par des gènes différentiellement exprimés suite à l’infection par MAP, mais également chez les macrophages non infectés provenant de vaches atteintes de paratuberculose. Ces résultats démontrent que les liens entre l’établissement d’une inflammation chronique et systémique et MAP sont potentiellement plus rapprochés que l’on peut le croire. Plusieurs études se concentrent sur l’impact des infections sur les gènes reliés au système immunitaire, mais de plus en plus d’intérêt se tourne vers les processus métaboliques lors des maladies cliniques (DeBerardinis and Thompson, 2012). C’est justement ce que nous avons découvert parmi les gènes différentiellement exprimés. En effet, plusieurs voies biologiques associées au métabolisme des différents acides aminés et des lipides sont particulièrement enrichies en gènes différentiellement exprimés. Cette augmentation de gènes reliés aux différentes voies métaboliques telle que la production d’acide aminé est graduelle et durable. En effet, on remarque une augmentation à la suite de l’infection par MAP qui est soutenue chez les vaches positives. En fait, le changement dans le métabolisme des cellules infecté par MAP avait déjà été rapporté lors d’infection expérimentale de vache saine, mais jamais pour des vaches atteinte de paratuberculose. Ainsi, tout indique que MAP pourrait prendre le contrôle des cellules et même influencer leurs métabolismes basaux.

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Une autre caractéristique clé de nos résultats est l’impact de MAP sur le métabolisme et l’emmagasinement des lipides. En effet, il semble que MAP induit graduellement un changement dans l’homéostasie des lipides qui oriente plus particulièrement la cellule vers l’accumulation de cholestérol intracellulaire. Nos résultats démontrent que MAP influence l’expression de gènes tels que MYLIP et PTX3 qui codent pour des protéines qui influencent l’influx et l’efflux de cholestérol dans les cellules (Zelcer et al., 2009 ; Liu et al., 2014). Dans notre étude d’analyse fonctionnelle effectuée à l’aide du logiciel IPA, le gène PTX3 était plutôt associé à la voie biologique de réponse en phase aiguë face à une infection. Cependant, nos résultats et ceux publiés par le groupe de Dr Ruan et ses collaborateurs (Liu et al., 2014), rapportant un rôle de PTX3 dans l’absorption d’oxLDL et son effet d’inhibition sur l’efflux du cholestérol chez le macrophage, suggèrent que ce gène pourrait désormais être intégré dans les voies associées à l’homéostasie des lipides dans les données de voies biologiques des logiciels tels qu’IPA. En effet, MAP semble diminuer les gènes qui s’occupe de l’efflux de cholestérol hors de la cellule et augmente les gènes reliés à l’influx de cholestérol. De plus, des voies biologiques reliées à la production de cholestérol et au facteur de transcription LXR/RXR qui régule plusieurs gènes reliés au métabolisme des lipides sont fortement enrichies de gènes différentiellement exprimés (Hong and Tontonoz, 2014). Il est connu que MAP va se localiser préférablement dans des cellules riches en cholestérol, car leur acidification est plus affaiblie et ainsi plus lente à régulé l’infection (Huynh et al., 2008 ; Keown et al., 2012). Nos résultats suggèrent qu’un débalancement de l’homéostasie du cholestérol est une caractéristique clé de la paratuberculose et du mécanisme d’action de MAP. De plus, une des voies biologiques qui se retrouve constamment la plus enrichie en gènes différentiellement exprimés est la voie responsable de l’état profibrotique des cellules hépatiques. Cela a également été observé dans la spécialisation des macrophages en type foam cell qui est caractérisée par une grande quantité de vésicules de lipide et de cholestérol (Thomas et al., 2015). La coloration des résidus lipidiques effectués sur nos cellules confirme l’accumulation graduelle de lipides dans les macrophages à la suite de l’infection par MAP. Nous avons également observé ce phénomène d’accumulation de résidus lipidiques dans les macrophages provenant de vache ayant reçu un diagnostic positif pour la paratuberculose. Il est donc très intéressant de relever

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la présence de ce phénomène dans les cellules primaires, sans même avoir été infectées. Ces résultats suggèrent un état qui favorise l’inflammation chronique chez ces animaux. Les grandes différences entre les vaches négatives et positives, l’état réfractaire des macrophages de vaches positives à l’infection par MAP, ainsi que les nombreux changements métaboliques nous permettent d’envisager que les macrophages de vaches positives sont modulés pour être tolérants face aux contacts répétés avec MAP. Nous estimons valable l’hypothèse que MAP puisse induire un changement durable dans les cellules immunitaires innées, telles que les monocytes ou macrophages, lors du premier contact avec MAP. Ce changement semble très similaire à ce qui est décrit comme la mémoire du système immunitaire inné du type tolérance. Le patron immunitaire est presque immuable chez les vaches positives à la suite d’un deuxième contact et le fait que MAP est reconnu à la surface des macrophages par des récepteurs connus pour favoriser l’établissement de la tolérance (Ifrim et al., 2014) sont des points non négligeables dans l’établissement de notre hypothèse. De plus, il est également connu que des glycopeptidolipides, très similaires à ceux se retrouvant à la surface de MAP, peuvent induire une tolérance du système immunitaire inné (Riedel and Kaufmann, 2000). Nous avons également confirmé que les macrophages provenant des vaches positives n’étaient pas préalablement infectés lors de nos manipulations. Il est alors fort possible que les changements subis par ces macrophages soient durables dans le temps, ce qui est une des caractéristiques de la mémoire de l’immunité innée et de la tolérance. Il est clair que des confirmations supplémentaires devront s’ajouter à ces résultats pour confirmer l’établissement d’un état de tolérance dans le système immunitaire chez les vaches atteinte de paratuberculose. Cependant, nous croyons que ces résultats sont valides et prometteurs dans une optique de compréhension plus globale des mécanismes de progression de la paratuberculose. En conclusion, ces résultats nous ont permis de relever plusieurs éléments clés dans le mécanisme d’action de MAP afin de réguler l’établissement de la paratuberculose chez les vaches laitières. Le débalancement immunométabolique, l’homéostasie du cholestérol et des

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lipides ainsi que l’établissement d’une tolérance chez les cellules de l’immunité innée sont clairement des éléments importants dans la progression de la paratuberculose. En perspectives, cette analyse est un premier pas dans une compréhension beaucoup plus globale des multiples facteurs influençant la progression de cette maladie. En effet, dans le cadre plus global de ce projet, l’analyse de polymorphismes associés à cette maladie identifiée à partir de données du transcriptome qui sont en cours de validation, va nous permettre de brosser un portrait plus global des acteurs clés qui influencent la résistance ou la susceptibilité génétique à développer la maladie. Nous avons étudié les changements qui s’opèrent dans les macrophages en réponse à une infection par le MAP. Ainsi, en combinant cette information aux données de variations génétiques, il sera possible de cibler des gènes candidats associés à la paratuberculose. Afin d’approfondir les caractéristiques particulières des vaches qui développent la maladie, il serait intéressant d’effectuer des études sur le remodelage épigénétique des cellules immunitaires de ces vaches. En effet, bien que nous décelions une tendance vers un état immunitaire inné de tolérance à MAP chez les macrophages de vaches ayant reçu un diagnostic positif à la paratuberculose, il serait intéressant d’étudier les patrons de méthylation et d’acétylation des histones présentes sur leur génome. La majorité des études qui décrit la mémoire de l’immunité innée indique que ces changements induisent effectivement un remodelage épigénétique durable dans ces cellules (Kleinnijenhuis et al., 2012 ; Quintin et al., 2012 ; Logie and Stunnenberg, 2016). Il serait alors très approprié d’étudier l’effet de l’infection par MAP à court et long terme sur le remodelage épigénétique des cellules immunitaires tel que les monocytes et macrophages afin de voir si l’établissement et la progression de la paratuberculose chez les vaches laitières ne seraient pas dus à des modifications épigénétiques.

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