objetivos de la tesis doctoral [PDF]

 

TESIS DOCTORAL APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ANALIZADORES DE SIMPLE Y TRIPLE CUADRUPOLO EN ANÁLISIS ALIMENTARIO Y BIOLÓGICO Departamento de Hidrogeología y Química Analítica Universidad de Almería

Doctoranda: REMEDIOS FERNÁNDEZ FERNÁNDEZ ALMERÍA, 2012

“APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ANALIZADORES DE SIMPLE Y TRIPLE CUADRUPOLO EN ANÁLISIS ALIMENTARIO Y BIOLÓGICO”

Memoria presentada por Remedios Fernández Fernández para aspirar al grado de Doctor en Ciencias Químicas

Fdo.: Remedios Fernández Fernández Almería, Septiembre de 2012

Directora de Tesis

Fdo.: Dra. Antonia Garrido Frenich

Codirector de Tesis

Fdo.: Dr. Roberto Romero González

RESUMEN En la presente Tesis se desarrollan metodologías analíticas, basadas en cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) o cromatografía de líquidos de ultra eficacia (UHPLC) acopladas a detectores de espectrometría de masas (MS) con analizadores cuadrupolares (simple o triple cuadrupolo), para la determinación de compuestos orgánicos en el campo alimentario (calidad y seguridad) y biológico. Asimismo, se han dirigido los esfuerzos, en optimizar los procesos de tratamiento y extracción de muestra, de forma que resulten lo más rápidos y sencillos de aplicar. El trabajo se organiza en tres grandes bloques. En el primer bloque se desarrollan y/o revisan metodologías analíticas que permiten una correcta evaluación de la seguridad alimentaria, mediante la determinación de residuos de plaguicidas, medicamentos veterinarios e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), empleando técnicas de cromatografía de líquidos acopladas a MS. El primero de los trabajos de este bloque desarrolla y valida una metodología analítica basada en UHPLC acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS) para la cuantificación y confirmación de residuos de plaguicidas en cítricos utilizando extracción sólido-líquido (SLE), no siendo necesario aplicar una etapa de limpieza. El método desarrollado se aplica al análisis en rutina de 365 muestras de cítricos durante el periodo de un año (2006). El segundo trabajo utiliza HPLC-MS para evaluar la eliminación de diferentes residuos de medicamentos veterinarios en músculo de dorada procedente de acuario tras ser alimentada con piensos medicados. En el último trabajo de este bloque se hace una revisión de la metodología analítica existente, basada en técnicas cromatográficas acopladas a distintos sistemas de detección, para la determinación de residuos de plaguicidas y PAHs en aceite de oliva. En el segundo bloque se utiliza HPLC-MS para evaluar diferentes parámetros muy útiles en la evaluación de la calidad alimentaria, como son la determinación de compuestos de bajo peso molecular. El primer trabajo de este bloque desarrolla y valida una metodología analítica basada en HPLC-MS para la cuantificación y confirmación de ácidos orgánicos (cítrico y málico) en tomate, pimiento y naranja utilizando SLE, sin

necesidad de realizar posteriormente una etapa de limpieza. En el segundo trabajo se desarrolla y valida una metodología analítica basada en HPLC-MS para la cuantificación y confirmación de vitamina C (ácido ascórbico) en alimentos fortificados (cereales de desayuno, zumos y alimentos infantiles) utilizando SLE cuando se trata de muestras sólidas, o bien una simple dilución cuando se trata de muestras líquidas. Finalmente, en el último bloque se aplica UHPLC-MS de triple cuadrupolo para el análisis de muestras biológicas. Se ha desarrollado y validado un método para la cuantificación y confirmación de diferentes familias de neurotransmisores en cerebro de rata utilizando un tratamiento de muestra basado en SLE. Los neurotransmisores son sustancias de elevado interés, debido a su importancia en el sistema nervioso, en los procesos metabólicos y en el sistema inmunológico. Así, la aportación que hace esta Tesis Doctoral de una metodología rápida y fiable para el análisis de estos compuestos, es muy valiosa sobre todo en el campo de la investigación biomédica y en la medicina clínica.

SUMMARY This Thesis aims the development of analytical methodologies based on high performance liquid chromatography (HPLC) or ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled to mass spectrometry (MS) detector with quadrupole analyzers (single or triple quadrupole) for the determination of organic compounds in food (quality and safety) and biological field. Furthermore, the attention has been also paid to optimize sample treatment, minimizing sample handling and increasing sample throughput. The work is divided in three main sections. In the first one, several analytical methods have been developed and/or reviewed in the field of food safety for the determination of pesticide residues, veterinary drugs and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) using liquid chromatographic techniques coupled to MS. In the first study, an analytical method based on UHPLC coupled to MS in tandem mode (MS/MS) has been developed and validated for the quantification of pesticide residues in citrus. For that purpose, solid-liquid extraction (SLE) has been applied, avoiding further cleaning steps. The developed method has been applied in routine analysis during one year, and 365 samples of citrus fruits has been analysed. In the second study, HPLC-MS has been used to evaluate the elimination of different veterinary drug residues in muscle of gilthead seabream from aquarium after being fed with medicated feed. Finally, the last paper of this section is a review (chapter book) of existing analytical methodology, based on chromatographic techniques coupled to different detection systems, for the determination of pesticide residues and PAHs in olive oil. In the second section, HPLC-MS has been used to evaluate useful parameters related to food quality, as the determination of low molecular weight compounds. In the first study, an analytical method based on HPLC-MS has been developed and validated for quantification and confirmation of organic acids (citric and malic) in tomato, pepper and orange. SLE has been used as extraction technique, and no further clean-up steps were necessary. In the second paper, an analytical method based on HPLC-MS has been developed and validated for quantification and confirmation of vitamin C (ascorbic

acid) in fortified foods (breakfast cereals, juices and baby foods) using SLE for solid samples, or a simple dilution for liquid samples. Finally, in the last section, UHPLC coupled to triple quadrupole MS/MS has been applied for the analysis of biological samples. Therefore, an analytical method based on UHPLC-MS/MS has been developed and validated for quantification and confirmation of several families of neurotransmitters in rat brain using SLE as extraction procedure. These compounds are substances of great interest because they play an important role in the nervous system, metabolic processes and the immune system. Thus, the contribution of this Thesis, developing a fast and reliable methodology for the analysis of these compounds, is very valuable especially in the field of biomedical research and clinical medicine.

AGRADECIMIENTOS Principalmente quiero expresar mi agradecimiento a mis directores de Tesis Doctoral, la Dra. Dña Antonia Garrido Frenich y el Dr. D. Roberto Romero González, que han dirigido y revisado con gran dedicación e interés el desarrollo de la misma. También quiero hacer una mención especial a José, por todas las horas de ayuda, apoyo y comprensión.

ÍNDICE

ÍNDICE Objetivos de la Tesis Doctoral……………………………..………………………………………1 Abreviaturas………………………………………………...………………………………………….5 CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN GENERAL 1.1

CONTEXTUALIZACIÓN............................................................................................................. 11

1.2

MARCO NORMATIVO ................................................................................................................ 13 1.2.1 SEGURIDAD ALIMENTARIA...........................................................................................13 1.2.1.1 Residuos de plaguicidas..........................................................................................17 1.2.1.2 Residuos de medicamentos veterinarios .................................................................20 1.2.1.3 Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) ......................................................24 1.2.2 CALIDAD ALIMENTARIA................................................................................................26 1.2.3 MÉTODOS DE ANÁLISIS ..................................................................................................27

1.3

TÉCNICAS DE TRATAMIENTO DE MUESTRA DE LOS COMPUESTOS OBJETO DE ESTUDIO.................................................................................................................................. 30 1.3.1 TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN ..........................................................................................32 1.3.2 LIMPIEZA DE LA MUESTRA (CLEAN UP) ......................................................................36

1.4

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS DE ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS OBJETO DE ESTUDIO.................................................................................................................................. 37 1.4.1 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS (LC)..........................................................................38 1.4.2 ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS)..............................................................................42 1.4.2.1 Técnicas de introducción e ionización de muestra: Interfases ................................42 1.4.2.2 Analizadores de masas............................................................................................45 1.4.2.3 Modos de trabajo en espectrometría de masas........................................................48 1.4.3 TENDENCIAS EN LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS ..............52

BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 54

CAPÍTULO 2. EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD ALIMENTARIA (PLAGUICIDAS, MEDICAMENTOS VETERINARIOS Y PAHs) MEDIANTE TÉCNICAS DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS-ESPECTROMETRÍA DE MASAS 2.1

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 77

BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................................... 82 Artículo Científico 1: “One-Year Routine Application of a New and Rapid Method based on Ultra Performance Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry to the Analysis of Selected Pesticides in Citrus Fruits”…………..…………………………………………………………………...…...............87 Artículo Científico 2: “Depletion of Veterinary Drugs Used in Aquaculture after Administration in Feed to Gilthead Seabream (Sparus Aurata)”………………………………………...…………………………95 Artículo Científico 3: “Sample Treatment and Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Pesticide Residues in Olive Oil”…………………………………………………………………………105

CAPÍTULO 3. EMPLEO DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN CALIDAD ALIMENTARIA: DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS DE BAJO PESO MOLECULAR 3.1

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 141

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 145 Artículo Científico 4: “Simple LC–MS Determination of Citric and Malic Acids in Fruits and Vegetables”………………………………...…………………………………………………………….147 Artículo Científico 5: “HPLC-MS Determination of Vitamin C in Fortified Food Products”……………………………………………………………………………………………...….157

CAPITULO 4. APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA EL ANÁLISIS DE NEUROTRANSMISORES EN MUESTRAS BIOLÓGICAS 4.1

INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 175

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 178 Artículo Científico 6: “Development and Validation of an Ultra-High Performance Liquid Chromatography–Tandem Mass-Spectrometry (UHPLC–MS/MS) Method for the Simultaneous Determination of Neurotransmitters in Rat Brain Samples”………………………………………..…...181

CAPITULO 5. DISCUSIÓN INTEGRADA ................................................................................. 193 5.1

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN ................................................................................................. 196

5.2

SEPARACIÓN Y DETECCIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS .................................... 201

5.3

5.2.1 HPLC Y UHPLC.................................................................................................................205 5.2.2 MS Y MS/MS......................................................................................................................209 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS. EVALUACIÓN DEL EFECTO MATRIZ........................................................................................................................................212

CAPITULO 6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 219

OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL

OBJETIVOS DE LA TESIS DOCTORAL El objetivo principal de la presente Tesis Doctoral es el desarrollo de metodologías analíticas rápidas, fiables y que permitan la determinación simultánea de varios analitos, basadas en cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) o cromatografía de líquidos de ultra eficacia (UHPLC) acopladas a detectores de espectrometría de masas (MS) con analizadores cuadrupolares, para la investigación de compuestos orgánicos en los ámbitos alimentario (calidad y seguridad) y biológico. Para alcanzar este objetivo general, los objetivos específicos de los trabajos realizados en cada uno de los campos han sido:

Seguridad alimentaria: -

Desarrollar y validar metodología analítica basada en UHPLC-MS/MS para la cuantificación y confirmación de residuos de plaguicidas en cítricos utilizando la extracción sólido-líquido (SLE) mediante una extracción con disolvente, evitando la aplicación de etapas de limpieza posteriores → Artículo Científico 1

-

Emplear metodología analítica basada en HPLC-MS para evaluar la variación de los niveles de residuos de medicamentos veterinarios en dorada procedente de acuario tras ser alimentada con piensos medicados → Artículo Científico 2

-

Revisar

la

metodología

analítica

existente,

basada

en

técnicas

cromatográficas acopladas a distintos sistemas de detección, para la determinación de residuos de plaguicidas e hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) en aceite de oliva → Artículo Científico 3

Calidad alimentaria: -

Desarrollar y validar metodología analítica basada en HPLC-MS para la cuantificación y confirmación de ácidos orgánicos (cítrico y málico) en tomate, pimiento y naranja utilizando SLE, mediante una extracción con

1

disolvente, sin necesidad de aplicar etapas de limpieza posteriores → Artículo Científico 4 -

Desarrollar y validar metodología analítica basada en HPLC-MS para la cuantificación y confirmación de vitamina C (ácido ascórbico) en alimentos fortificados (cereales de desayuno, zumos y alimentos infantiles) utilizando SLE para muestras sólidas, o bien una dilución de las muestras líquidas, y sin necesidad de aplicar etapas de limpieza posteriores → Artículo Científico 5

Control biológico: -

Desarrollar y validar metodología analítica basada en UHPLC-MS/MS para la cuantificación y confirmación de neurotransmisores en cerebro de rata utilizando SLE → Artículo Científico 6

2

ABREVIATURAS

ABREVIATURAS 5-HIAA

Ácido 5-Hidroxindolacético (5-Hydroxyindolacetic Acid)

AAPS

Asociación

Americana

de

Científicos

Farmacéuticos

(American

Association of Pharmaceutical Scientists) ALARA

Tan Bajo Como Sea Posible (As Low As Reasonably Achievable)

AOAC

Asociación Oficial de Químicos Analíticos (Association of Official Analytical Chemist)

APCI

Ionización Química a Presión Atmosférica (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation)

API

Ionización a Presión Atmosférica (Atmospheric Pressure Ionisation)

APLI

Ionización a Presión Atmosférica por Láser (Atmospheric Pressure Laser Ionisation)

APPI

Fotoionización

a

Presión

Atmosférica

(Atmospheric

Pressure

Photoionisation) BEH

Tecnología Híbrida de Enlaces de Etilsiloxano/sílica (Bridged Ethyl Hybrid technology)

CI

Ionización Química (Chemical Ionisation)

CID

Disociación Inducida por Colisión (Collision Induced Dissociation)

DAD

Detector de Diodos en Fila (Diode Array Detector)

DSPE

Extracción en Fase Sólida Dispersiva (Dispersive Solid Phase Extraction)

EC

Electroforesis Capilar (Capillary Electrophoresis)

ECD

Detector de Captura de Electrones (Electron Capture Detector)

EDTA

Ácido Etilendiaminotetraacético (Ethylenediaminetetraacetic Acid)

EFSA

Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (European Food Safety Authority)

EMA

Agencia Europea del Medicamento (European Medicines Agency)

EPA

Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (Environmental Protection Agency of the United States)

ESI

Electronebulización (Electrospray Ionisation)

EU

Unión Europea (European Union)

5

FAO

Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (The Food and Agriculture Organization of the United Nations)

FDA

Administración de Medicamentos y Alimentos de los Estados Unidos (Food and Drug Administration of the United States)

FTMS

Espectrometría de Masas con Transformada de Fourier (FourierTransform Mass Spectrometer)

GABA

Ácido Gamma Aminobutírico (Gamma-Aminobutyric Acid)

GATT

Acuerdo General sobre Aranceles Aduaneros y Comercio (General Agreement on Tariffs and Trade)

GC

Cromatografia de Gases (Gas Chromatography)

GPC

Cromatografia de Permeación en Gel (Gel Permeation Chromatography)

HFBA

Ácido Heptafluorobutírico (Heptafluorobutyric Acid)

HILIC

Cromatografía de Líquidos de Interacción Hidrofílica (Hydrophilic Interaction Chromatography)

HPLC

Cromatografia de Líquidos de Alta Presión (High Pressure Liquid Chromatography)

HRMS

Espectrometría de Masas de Alta Resolución (High Resolution Mass Spectrometry)

HS

Espacio en Cabeza (Head Space)

HVA

Ácido Homovanílico (Homovanillic Acid)

ICR

Resonancia Iónica en Ciclotrón (Ion Ciclotron Resonance)

INFOSAN

Red Internacional de Autoridades de Inocuidad de los Alimentos (International Food Safety Authorities Network)

IT

Trampa de Iones (Ion Trap)

LC

Cromatografía de Líquidos (Liquid Chromatography)

LIT

Trampa de Iones Lineal (Linear Ion Trap)

LIT-FT-ICR Analizador Híbrido Trampa de Iones Lineal-Resonancia Iónica en Ciclotrón con Transformada de Fourier (Linear Ion Trap FourierTransform Ion Cyclotron Resonance) LLE

Extracción Líquido-Líquido (Liquid-Liquid Extraction)

LOD

Límite de Detección (Limit of Detection)

LOQ

Límite de Cuantificación (Limit of Quantification)

6

LRMS

Espectrometría de Masas de Baja Resolución (Low Resolution Mass Spectrometry)

LTQ-Orbitrap Analizador Híbrido Cuadrupolo-Trampa de Iones Lineal-Orbitrap (Linear Trap Quadrupole-Orbitrap) MAE

Extracción Asistida por Microondas (Microwave Assisted Extraction)

MRM

Monitorización de Reacciones Múltiples (Multiple Reaction Monitoring)

MRL

Límite Máximo de Residuos (Maximum Residue Level)

MRPL

Límite Mínimo de Funcionamiento Exigido (Minimum Required Performance Limit)

MSF

Acuerdo sobre Aplicaciones de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias (Agreement on the Application of Sanitary and Phytosanitary Measures)

MS

Espectrometría de Masas (Mass Spectrometry)

MS/MS

Espectrometría de Masas en Tándem (Tandem Mass Spectrometry)

MSPD

Dispersión de Matriz en Fase Sólida (Matrix Solid Phase Dispersion)

m/z

Relación masa/carga (Mass to Charge Ratio)

NMR

Resonancia Magnética Nuclear (Nuclear Magnetic Resonance)

NPD

Detector de Nitrógeno-Fósforo (Nitrogen Phosphorus Detector)

PAHs

Hidrocarburos

Aromáticos

Policíclicos

(Polycyclic

Aromatic

Hydrocarbons) PLE

Extracción con Líquidos Presurizados (Pressurized Liquid Extraction)

PSA

Amina Primaria/Secundaria (Primary and Secondary Amine)

PTV

Vaporización a Temperatura Programada (Programmed Temperature Vaporization)

Q

Cuadrupolo (Quadrupole)

QIT

Trampa de Iones Quadrupolar (Quadrupole Ion Trap)

QqLIT(Q-Trap) Analizador Híbrido Cuadrupolo-Trampa de Iones Lineal (QuadrupoleLinear Ion Trap) QqQ

Triple Cuadrupolo (Triple Quadrupole)

QqTOF

Analizador Híbrido Cuadrupolo-Tiempo de Vuelo (Quadrupole-Time of Flight)

RASFF

Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos (Rapid Alert System For Food and Feed)

7

REACH

Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals Substances)

SAE

Extracción Asistida por Ultrasonidos (Sonication Assisted Extraction)

SCF

Comité Científico sobre la Alimentación Humana (Scientific Committee on Food)

SCIRI

Sistema

Coordinado

de

Intercambio

Rápido

de

Información

(Coordinated System of Fast Interchange of Information) SFE

Extracción con Fluidos Supercríticos (Supercritical Fluid Extraction)

SIM

Monitorización de Iones Seleccionados (Selected Ion Monitoring)

SLE

Extracción Sólido-Líquido (Solid-Liquid Extraction)

S/N

Relación Señal/Ruido (Signal to Noise Ratio)

SPE

Extracción en Fase Sólida (Solid Phase Extraction )

SPS

Acuerdo sobre la Aplicación de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias (Sanitary and Phytosanitary Agreement)

SPME

Microextracción en Fase Sólida (Solid-Phase MicroExtraction)

SRM

Monitorización de Reacciones Seleccionadas (Selected Reaction Monitoring)

TBAH

Hidróxido de Tetrabutilamonico (Tetrabutylammonium Hydroxide)

TBT

Acuerdo sobre Obstáculos Técnicos al Comercio (The Agreement on Technical Barriers to Trade)

TEAH

Hidróxido de Tetraetilamonio (Tetraethylammonium Hydroxide)

TFA

Ácido Trifluoroacético (Trifluoroacetic Acid)

TOF

Tiempo de Vuelo (Time of Flight)

UHPLC

Cromatografía de Líquidos de Ultra Eficacia (Ultra High Performance Liquid Chromatography)

WHO

Organización Mundial de la Salud (World Health Organization)

WTO

Organización Mundial del Comercio (World Trade Organization)

8

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN GENERAL

Capítulo 1. Introducción general

Contextualización

1.1 CONTEXTUALIZACIÓN En la actualidad existen un gran número de problemas analíticos en diversos ámbitos, como son el agroalimentario o biológico (clínico) entre otros, que presentan como característica común la necesidad de identificar, confirmar y cuantificar simultáneamente diversos compuestos a bajos niveles de concentración, establecidos por la legislación, en matrices complejas. La cromatografía es una de las técnicas con mayor potencial en el análisis multianalito, ya que aúna simplicidad y rapidez, elevada eficacia en el proceso separativo y disponibilidad de una amplia variedad de detectores. En este sentido, el acoplamiento de la cromatografía de líquidos (LC) - y sus continuos desarrollos como la cromatografía de líquidos de ultra eficacia (UHPLC) - con analizadores de espectrometría de masas (MS) se ha convertido en una herramienta imprescindible en los laboratorios de ensayo e investigación. Por un lado, un gran número de sustancias de polaridad media/alta, como residuos de plaguicidas y de antibióticos o compuestos bioactivos, son analizables mediante LC. Además, debido a la creciente preocupación por los riesgos toxicológicos de los compuestos químicos, se tiende al uso de productos de mayor polaridad, ya que en principio, son menos tóxicos y se eliminan y degradan con mayor facilidad [1]. Por otro lado, la MS presenta una gran sensibilidad, selectividad y capacidad de confirmación, que la hacen ideal en métodos multianalito. Así ocurre en el ámbito agroalimentario, donde es crucial el riguroso control de los diferentes productos, desde aquellos de primera necesidad (frutas, hortalizas, pescado, etc.) hasta otros de nueva generación como son los alimentos enriquecidos, con el fin de verificar que cumplen los criterios de seguridad y calidad establecidos por las autoridades y requeridos por los propios consumidores. La realización de este tipo de control alimentario no es una tarea sencilla. Cuando se lleva a cabo la evaluación de un alimento no solo es necesario mantener un control exhaustivo de la inocuidad del mismo (seguridad alimentaria), sino también de los aspectos intrínsecos de cada producto, como podría ser su valor nutricional (calidad alimentaria). En este punto, es importante diferenciar los términos de seguridad y calidad alimentaria. Cuando se indica que un alimento es inocuo, se hace referencia a que el mismo no causa daño a la salud de las personas que lo consumen, por ejemplo el nivel de residuos de plaguicidas o de medicamentos veterinarios es inferior al límite máximo de residuo (MRL) establecido 11

Capítulo 1. Introducción general

Contextualización

en legislación, siendo por lo tanto, un requisito de obligado control y cumplimiento. Por otro lado, la calidad alimentaria incluye todos los demás atributos, por ejemplo, presencia de vitaminas o compuestos bioactivos que forman parte de la composición de dicho alimento. En el ámbito biológico las aplicaciones de los métodos de análisis se han extendido a la investigación biomédica y a la medicina clínica, siendo útiles en la emisión de diagnósticos, en la detección de desórdenes biológicos y en la dilucidación del tratamiento de un número creciente de enfermedades [2-4]. Así, la determinación de neuroquímicos extracelulares (neurotransmisores) permite avanzar en el conocimiento de la neuropsiquiatría, así como en farmacoterapias utilizadas para tratarla. Por ello, la medicina, con ayuda de los métodos de análisis, puede presentar un papel importante en la medicina del futuro a medida que los médicos tengan a su disposición estas herramientas para la práctica clínica [5], por lo que es necesario el desarrollo de metodologías analíticas que permitan una determinación rápida y fiable de este tipo de compuestos. En relación a los métodos analíticos, una de las tendencias actuales es la simplificación de la etapa de tratamiento de muestra, lo que se consigue con la aplicación de métodos genéricos de extracción que sean rápidos y sencillos. Además dichos métodos han de alcanzar los niveles de cuantificación necesarios para cumplir con los MRLs establecidos por la legislación, que cada vez son más restrictivos en matrices complejas, como los alimentos [6,7], así como también los requisitos de calidad de los parámetros de validación de dichos métodos. Ello requiere del desarrollo de métodos analíticos que presenten una etapa de tratamiento de muestra simple, tiempos de análisis reducidos y una gran sensibilidad, selectividad y capacidad de confirmación. En base a todo lo expuesto, en el establecimiento de los métodos analíticos utilizados para el control de compuestos orgánicos en matrices alimentarias o biológicas es fundamental tener en cuenta los siguientes aspectos: (i) el marco normativo; (ii) la evolución en los métodos de tratamiento de muestra y (iii) los avances en LC-MS, tanto en los sistemas cromatográficos, como UHPLC, como en los analizadores de MS.

12

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

1.2 MARCO NORMATIVO 1.2.1

SEGURIDAD ALIMENTARIA En las últimas dos décadas se ha desarrollado una intensa actividad normativa en

materia alimentaria a nivel internacional. Desde el punto de vista comercial, la revisión del Acuerdo General sobre Aranceles Aduaneros y Comercio (GATT), en la Ronda de Uruguay de Negociaciones Comerciales Multilaterales de 1994, culminó con la creación de la Organización Mundial del Comercio (WTO) el 1 de enero de 1995. En las negociaciones comerciales se consiguió dar importancia a la agricultura y se alcanzó el compromiso por parte de los países participantes de reducir los obstáculos arancelarios a muchos productos a fin de fomentar el libre comercio [8]. En el marco de la WTO se elaboraron dos acuerdos en materia alimentaria; por un lado el Acuerdo sobre la Aplicación de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias (SPS), con el objetivo de garantizar que todos los países implementen medidas para la protección de la salud de los animales y las personas (medidas sanitarias) y para preservar los vegetales (medidas fitosanitarias) bajo la aplicación del principio de cautela; y por otro lado, el Acuerdo sobre Obstáculos Técnicos al Comercio (TBT), con el objetivo de homogeneizar los reglamentos, normas técnicas y procedimientos de certificación y así evitar obstáculos innecesarios al comercio [8]. Estos acuerdos indican la importancia de armonizar internacionalmente las normas sanitarias y fitosanitarias y otras normas técnicas para evitar posibles obstáculos comerciales. El SPS indica en el artículo 3.1 [9] que “para armonizar en el mayor grado posible las medidas sanitarias y fitosanitarias, los Miembros basarán sus medidas sanitarias o fitosanitarias en normas, directrices o recomendaciones internacionales, cuando existan, salvo disposición en contrario en el presente Acuerdo”. Sin embargo, autoriza a los gobiernos a adoptar, basándose en principios científicos, sus propias normas sanitarias y fitosanitarias. No obstante, los países pueden establecer normas más rigurosas bajo una justificación científica o por circunstancias sobrevenidas, lo que supone un verdadero caballo de batalla de la aplicación de las medidas SPS y el origen de innumerables disputas comerciales. Un ejemplo son los requisitos en la exportación de alimentos, cada vez más exigentes, de países como Japón hacia exportadores como la Unión Europea (UE), China y Estados Unidos [10].

13

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

Como medida para asegurar que los alimentos están libres de compuestos tóxicos, o si se detecta presencia de éstos en los mismos confirmar que no contengan niveles superiores a los fijados por la legislación [6,7], se pusieron en marcha medidas legislativas para el establecimiento de MRLs. Sin embargo, uno de los puntos más destacables en referencia a la legislación en materia de seguridad alimentaria es la falta de homogeneidad. La legislación no está armonizada a nivel mundial [11] existiendo contaminantes que no tienen MRL establecido y otros casos en los que los MRLs han sido establecidos a nivel nacional, y por tanto pueden ser diferentes en los distintos países. A pesar de esta falta de armonización a nivel mundial, el Codex Alimentarius, establecido por la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (WHO), indica las directrices necesarias para conseguir alimentos libres de peligros para la salud, que son usadas como referencia a nivel internacional [12]. La Tabla 1.1 presenta una visión general de los organismos gubernamentales nacionales e instituciones internacionales encargados de la seguridad alimentaria, incluyendo los sitios Web que recogen las recomendaciones y legislaciones disponibles. Tabla 1.1. Organismos gubernamentales relacionados con la seguridad alimentaria. Organizaciones internacionales y organismos gubernamentales

y

organizaciones

internacionales

Sitio Web

Comisión del Codex Alimentario

http://www.codexalimentarius.net/web/index_en.jsp

FAO

http://www.fao.org/

Gobiernos de Australia y Nueva Zelanda

http://www.foodstandards.gov.au/

Gobierno de Canadá

http://www.hc-sc.gc.ca/

Gobierno de China

http://eng.sfda.gov.cn/WS03/CL0755/

Gobierno de Estados Unidos

http://www.fda.gov/

Gobierno de Japón

http://www.ffcr.or.jp/zaidan/FFCRHOME.nsf/pages/eng.h-page

Gobierno del Reino Unido

http://www.food.gov.uk/

Organización Mundial del Comercio

http://www.wto.org/

Organización Mundial de la Salud

http://www.who.int/about/en

Unión Europea (UE)

http://europa.eu/

La UE, como uno de los principales importadores de alimentos a nivel mundial, a través del Reglamento (CE) nº 178/2002 [13] del Parlamento Europeo y del Consejo del 28 de enero de 2002, realiza una revisión de los principios generales de la 14

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

legislación alimentaria. Esta revisión incluye a los piensos, ya que la contaminación de éstos constituyó el origen de algunas de las principales alertas sanitarias de los últimos años como fue el caso de la crisis de la encefalopatía espongiforme bovina o “crisis de las vacas locas” [14]. Así, bajo esta normativa, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) [15] como medio para garantizar la seguridad alimentaria y se publica el “libro blanco de la seguridad alimentaria” [14]. Se establecieron procedimientos relativos a la seguridad alimentaria en las fases de producción de materias primas animales o vegetales y a lo largo de toda la cadena alimentaria desde un punto de vista de control integrado, empleando el lema “de la granja a la mesa”. El control integrado implica la identificación de posibles puntos de contaminación en los diferentes eslabones de la cadena, así como la toma de medidas preventivas, desde la granja (aplicación de buenas prácticas agrícolas), el procesado (puntos críticos de control), almacenamiento/transporte (manteniendo la cadena de frío), distribución y venta (respetando las guías y los códigos de alimentación e higiene), hasta la mesa (consumidor). Por su parte, la responsabilidad jurídica de mantener la seguridad de los alimentos en las diferentes etapas de la cadena alimentaria recae en el productor o empresa alimentaria, ya que la Directiva 2001/95/CE [16] obliga a los productores y distribuidores a comercializar exclusivamente productos seguros. Es de reseñar especialmente que el Reglamento 178/2002 [13] establece que, a partir del 1 de enero de 2005, las empresas alimentarias deben garantizar la trazabilidad de los alimentos y los piensos en todas las etapas de producción, transformación y distribución, agilizando así la localización del foco de cualquier problema sanitario, y así poder actuar con rapidez y eficacia. En el seno de la UE, para disponer de un correcto funcionamiento de los mercados, es necesaria la libre circulación de alimentos sanos y seguros. Sin embargo, la eliminación de los controles sanitarios en las fronteras internas de la UE conlleva la necesidad de elaborar otros instrumentos que impidan la libre circulación de productos peligrosos, como el sistema de alerta rápida, las medidas de emergencia para situaciones de crisis y los planes de vigilancia. Así, el artículo 50 del Reglamento 178/2002 [13] establece el Sistema de Alerta Rápida para Alimentos y Piensos (RASFF). Este sistema se basa en el intercambio rápido de información sobre los posibles peligros para la salud humana, aplicándose a todo tipo de alimentos y piensos controlados en los puntos de inspección

15

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

fronterizos [17]. La red de información está constituida por la EFSA, Islandia, Liechtenstein, Noruega, los 27 Estados miembros y la Comisión Europea, que actúa como responsable de la gestión del sistema [18]. Estos sistemas se encuentran actualmente implantados tanto a nivel nacional, con el Sistema Coordinado de Intercambio Rápido de Información (SCIRI), comunitario con el RASFF e internacional con la Red Internacional de Autoridades de Inocuidad Alimentaria (INFOSAN). Todo este sistema de alerta rápida comprende tres niveles de información: (i) Las noticias de alerta: en el caso de que circulen en el mercado alimentos o piensos que presenten grave riesgo para la salud y se requieran acciones de forma inmediata por parte de las autoridades competentes, como por ejemplo, retirar el producto del mercado. (ii) Las noticias de información: en el caso de haberse identificado un riesgo, pero no se requiere acción inmediata, bien porque el riesgo no es grave para la salud o bien porque el producto no se encuentra en el mercado. (iii) Las noticias de rechazo en la frontera: en el caso de detectar en las fronteras exteriores de la UE, algún alimento o pienso que presente riesgo para la salud de los consumidores. De forma general, los productos rechazados son devueltos a origen o destruidos; además, el rechazo se comunica a todos los miembros del RASFF, para garantizar que los productos rechazados no vuelvan a introducirse en la UE desde otro punto fronterizo. En la UE existen sustancias para las que no se ha establecido un MRL o bien no han sido autorizadas. En estos casos, la UE, a fin de armonizar el funcionamiento analítico de los métodos aplicables al control de dichas sustancias, ha introducido el concepto de límite mínimo de funcionamiento exigido (MRPL) [19], el cual representa la mínima concentración de analito en una muestra que tiene que ser detectada y confirmada. Los MRPLs de los métodos analíticos se establecen progresivamente en consulta con los laboratorios comunitarios de referencia, los laboratorios nacionales de referencia y los Estados miembros. Hasta el momento, se han fijado en productos de origen animal para cloranfenicol (0,3 µg/kg) [20], metabolitos de nitrofuranos (1 µg/kg para todos ellos) [20] y para la suma de verde de malaquita y verde de leucomalaquita (2 µg/kg) [21]. 16

Capítulo 1. Introducción general

1.2.1.1

Marco normativo

Residuos de plaguicidas

Según el Codex Alimentarius, los residuos de plaguicidas son “cualquier sustancia especificada presente en alimentos, productos agrícolas o alimentos para animales como consecuencia del uso de un plaguicida. El término incluye cualquier derivado de un plaguicida, como productos de conversión, metabolitos y productos de reacción, y las impurezas consideradas de importancia toxicológica” [22]. El establecimiento y actualización de MRLs en materia de residuos de plaguicidas se realiza por diferentes organismos internacionales, como son el Codex Alimentarius [12], la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) [23] y la UE [24]. Tanto la EPA [23] como la UE mediante el Reglamento CE nº 396/2005 [7], han regulado los niveles de residuos de plaguicidas. Estas legislaciones no están armonizadas, de forma que los MRLs vigentes en el Codex Alimentarius, en muchos casos no coinciden con los establecidos en la legislación utilizada en Estados Unidos o en la UE. Un Reglamento comunitario de interés es el Reglamento (CE) nº 1907/2006, relativo al registro, evaluación, autorización y restricción de las sustancias y preparados químicos (REACH), por el que se crea la Agencia Europea de Sustancias y Preparados Químicos [25]. Por otro lado, el 14 de junio de 2011 entró en vigor el Reglamento (CE) n° 1107/2009 [26] del Parlamento Europeo y del Consejo, relativo a la comercialización de productos fitosanitarios y por el que se derogan las Directivas 79/117/CEE y 91/414/CEE del Consejo. Este Reglamento establece las normas aplicables a la autorización de productos fitosanitarios respecto a su presentación comercial, comercialización, utilización y control, reguladas hasta el momento por la Directiva 91/414/CEE. Como novedad, se puede destacar la división de Europa en 3 zonas (norte, centro y sur), a fin de agilizar el proceso de autorización de materias activas nuevas y aumentar la disponibilidad de productos fitosanitarios para los productores. Además, sólo se aprobarán las sustancias activas que estén incluidas en una lista positiva y que cumplan los criterios establecidos en el apartado 2 y 3 del Anexo II del Reglamento (CE) 1107/2009 [26]. Estos criterios hacen referencia a los efectos sobre la salud humana y medioambiental, métodos científicos disponibles, eficacia, efectos acumulativos y 17

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

sinérgicos, entre otros. Sin embargo, el sector agrario ha expuesto su preocupación por esta normativa, ya que puede llevar a la eliminación de un elevado número de productos fitosanitarios, principalmente insecticidas, importantes en la producción hortofrutícola mediterránea. En este ámbito, recae sobre la industria la determinación del MRL del principio activo que se desea comercializar, en base a un meticuloso estudio en el que se demuestre que no tiene ningún efecto nocivo para el ser humano y el medioambiente, entre otros requisitos. La solicitud de determinación de MRL se presenta para su evaluación ante el Estado miembro en cuyo territorio vaya a ser comercializado el producto por primera vez. Los MRLs se fijan siguiendo el principio ALARA “tan bajo como sea razonablemente posible”, es decir, aplicando un principio de minimización, pero a un nivel de concentración que garantice un control adecuado en la determinación analítica. El Reglamento (CE) nº 396/2005 [7], que modifica la Directiva 91/414/CEE del Consejo, fija la cantidad máxima autorizada de residuos de plaguicidas que pueden encontrarse en los productos de origen animal o vegetal destinados al consumo humano. Este Reglamento posee diversos anexos y está en continua actualización/modificación, encontrándose

la

información

actualizada

en

la

página

Web

de

la

UE,

http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/index.cfm [24]:

El Anexo I del Reglamento (CE) nº 396/2005 recoge el listado de todos los productos para los que se ha fijado un MRL nacional o comunitario, así como los productos en relación con los cuales se puede aplicar un MRL armonizado.

El Anexo II contiene la lista de los MRLs específicos para los productos incluidos en el Anexo I, en las diferentes combinaciones sustancia/producto. Estos MRLs ya estaban armonizados a nivel europeo en las Directivas 86/362/CEE, 86/363/CEE y 90/642/CEE, por lo que realmente no aportan un cambio sustancial respecto a lo que se encontraba vigente previamente.

El Anexo III recoge una lista de sustancias para las que hay establecido un MRL con carácter temporal. Estos MRLs han sido establecidos previamente a 18

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

nivel nacional en alguno de los estados miembros, pero requiere una mayor evaluación e investigación de la sustancia antes de decidir si se introduce en el Anexo II. La entrada en vigor el 1 de septiembre de 2008 del Anexo III del Reglamento (CE) nº 396/2005, por el que se fijan los MRL temporales, permitió la homogeneización de la legislación en materia de residuos de plaguicidas en la UE, y ayudó a reducir aún más las barreras comerciales en la misma.

El Anexo IV recoge una lista de sustancias para las que, por su inocuidad o forma de aplicación, no se requieren la fijación de MRLs. En el caso de que una combinación sustancia/producto no tenga fijado un MRL específico en el Reglamento (CE) nº 396/2005, se considerará que su MRL es 0,01 mg/kg, con excepción de las sustancias fijadas en el Anexo V.

Finalmente indicar que el Anexo V recoge las combinaciones sustancia/producto para las que se ha fijado un límite de detección inferior a 0,01 mg/kg; el Anexo VI indica los factores de concentración o de dilución específicos para procesos de transformación de productos vegetales o productos enumerados por la Comisión, y el Anexo VII trata sobre algunas sustancias utilizadas en poscosecha para las que se precisan MRLs superiores a los fijados en los Anexos II y III [27]. La Tabla 1.2 muestra la legislación de la UE más relevante en materia de residuos de plaguicidas. Tabla 1.2. Legislación de la UE más relevante en materia de residuos de plaguicidas. Normativa

Objeto

Campo de aplicación

Directiva 91/414/CEE

Relativa a la comercialización de productos fitosanitarios, cuyo objetivo consiste en prevenir los riesgos en su origen mediante un procedimiento muy completo de determinación del riesgo de cada sustancia activa y de los productos que la contengan antes de que puedan ser autorizados para su comercialización y uso

Comercialización

Directiva 2002/63/CE

Se establecen los métodos comunitarios de muestreo para el control oficial de residuos de plaguicidas en los productos de origen vegetal y animal y se deroga la Directiva 79/700/CEE

Muestreo

Reglamento (CE) nº 178/2002

Por el que se establecen los principios y los requisitos generales de la legislación alimentaria, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y se fijan procedimientos relativos a la seguridad alimentaria

Seguridad alimentaria

19

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

Normativa

Objeto

Campo de aplicación

Comunicación de la Comisión al Parlamento Europeo, COM(2004) 587

Posición común adoptada por el Consejo con vistas a la adopción del Reglamento del Parlamento Europeo y del Consejo relativo a los límites máximos de residuos de plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal, y que modifica la Directiva 91/414/CEE del Consejo

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 396/2005

Relativo a los límites máximos de residuos de plaguicidas en alimentos y piensos de origen vegetal y animal y que modifica la Directiva 91/414/CEE del Consejo

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 178/2006

Modifica el Reglamento (CE) nº 396/2005 del Parlamento Europeo y del Consejo con vistas a establecer el anexo I que incluye la lista de alimentos y piensos a los que se aplican contenidos máximos de residuos de plaguicidas

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 149/2008

Se modifica el Reglamento (CE) nº 396/2005 del Parlamento Europeo y del Consejo mediante el establecimiento de los anexos II, III y IV que estipulan límites máximos de residuos para los productos que figuran en el anexo I de dicho Reglamento

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 839/2008

Modifica el Reglamento (CE) nº 396/2005 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo que se refiere a los anexos II, III y IV relativos a límites máximos de residuos de plaguicidas en el interior o en la superficie de determinados productos

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 1213/2008

Relativo a un programa comunitario plurianual coordinado de control para 2009, 2010 y 2011 destinado a garantizar el respeto de los límites máximos de residuos de plaguicidas en los alimentos de origen vegetal y animal o sobre los mismos, así como a evaluar el grado de exposición de los consumidores a estos residuos

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 915/2010

Relativo a un programa plurianual coordinado de control de la Unión para 2011, 2012 y 2013 destinado a garantizar el respeto de los límites máximos de residuos de plaguicidas en los alimentos de origen vegetal y animal o sobre los mismos y a evaluar el grado de exposición de los consumidores a estos residuos

Límite máximo de residuos

1.2.1.2

Residuos de medicamentos veterinarios

Según la Directiva 2001/82/CE [28] medicamento veterinario es “toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales. Se considerarán también medicamentos veterinarios todas las sustancias o composiciones que puedan administrarse al animal con el fin de establecer un diagnóstico médico o de restablecer, corregir o modificar las funciones fisiológicas del animal.” Estos medicamentos se pueden presentar como especialidades farmacéuticas, incorporados a un pienso medicado o a una premezcla medicamentosa, como medicamento veterinario inmunológico o como medicamento veterinario homeopático [28]. Tanto los Estados Unidos, a través de la FDA [29], como la UE, a través del 20

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

Reglamento 37/2010 [30], han regulado el uso de medicamentos veterinarios. El factor a tener en cuenta es que, en materia de estos compuestos, las regulaciones tampoco están armonizadas a nivel mundial. De hecho, el número de agentes antimicrobianos aprobados por la FDA es pequeño en comparación con el número de compuestos incluidos en el Reglamento 37/2010 del Consejo de la UE [30]. A nivel europeo, el Reglamento (CE) nº 726/2004 [31] del Parlamento Europeo y del Consejo, de 31 de marzo de 2004, establece los procedimientos para la autorización de los medicamentos veterinarios y además crea la Agencia Europea del Medicamento (EMA) [32]. En este contexto, ningún medicamento veterinario podrá ser administrado a los animales sin que se haya concedido la autorización de comercialización, conforme a la Directiva 2001/82/CE [28], y además esté previamente incluido en el Cuadro 1 del Anexo del Reglamento (UE) 37/2010 [30], asegurándose así la fijación del MRL correspondiente. Entre otros requisitos, recae sobre las compañías farmacéuticas la determinación del MRL de la materia activa que desea comercializar, en base a un exhaustivo estudio toxicológico, farmacológico, de límites de seguridad, de tasa de eliminación metabólica de sus residuos, así como el establecimiento de un método analítico para su detección. Además, los MRLs se establecerán para cada especie (p.ej., lubina, dorada, etc.) y para cada parte animal (p.ej., riñón, carne, piel) estudiada, presentando la solicitud de determinación de MRL a la EMA. El Reglamento (CE) nº 1831/2003 [33] del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de septiembre de 2003 permitía el uso de medicamentos veterinarios como aditivos para piensos hasta el 1 enero de 2006. El problema surge cuando en algunos terceros países se sigue autorizando la aplicación de algunos de esos compuestos, como es el caso de los Estados Unidos, donde la FDA autoriza y regula su utilización [34]. Para controlar los residuos en productos de origen animal procedentes de terceros países, y de acuerdo con la Directiva 96/23/CE [35], sólo se pueden importar productos de aquellos países incluidos en una lista provisional, cuyas medidas de control de residuos garanticen un nivel equivalente a los planes de control de los países miembros.

21

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

El Anexo I de la Directiva 96/23/CE sobre alimentos de origen animal realiza una clasificación de todos los residuos veterinarios en dos categorías: A y B. La categoría A, que se subdivide en 6 subcategorías (A1-A6), recoge las sustancias de uso prohibido por la UE en animales destinados al consumo humano. La categoría B, recoge las materias activas autorizadas para su uso en animales destinados al consumo humano (sustancias incluidas en el Cuadro 1 del Anexo del Reglamento (EU) 37/2010) [30]. Sin embargo, conviene indicar que existen algunas sustancias prohibidas por la UE para su uso en animales destinados al consumo humano, que no figuran en la categoría A, como es el caso del verde de malaquita (entre otros), y para el que se han fijado MRPLs [21], como se ha indicado previamente. Actualmente, el Reglamento (CE) nº 470/2009 [36] representa la normativa por la que se establecen procedimientos comunitarios para la fijación de los MRLs de las sustancias farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal. De forma complementaria al mencionado Reglamento, se ha publicado el Reglamento (EU) nº 37/2010 [30], el cual sustituye los Anexos I, II, III y IV del Reglamento (CEE) 2377/90 [37] por un único Anexo con dos cuadros, Cuadro 1 y Cuadro 2. El Cuadro 1 constituye un listado de todas las sustancias farmacológicamente activas autorizadas en cada especie animal, clasificadas por orden alfabético, incluyendo aquellas para las que no es necesario fijar un MRL (vitaminas, óxido de zinc, etc…), así como los principios activos homeopáticos. El Cuadro 2 constituye el listado de las sustancias farmacológicamente activas prohibidas: Aristolochia spp. y sus formulaciones, cloranfenicol,

cloroformo,

clorpromazina,

colchicina,

dapsona,

dimetridazol,

metronidazol, nitrofuranos (incluida furazolidona) y ronidazol [30]. Cuando por motivos de control sea necesario conocer el nivel de determinadas sustancias para las que no se ha establecido un MRL en productos alimenticios de origen animal importados o comercializados, el Reglamento (CE) 470/2009 [36] ha establecido el denominado valor de referencia a efectos de intervención. Dicho valor de referencia representa la mínima concentración de residuo que pueda cuantificarse en una muestra con un método validado en un laboratorio de control oficial. Finalmente, en la Tabla 1.3 se muestra la legislación de la UE más relevante en materia de medicamentos veterinarios.

22

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

Tabla 1.3. Marco normativo más relevante de la UE en materia de medicamentos veterinarios Normativa

Objeto

Campo de aplicación

Reglamento (CEE) nº 2377/90

Por el que se establece un procedimiento comunitario de fijación de los límites máximos de residuos de medicamentos veterinarios en los alimentos de origen animal

Limite máximo de residuos

Directiva 90/167/CEE

Por la que se establecen las condiciones de preparación, de puesta en el mercado y de utilización de los piensos medicados en la Comunidad

Piensos medicados

Directiva 96/22/CE

Por la que se prohíbe utilizar determinadas sustancias de efecto hormonal y tireostático y sustancias β-agonistas en la cría de ganado y por la que se derogan las Directivas 81/602/CEE, 88/146/CEE y 88/299/CEE

Prohibición de sustancias

Directiva 96/23/CE

Relativa a las medidas de control aplicables respecto de determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos y por la que se derogan las Directivas 85/358/CEE y 86/469/CEE y las Decisiones 89/187/CEE y 91/664/CEE

Monitorización de sustancias

Decisión 97/747/CE

Por la que se fijan los niveles y frecuencias de muestreo previstas en la Directiva 96/23/CE del Consejo, con vistas al control de determinadas sustancias y sus residuos en determinados productos animales

Muestreo

Directiva 97/78/CE

Por la que se establecen los principios relativos a la organización de controles veterinarios de los productos que se introduzcan en la Comunidad procedentes de países terceros

Control de productos de terceros países

Decisión 98/179/CE

Por la que se fijan normas específicas relativas a la toma de muestras oficiales para el control de determinadas sustancias y sus residuos en los animales vivos y sus productos

Muestreo

Directiva 2001/82/CE

Por la que se establece un código comunitario sobre medicamentos veterinarios

Medicamentos veterinarios

Decisión 2002/657/CE

Por la que se aplica la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados

Métodos analíticos e interpretación de resultados

Reglamento (CE) nº 178/2002

Por el que se establecen los principios y los requisitos generales de la legislación alimentaria, se crea la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y se fijan procedimientos relativos a la seguridad alimentaria

Seguridad alimentaria

Directiva 2003/74/CE

Que modifica la Directiva 96/22/CE del Consejo por la que se prohíbe utilizar determinadas sustancias de efecto hormonal y tireostático y sustancias β-agonistas en la cría de ganado

Prohibición de sustancias

Reglamento (CE) nº 1831/2003

Sobre los aditivos en la alimentación animal

Aditivos en alimentos

Decisión 2003/181/CE

Por la que se modifica la Decisión 2002/657/CE en cuanto al establecimiento de límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL) para determinados residuos en alimentos de origen animal

Limites mínimos de funcionamiento exigidos

23

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

Normativa

Objeto

Campo de aplicación

Reglamento (CE) nº 726/2004

Por el que se establecen procedimientos comunitarios para la autorización y el control de los medicamentos de uso humano y veterinario y por el que se crea la Agencia Europea del Medicamento

Autorización y control de medicamentos

Reglamento (CE) nº 882/2004

Sobre los controles oficiales efectuados para garantizar la verificación del cumplimiento de la legislación en materia de piensos y alimentos y la normativa sobre salud animal y bienestar de los animales

Control oficial de alimentos y piensos

Reglamento (CE) nº 183/2005

Por el que se fijan requisitos en materia de higiene de los piensos

Higiene de piensos

Decisión 2005/34/CE

Por la que se establecen normas armonizadas para las pruebas de detección de determinados residuos en productos de origen animal importados de terceros países

Control de productos de países terceros

Reglamento (CE) nº 776/2006

Por el que se modifica el anexo VII del Reglamento (CE) no 882/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo relativo a los laboratorios comunitarios de referencia

Laboratorios comunitarios de referencia

Directiva 2006/130/CE

Por la que se aplica la Directiva 2001/82/CE del Parlamento Europeo y del Consejo en cuanto al establecimiento de criterios de excepción respecto al requisito de prescripción veterinaria para determinados medicamentos veterinarios destinados a animales productores de alimentos

Excepciones en prescripciones de medicamentos veterinarios

Reglamento (CE) nº 470/2009

Por el que se establecen procedimientos comunitarios para la fijación de los límites de residuos de las sustancias farmacológicamente activas en los alimentos de origen animal, se deroga el Reglamento (CEE) Nº 2377/90 del Consejo y se modifican la Directiva 2001/82/CE del Parlamento Europeo y del Consejo y el Reglamento (CE) Nº 726/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo

Limite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 152/2009

Por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los piensos

Reglamento (UE) nº 454/2010

Sobre medidas transitorias con arreglo al Reglamento (CE) Nº 767/2009 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo referente a las disposiciones relativas al etiquetado de los piensos

Etiquetado de piensos

Reglamento (CE) nº 37/2010

Relativo a las sustancias farmacológicamente activas y su clasificación por lo que se refiere a los límites máximos de residuos en los productos alimenticios de origen animal

Limite máximo de residuos

1.2.1.3

Muestreo, métodos analíticos e interpretación de resultados

Hidrocarburos aromáticos policíclicos

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) son un grupo de compuestos orgánicos con dos o más anillos aromáticos fusionados, que se encuentran ampliamente en el medio ambiente, como resultado de la combustión incompleta de la materia orgánica, y que pueden ser detectados en distintas matrices alimentarias. Muchos de estos compuestos han demostrado tener propiedades genotóxicas y carcinogénicas [38]. 24

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

El benzo(a)pireno es uno de los PAHs con propiedades carcinogénicas y se ha estado utilizando como marcador exclusivo de la presencia y el efecto de los PAHs cancerígenos en los alimentos [38]. Sin embargo, en 2008, la Comisión Técnica Científica de Contaminantes de la Cadena Alimentaria (Comisión CONTAM) de la EFSA dictaminó que el benzo(a)pireno no es un marcador adecuado de la presencia de PAHs en los alimentos [39], obligando así a modificar el Reglamento (CE) nº 1881/2006 [40], vigente hasta entonces. Se concluyó finalmente que se debían introducir nuevos contenidos máximos para la sumatoria de cuatro PAHs específicos (PAH4)  [benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno y criseno] y debe mantenerse un contenido máximo independiente para el benzo(a)pireno. El Reglamento (EU) nº 835/2011 [39], que modifica el Reglamento (CE) 1881/2006 en lo que respecta al contenido máximo de PAHs en los productos alimenticios, empezó a aplicarse a partir del 1 de septiembre de 2011. El nuevo Reglamento establece en diversos alimentos, MRLs entre 1 y 6 µg/kg para el benzo(a)pireno y entre 1 y 35 µg/kg para la suma de benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno y criseno [39]. Para el caso especifico del aceite de oliva, objeto de análisis en una parte de la presente Tesis Doctoral, los MRLs establecidos son de 2 µg/kg para el benzo(a)pireno y de 10 µg/kg para la suma de benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno y criseno [39]. A modo de resumen, la Tabla 1.4 muestra la legislación de la UE más relevante en materia de PAHs. Tabla 1.4. Marco normativo más relevante de la UE en materia de PAHs Acto

Aclaración

Campo de aplicación

Reglamento (UE) nº 208/2005

Por el que se modifica el Reglamento (CE) nº 466/2001 en lo relativo a los hidrocarburos aromáticos policíclicos

Límite máximo de residuos

Reglamento (CE) nº 1881/2006

Por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios

Límite máximo de residuos

Reglamento (UE) nº 835/2011

Que modifica el Reglamento (CE) nº 1881/2006 por lo que respecta al contenido máximo de hidrocarburos aromáticos policíclicos en los productos alimenticios

Límite máximo de residuos

Reglamento (UE) nº 836/2011

Por el que se modifica el Reglamento (CE) 333/2007 por el que se establecen los métodos de muestreo y análisis para el control oficial de los niveles de plomo, cadmio, mercurio, estaño inorgánico, 3-MCPD y benzo(a)pireno en los productos alimenticios.

Muestreo

25

Capítulo 1. Introducción general

1.2.2

Marco normativo

CALIDAD ALIMENTARIA El marco normativo referido a calidad alimentaria es escaso y en referencia a

algunos aspectos concretos, como podría ser el contenido de ácidos orgánicos (ácido cítrico o ácido málico) en frutas y vegetales, es inexistente. Sin embargo, recientemente se han armonizado los reglamentos sobre el contenido de vitaminas, entre las que se incluye la vitamina C, en complementos alimenticios y alimentos enriquecidos, con el objetivo de garantizar el funcionamiento eficaz del mercado interior, al tiempo que se proporciona un alto nivel de protección del consumidor. Tanto la Directiva 2002/46/EC [41] sobre complementos alimenticios, como el Reglamento 1925/2006 [42] sobre la adición de vitaminas y minerales, proporcionan entre otros aspectos, la fijación de cantidades máximas de vitaminas y minerales en estos alimentos, teniendo en cuenta los niveles máximos tolerables, establecidos por evaluación científica del riesgo e ingesta de la población de referencia. Los niveles de ingesta máxima tolerable de vitaminas y minerales han sido revisados por el comité Científico sobre la Alimentación Humana (SCF) y la EFSA [43]. Por otro lado, las disposiciones y definiciones generales sobre etiquetado se recogen en la Directiva 2000/13/CE, aunque los reglamentos antes referidos también proporcionan algunas normas sobre el etiquetado, presentación y publicidad. En referencia a los alimentos infantiles, las Directivas sobre preparados para lactantes y preparados de continuación (2006/141/CE) [44], y procesados a base de cereales y alimentos infantiles (2006/125/CE) [45], incluyen las listas de sustancias nutritivas que pueden añadirse a los alimentos destinados a lactantes y niños de corta edad entre las cuales incluyen vitaminas como la vitamina C. También establece los límites máximos y la composición básica de los nutrientes que se deben añadir. Por ejemplo, en los zumos de fruta, néctares o zumos de verdura, el contenido final de vitamina C en el producto no deberá ser inferior a 25 mg/100 g. Desde un punto de vista comercial, la “Guía administrativa para la solicitud de evaluación de seguridad de sustancias añadidas con fines nutricionales específicos en la producción de alimentos” [46], editada por la Dirección General de Salud y Consumidores (D.G. SANCO) de la UE, proporciona información detallada sobre el procedimiento que debe seguirse para la presentación de solicitudes con el objetivo de

26

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

que las sustancias que se desean añadir al alimento sean consideradas para su inclusión en la lista de sustancias permitidas. 1.2.3

MÉTODOS DE ANÁLISIS El marco normativo para garantizar la Seguridad Alimentaria es determinante en

el desarrollo de un método analítico. La normativa establece en la mayoría de los casos: (i) el plan de muestreo, (ii) los MRLs para los contaminantes y matrices en cuestión y (iii) los criterios de aceptación de los parámetros de validación de los métodos analíticos. Todo ello se ha de tener en cuenta en las etapas de desarrollo y validación de los métodos analíticos. La Guía Sanco, Documento nº SANCO/12495/2011 [47] y la Decisión 2002/657/CE [48] son probablemente los documentos clave de la legislación consultados por laboratorios de análisis y control de la seguridad alimentaria. Estos documentos incluyen definiciones y descripciones de cómo estimar los parámetros de validación, estableciendo los criterios para la aceptación de los valores de dichos parámetros, así como los requerimientos en la identificación y detección mediante MS. De otro lado se encuentran los métodos bioanalíticos. El bioanálisis es la medida de un compuesto en matrices biológicas, tales como las muestras de plasma, orina y tejidos [49]. En los últimos años ha habido una amplia discusión sobre la validación de los métodos bioanalíticos. Antes de 1990, año en que la Asociación Americana de Científicos Farmacéuticos (AAPS)/FDA inició la primera de una serie de conferencias sobre validación y armonización de métodos bioanalíticos [50], había una enorme falta de uniformidad en este campo. En el año 2001, la FDA publica la Guía para la industria sobre la validación de métodos bioanalíticos [49]. Sin embargo, la importante evolución y expansión de las técnicas utilizadas en los métodos bioanalíticos hizo necesaria una revisión. Ésta se acometió en 2006, en la tercera conferencia AAPS/FDA, donde se actualizaron los aspectos relativos a la validación de los métodos bioanalíticos, centrándose en gran medida en las técnicas cromatográficas y se originó el libro blanco de validación de métodos bioanalíticos [51]. Por otro lado, debido a la reconocida falta de orientación en Europa sobre la validación de los métodos de bioanálisis, en el año 2008, la EMA publica un documento sobre este tema [52], basado en las indicaciones de la FDA. Esta iniciativa ha fomentado la estandarización mundial de las directrices sobre la validación de métodos bioanalíticos, que actualmente está en

27

Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

curso, aunque todavía hay problemas por las diferentes interpretaciones sobre la metodología a aplicar. Sin embargo, al llevar a cabo una determinación analítica, en los ámbitos de control de la seguridad alimentaria, calidad alimentaria y control biológico, es necesario responder a una serie de cuestiones, tales como: ¿está el analito de interés presente en la muestra?, que se responde mediante el análisis cualitativo, o ¿cuánto analito hay en la muestra?, que se responde mediante el análisis cuantitativo. Estos tipos de análisis son importantes, ya que no se puede cuantificar un analito sin tener la certeza de que realmente se trata del compuesto de interés y no de un interferente de la muestra o de una señal errónea por parte del instrumento. A tal fin, es de crucial importancia la validación del método analítico en la matriz que se ha de aplicar, ya que la diferencia entre matrices puede influir tanto en el proceso de extracción como en el de determinación analítica, incrementando la posibilidad de generar falsos positivos o falsos negativos. En consecuencia, la confirmación de los resultados es un aspecto fundamental en cualquier tipo de análisis. En este ámbito, un “método de identificación” proporciona información parcial del analito a identificar, mientras que un “método de confirmación” proporciona información total o complementaria que permite identificar y, en su caso, cuantificar de manera inequívoca la sustancia al nivel de interés [48]. Existen diferentes guías sobre métodos de confirmación, como las emitidas por el Codex Alimentarius [53], pero los documentos que se consideran de referencia y que son ampliamente adoptados por los organismos de control europeos son la Guía Sanco, Documento nº SANCO/12495/2011 [47], enfocada principalmente al análisis de residuos de plaguicidas en alimentos y piensos, y de forma más general la Decisión 2002/657/CE [48], relativa al funcionamiento de los métodos analíticos y la interpretación de los resultados. De acuerdo con esta Directiva, los métodos de confirmación para residuos y contaminantes orgánicos deben incluir información estructural del analito, por lo que los métodos que utilizan sólo el análisis cromatográfico, prescindiendo de la detección mediante MS, no se consideran métodos confirmatorios. Además, el acoplamiento de detectores selectivos, como el detector de diodos en fila (DAD) o el de fluorescencia a HPLC, sólo ofrecen una especificidad

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Capítulo 1. Introducción general

Marco normativo

limitada, y no son adecuados por si solos como métodos de confirmación. Por esa razón, con el fin de evitar la presencia de falsos positivos o falsos negativos, la Guía Sanco, en su Documento No. SANCO/12495/2011 [47], recomienda el uso de sistemas de detección específicos como MS. Así, se señala que la combinación cromatografía de gases (GC) o LC con MS es una poderosa herramienta de confirmación de analitos, que aporta de forma simultánea datos de: (i) tiempos de retención, (ii) relación masa/carga (m/z) y (iii) abundancia iónica [47]. El grado de selectividad, y por tanto también la confianza en la identificación, varía en función de los tipos y modos de trabajo de los analizadores de MS. La Tabla 1.5 muestra los requisitos establecidos por la Guía Sanco para la identificación de un analito en función de los tipos y modos de trabajo de los detectores de MS. Tabla 1.5. Requerimientos de identificación para residuos de plaguicidas en distintos tipos de espectrómetros de masas (EU SANCO/12495/2011) [47] MODO MS

MS simple (resolución de masas estándar)

MS simple (alta resolución/alta exactitud de masa)

MS/MS

Sistemas típicos (ejemplos)

Cuadrupolo, Trampa iones, Tiempo de vuelo (TOF)

TOF, Orbitrap, FTMS, Sector magnético

Triple Cuadrupolo Trampa de iones, MS híbridos (ej: QqTOF, Q-Trap)

Adquisición

Barrido completo, Rango de m/z limitado, Monitorización del ion seleccionado (SIM)

Barrido completo, Rango m/z limitado, Monitorización del ión seleccionado (SIM)

Monitorización de reacciones seleccionadas/múltiples (SRM/MRM), Barrido completo Espectro ion-producto

Requerimientos para la identificación

≥ 3 iones diagnóstico, (preferiblemente incluyendo el ión molecular)

≥ 2 iones diagnóstico (preferiblemente incluyendo el ión molecular) Exactitud de masa: < 5 ppm Al menos un fragmento de ión

≥ 2 iones producto

Con respecto a la abundancia iónica, tanto la Decisión 2002/657/CE [48] como la Guía SANCO/12495/2011 [47] establecen las mismas tolerancias máximas de intensidades relativas de iones en diferentes técnicas de MS. La Tabla 1.6 muestra las recomendaciones de tolerancia máxima permitidas para las técnicas de MS empleadas en esta Tesis Doctoral, teniendo en cuenta que tolerancias más grandes pueden dar lugar a un mayor porcentaje de falsos positivos, mientras que tolerancias más pequeñas aumentan la probabilidad de falsos negativos [54].

29

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

Tabla 1.6. Tolerancias máximas permitidas de intensidades relativas de iones en diversas técnicas de MS Intensidad relativa (% del pico de base)

LC-MS, LC-MSn (relativos)

> 50 %

± 20 %

> 20 % – 50 %

± 25 %

> 10 % – 20 %

± 30 %

≤ 10 %

± 50 %

1.3 TÉCNICAS DE TRATAMIENTO DE MUESTRA DE LOS COMPUESTOS OBJETO DE ESTUDIO La etapa de tratamiento de muestra normalmente supone la mayor barrera en el análisis de compuestos orgánicos, sobre todo en muestras complejas como las alimentarias y biológicas, requiriendo con frecuencia procesos muy laboriosos que consumen demasiado tiempo y grandes volúmenes de disolventes orgánicos, que generalmente suelen ser tóxicos [55]. Idealmente, un método de extracción debería ser rápido, sencillo, eficiente, respetuoso con el medio ambiente y de bajo coste. Por otro lado, el extracto obtenido debería tener un grado de limpieza y concentración tal que posibilite el análisis directo del mismo. La elección del método de tratamiento de muestra se debe realizar atendiendo a los siguientes criterios [56]:

Naturaleza química de los compuestos.

Estado físico en el que se encuentre la muestra.

Analitos a determinar.

Niveles de detección necesarios.

Método de análisis del que se dispone. Desde un punto de vista general, la mayoría de los procedimientos de extracción implican las siguientes etapas: (1) Homogenización de la muestra. Transforma la muestra en una unidad representativa y homogénea del total de la misma, además de adquirir una forma que facilita la extracción de los analitos por el aumento del área superficial de la misma,

30

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

mediante la reducción del tamaño de partícula. (2) Extracción de los analitos de interés de la matriz. La extracción depende de la polaridad de los analitos, así como del tipo de matriz de la muestra. Normalmente para muestras sólidas el proceso implica la adición de un disolvente orgánico y/o disoluciones acuosas adecuadas, utilizando un homogeneizador, batidora o baño de ultrasonidos [56], aunque también se puede recurrir a otro tipo de dispositivos, como los empleados en la extracción Soxhlet [57], extracción con líquidos presurizados (PLE) [58-61], extracción asistida por microondas (MAE) [60-63], extracción con fluidos supercríticos (SFE) [64-67] o dispersión de matriz en fase sólida (MSPD) [68-72]. En el caso de muestras líquidas la extracción en fase sólida (SPE) [73,74] está entre las técnicas más utilizadas. (3) Proceso de limpieza. En esta etapa se eliminan el mayor número de interferencias posible. Con este fin, se pueden emplear diferentes técnicas, como por ejemplo la SPE [73,74]. (4) Ocasionalmente, es necesario un tratamiento de muestra adicional como podría ser la dilución del extracto de muestra, para evitar la saturación de la columna cromatográfica o del detector o minimizar el efecto matriz; la evaporación del extracto, para conseguir mayores factores de preconcentración; un cambio del disolvente para adaptar la disolución del extracto al sistema de análisis que se pretende utilizar; o una etapa de filtración o centrifugación. Sin embargo, las tendencias actuales están orientadas hacia la simplificación de la etapa de tratamiento de muestra mediante la aplicación de métodos genéricos de extracción, que permitan la extracción simultánea de un gran número de compuestos de diversas matrices. En este sentido se encuentran, entre otras, las estrategias de preparación de muestra tipo QuEChERS (rápido, fácil, barato, efectivo, robusto y seguro) [75] y los denominados “dilute-and-shoot” (diluir e inyectar) [76] que parten de la base de una SLE seguida de una etapa de limpieza opcional y posterior inyección. En todo caso, para minimizar lo máximo posible la etapa de extracción y limpieza de los extractos, se recomienda el uso de detectores selectivos, como son los espectrómetros de masas, si es posible, acoplados con técnicas cromatográficas, ya que

31

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

el número de interferentes disminuye drásticamente debido al proceso de separación cromatográfica y la selectividad proporcionada por los distintos analizadores de MS disponibles en el mercado. 1.3.1

TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN El estado físico de la muestra es lo primero a considerar al planificar la extracción.

Para el caso de muestras sólidas, la extracción puede realizarse con disolventes orgánicos [77,78] o acuosos [79], fluidos supercríticos (SFE) [55,64-67,80-84], MSPD [68-72], PLE [58-61] y MAE [60,62,63], mientras que para las líquidas, en función de la concentración de la sustancia a determinar se puede llevar a cabo una inyección directa o una dilución de la misma para minimizar el efecto matriz, aunque para la determinación de bajas concentraciones (< 1 µg/kg) se suele emplear la extracción líquido-líquido (LLE) [85] o SPE [86], que permiten la concentración de los analitos. Técnicas de extracción con disolventes En el caso de muestras sólidas, la extracción con disolventes, denominada SLE, sigue siendo una de las técnicas más utilizadas en el tratamiento de muestras de rutina [87], principalmente por su simplicidad, robustez, eficiencia, y por la calidad de los resultados obtenidos. El proceso se basa en poner en contacto la muestra con un disolvente adecuado con el fin de que los analitos se transfieran hacia dicho disolvente. La eficacia de la extracción depende de la afinidad de los analitos por las dos fases en juego, disolvente y muestra. Entre las técnicas de SLE más utilizadas para la extracción de compuestos orgánicos

de

muestras

alimentarias,

se

pueden

destacar:

extracción

con

agitación/homogeneización y la extracción asistida por ultrasonidos (SAE), siendo la elección del disolvente muy importante, ya que generalmente determina la selectividad de la extracción. Los disolventes más empleados son acetona [88], diclorometano [89], acetonitrilo [90,91] o acetato de etilo [92-94] y normalmente depende de la naturaleza del analito a extraer. Así, para compuestos polares como ácidos orgánicos o vitamina C, se suelen utilizar disoluciones alcohólicas [95,96], ácidos débiles [97] o metanol [98100], mientras que para compuestos más apolares se suele utilizar acetonitrilo [77,98] o acetato de etilo [101,102].

32

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

Una vez seleccionado el disolvente, a continuación se lleva a cabo la extracción empleando diversas alternativas. Por ejemplo, se puede utilizar un proceso de agitación/homogeneización, mediante la adición del disolvente orgánico o acuoso a la muestra, y agitación de la mezcla para favorecer la transferencia efectiva del analito de la muestra al disolvente. Se suele realizar utilizando homogeneizadores de alta velocidad como Ultraturrax® o Polytron®, o mediante la agitación con brazos rotores. Este método es especialmente efectivo cuando el analito es muy soluble en el disolvente. La técnica de agitación/homogenización ha sido y sigue siendo ampliamente aplicada y presenta un elevado potencial en muy diversos ámbitos. Uno de ellos es el análisis de contaminantes en alimentos, pudiéndose tomar como ejemplo la determinación de plaguicidas en frutas realizada por Botero-Coy et al. [77] (método multirresiduo), utilizando para la extracción acetonitrilo con homogeneizador Ultraturrax®, filtración, dilución y posterior inyección directa en el sistema LCMS/MS. Otro ejemplo, es el análisis de medicamentos veterinarios en diferentes tejidos biológicos, como son músculo de cerdo, pescado, carne de ternera, hígado y riñón, empleando en el proceso de extracción un homogeneizador tipo Politron®, realizado por Kaufmann et al. [79]. Después de la extracción de la muestra suele llevarse a cabo una etapa adicional de filtración, centrifugación o sedimentación, para separar sólidos en suspensión. En SAE, la muestra finamente dividida se somete en un disolvente adecuado a radiación ultrasónica en un baño de ultrasonidos. La sonicación aumenta el rendimiento y la velocidad del proceso de extracción [103-105]. Un ejemplo ilustrativo de aplicación de la sonicación se encuentra en el ámbito del análisis de plaguicidas en frutas y vegetales, como se describe en el trabajo de Granby et al. [104], basado en el empleo de esta técnica y la posterior filtración del extracto, para seguidamente ser analizado el mismo mediante LC-MS/MS. La técnica es rápida y, al llevarse a cabo a temperatura ambiente, permite extraer compuestos orgánicos termolábiles. Otro ejemplo en el ámbito alimentario es la extracción de ocho adulterantes en alimentos dietéticos, publicado por Shi et al. [106], empleando una disolución metanólica en un baño de ultrasonidos y centrifugación previa al análisis mediante HPLC-MS/MS, sin necesidad de aplicar ningún proceso de limpieza. Otra característica del uso de SAE es que debido a la sencillez del dispositivo, permite realizar la extracción de un elevado número de

33

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

muestras (>10 muestras) al mismo tiempo, siendo altamente ventajoso en su aplicación en análisis de rutina. Estos procedimientos participan de la actual tendencia hacia la miniaturización y la sencillez de los denominados procedimientos de extracción genéricos, cuyo máximo exponente es el método QuEChERS, acrónimo de los términos ingleses Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe. Este método además de ser rápido, sencillo, barato (uso reducido de reactivos), efectivo (proporcionas buenas recuperaciones para un amplio rango de compuestos), robusto y seguro, tal como indica su nombre en inglés, aúna la etapa de extracción y la de limpieza. Debido a estas ventajas, la técnica se introdujo rápidamente en laboratorios de plaguicidas de la UE [107] y resto del mundo, formando parte de los métodos oficiales de la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC) para la determinación de plaguicidas en frutas y vegetales [108]. Además, el método proporciona gran flexibilidad, lo que facilita la realización de modificaciones del mismo para mejorar la extracción de analitos problemáticos [109], o la extracción en matrices especialmente complejas, como podrían ser las de alto contenido graso [110]. Gracias a todas estas ventajas, hoy en día el método QuEChERS se aplica a todo tipo de analitos (plaguicidas, medicamentos veterinarios, etc.) y en cualquier tipo de alimento, con las salvedades y particularidades de cada caso; además, se ha extendido tanto para su aplicación en GC-MS como en LC-MS [111]. Como ejemplo, en la Figura 1.1 se presentan de forma comparativa las metodologías oficiales que surgieron sobre la base del desarrollo original y que se encuentran en plena vigencia en todo el mundo. Básicamente, el método QuEChERS es un proceso que consta de dos etapas: extracción y limpieza o clean up. En la primera etapa, una pequeña cantidad de muestra (10-15 g) es extraída con un disolvente miscible con el agua, como el acetonitrilo, el acetato de etilo o la acetona, siendo el acetonitrilo el disolvente seleccionado en la metodología QuEChERS. La preferencia hacia el uso de acetonitrilo, y no de acetona o acetato de etilo, es debida a inconvenientes como la imposibilidad de separar la acetona del agua sin el uso de disolventes no polares, o que el acetato de etilo sólo es parcialmente miscible con el agua, lo que provoca dificultades en la separación de los analitos muy polares, y la co-extracción de componentes apolares como los lípidos, que posteriormente habría que eliminar. 34

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

Figura 1.1. Comparación de las metodologías oficiales QuECHERS con el método original, presentado por Lehotay et al. [112]. Seguidamente, se adicionan sales como el cloruro sódico y el sulfato magnésico. La adición de estas sales induce la separación en dos fases y que el analito migre de la fase acuosa a la fase orgánica consiguiéndose recuperaciones aceptables incluso con plaguicidas polares y muy solubles en agua. Además de estas sales, se pueden añadir agentes que regulen el pH como el citrato de sodio o el acetato de sodio para estabilizar plaguicidas de carácter básico, y también patrones internos para minimizar todos los posibles errores que se pueden generar durante el método QuEChERS. Tras la agitación de la muestra, y la centrifugación de la misma para obtener una buena separación de las dos fases, se lleva a cabo la segunda etapa del QuEChERS, es decir el proceso de limpieza de una alícuota de la fase orgánica (fase superior con acetonitrilo, que contiene los analitos de interés). El proceso de limpieza se realiza por medio de un procedimiento llamado extracción en fase sólida dispersiva (DSPE). Aquí, una pequeña cantidad de adsorbente de SPE, generalmente una amina primaria-secundaria (PSA), y MgSO4 anhidro se mezclan con el extracto de la muestra. La DSPE se basa en la metodología de la SPE, pero el adsorbente se añade directamente al extracto, en lugar de pasar el

35

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

extracto por un cartucho relleno con el adsorbente previamente acondicionado, realizándose la limpieza mediante la agitación y centrifugación del extracto. En este procedimiento, el MgSO4 elimina el agua residual, mientras que la PSA, que es un adsorbente de intercambio aniónico débil, elimina diversos ácidos orgánicos como ácidos grasos, pigmentos polares, algunos azúcares y otros componentes de la matriz que pueden formar puentes de hidrógeno [87]. Además de PSA, también se puede adicionar C18 para la eliminación de interferentes no polares como los lípidos y grasas, o carbón grafitizado para la eliminación de esteroles y pigmentos como la clorofila [113]. Finalmente, el sobrenadante se puede analizar directamente o se puede concentrar para redisolverlo en un disolvente adecuado para su análisis. 1.3.2

LIMPIEZA DE LA MUESTRA (CLEAN UP)

Los procesos de extracción difícilmente llegan a ser selectivos, produciéndose con frecuencia la co-extracción de compuestos de la matriz junto con los analitos de interés en el disolvente o mezcla de extracción. En estos casos, se hace necesaria la limpieza de la muestra, viéndose acentuado cuando los analitos se encuentran en concentraciones muy bajas (µg/kg) o cuando se trabaja con muestras complejas como las alimentarias y biológicas. La finalidad de esta etapa es la eliminación de impurezas de los extractos procedentes de la matriz, pudiendo ser un proceso crítico en el análisis de compuestos orgánicos. Las impurezas arrastradas desde la muestra al extracto afectan al proceso cromatográfico, dificultando el análisis, e impidiendo alcanzar límites de detección (LODs) muy bajos, debido al incremento de la relación señal-ruido o al enmascaramiento de la señal del analito. Los interferentes pueden provocar errores analíticos que originen falsos positivos o falsos negativos. Sin embargo, etapas de limpieza excesivamente complejas o largas pueden ser contraproducentes, ya que se puede perder parte del analito de interés durante el proceso. Las técnicas de limpieza tradicionalmente aplicadas han sido LLE [114-116], SPE [73,74] y cromatografia de permeación en gel (GPC) [117-121]. En algunos casos, los procesos de extracción y purificación se pueden llevar a cabo simultáneamente, ya que diversas técnicas de extracción se pueden utilizar también como técnicas de limpieza, como es el caso de la SPE. Por otro lado, es de resaltar que existen técnicas de extracción que son altamente selectivas y que no requieren de ningún proceso de

36

Capítulo 1. Introducción general

Tratamiento de muestra

limpieza o bien requieren una etapa de limpieza muy sencilla. En este sentido, la extracción con disolventes permite en gran número de ocasiones evitar el proceso de limpieza [93,94,122,123], especialmente para extractos de muestras con poca presencia de interferentes de la matriz. Paralelamente, hay que tener en consideración el sistema de detección empleado, ya que de cierta forma puede discriminar entre la señal del analito y la señal de los interferentes. Desde esta perspectiva, la selectividad obtenida cuando la determinación analítica se realiza mediante el empleo de técnicas cromatográficas acopladas a MS, puede reducir o simplificar el proceso de limpieza, de forma que a veces con una simple dilución del extracto para reducir el efecto matriz es suficiente para una correcta determinación de los compuestos.

1.4 TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS DE ANÁLISIS DE LOS COMPUESTOS OBJETO DE ESTUDIO La revisión histórica en el análisis químico destaca por la evolución que han experimentado las técnicas de análisis cromatográfico en las últimas décadas. En tan solo 50 años, se ha incrementado exponencialmente la velocidad, sensibilidad y rendimiento de estas técnicas y de la instrumentación que la acompaña, permitiendo grandes avances tanto en el campo científico como en el industrial. Estos progresos han sido tan efectivos que resulta muy difícil encontrar un laboratorio de análisis moderno que no utilice alguna técnica cromatográfica. Los primeros avances en cromatografía se alcanzaron en GC cuando se acopló con detectores de mayor sensibilidad y selectividad como MS. Además, se automatizaron los procedimientos de tratamiento de muestra, empleando espacio en cabeza (HS), microextracción en fase sólida (SPME) [124,125], así como cromatografía multidimensional o modificaciones de los sistemas de inyección, (inyección de grandes volúmenes, vaporización mediante temperatura programada (PTV), etc…) [126-131]. Con la GC parecía haberse alcanzado la cima en cuanto a las técnicas de separación, hasta la introducción en los años 70 de la HPLC. A partir de ese momento, LC ha experimentado la mayor revolución en Química Analítica en los últimos 40 años [132].

37

Capítulo 1. Introducción general

1.4.1

LC-MS

CROMATOGRÁFIA DE LÍQUIDOS (LC) La aplicación tradicional de GC-MS al análisis de compuestos orgánicos,

especialmente residuos de plaguicidas en muestras alimentarias, se debió a las características de los compuestos analizados, tales como estructuras simples y baja polaridad. Esta técnica presentaba una buena eficiencia en la separación, sensibilidad y capacidad de identificación de los analitos. Sin embargo, en los últimos años se ha experimentado una creciente tendencia en el desarrollo y uso de nuevas materias activas con estructuras más complejas y de mayor polaridad [133]. Estos nuevos analitos más polares proporcionan mejor respuesta mediante LC [134,135], ya que frecuentemente no pueden ser analizados mediante GC o proporcionan una baja sensibilidad. Así, aunque LC y GC son técnicas complementarias, existe una clara tendencia hacia el uso de LC [1]. HPLC es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en laboratorios mundiales durante más de 40 años. Sin embargo, la mejora de la velocidad de análisis y eficiencia de las separaciones ha sido de gran importancia en muchas aplicaciones, como análisis agroalimentario, ambiental, clínico, toxicológico o farmacéutico, a fin de aumentar el número de muestras analizadas por día a través de la reducción de los tiempos de análisis, y disminuyendo en consecuencia los costes del mismo. De esta forma existen diversas estrategias para disminuir el tiempo de análisis:

El método más simple es disminuir la longitud de la columna e incrementar la velocidad de flujo de fase móvil. Sin embargo, esta aproximación puede presentar una disminución en la sensibilidad, debido a que elevadas velocidades de flujo no son compatibles con un rendimiento óptimo, si se emplea MS [136].

Una segunda alternativa es aumentar la temperatura de la columna [137,138], lo que reduce la viscosidad de la fase móvil. La desventaja de este método es la falta de estabilidad de muchos compuestos y del material de la fase estacionaria a altas temperaturas.

Una tercera aproximación consiste en disminuir el tamaño de partícula de la fase estacionaria (< 2 µm), lo que permite una mayor velocidad de análisis

38

Capítulo 1. Introducción general

LC-MS

con una alta eficiencia, así como reducir los tiempos de análisis [139,140]. La utilización de este tipo de fases estacionarias ha dado lugar a lo que se denomina cromatografía de líquidos de ultra eficacia (UHPLC). UHPLC es una de las mejores soluciones para disminuir el tiempo de análisis sin comprometer la eficacia o la resolución [141]. La Figura 1.2 muestra el resultado de la transferencia de un método tradicional de HPLC a un método de UHPLC, siendo esta posibilidad de adaptación otra de las grandes ventajas ofrecidas por UHPLC. Adicionalmente, la Figura 1.2 muestra la mejora conseguida en la separación en cuanto a resolución y velocidad de análisis al comparar HPLC y UHPLC, observando que con esta última se consiguen tiempos de análisis más cortos y una mejora en la resolución y en la anchura de pico, comparado con el sistema tradicional.

Figura 1.2. Cromatograma de la separación de un formulado farmacéutico obtenido mediante HPLC y UHPLC. Imagen adaptada de Guillarme et al. [142]. En función de la naturaleza de la fase estacionaria pueden diferenciarse varios tipos de LC; entre éstos, vamos a centrarnos en LC en fase reversa, ya que la mayoría de aplicaciones de la LC, incluyendo aquellas realizadas en la presente Tesis Doctoral, se

39

Capítulo 1. Introducción general

LC-MS

basan en esta modalidad [143]. Este tipo de cromatografía es idónea para el análisis de analitos polares, e incluso iónicos, si se aplica la formación de pares iónicos. En los últimos años se han desarrollado un elevado número de fases estacionarias con un tamaño de partícula inferior a 2 µm. El material de la fase estacionaria suele ser sílice químicamente modificada, o un material híbrido (“columnas híbridas enlazadas de etilsiloxano/sílica” (BEH)), pudiéndose encontrar diferentes fases estacionarias (C8, C18, ciano, fenilo, etc.). Muchas de estas nuevas fases estacionarias se han desarrollado a fin de mejorar la eficacia de la separación, la estabilidad frente al pH y la temperatura, y obtener selectividades alternativas. Así, la fase estacionaria HILIC (cromatografía de interacción hidrofílica), que bajo un sustrato BEH, está diseñada para retener y separar de forma eficiente compuestos muy polares [141]. HILIC es una alternativa a la cromatografía en fase normal [144] para separar compuestos que son demasiado polares para quedar retenidos en columnas de fase reversa, o incluso para separar compuestos iónicos. Otra forma de incrementar la eficiencia y la velocidad de separación es mediante el uso de partículas superficialmente porosas, como son las columnas disponibles en el mercado bajo las marcas comerciales Halo, Ascentis, Kinetex o Poroshell [142], y que generalmente se basan en un núcleo de sílica sobre la que se deposita una capa porosa homogénea. Esta tecnología fue desarrollada para minimizar la difusión de las moléculas en los poros y se ha utilizado en el análisis de compuestos de bajo peso molecular, permitiendo alcanzar rendimientos similares a UHPLC pero trabajando a presiones típicas de HPLC. En relación con las fases móviles empleadas en la cromatografía en fase reversa, indicar que tienen carácter polar, siendo muy frecuente el uso de combinaciones de agua como fase acuosa (con la adición de una disolución reguladora o ácido/base débil), y de metanol o acetonitrilo como fase orgánica. Una variable importante en la cromatografia en fase reversa es el pH, ya que puede cambiar la estabilidad y selectividad de los compuestos a separar. De hecho, normalmente la selectividad de un compuesto se ve más afectada por variaciones en el pH que por cambios en el modificador orgánico [145]. Se pueden utilizar diversos aditivos, como son disoluciones reguladoras (acetato amónico, formiato amónico y 40

Capítulo 1. Introducción general

hidrogenocarbonato

LC-MS

amónico),

ácidos

(ácido

fórmico,

ácido

acético,

ácido

heptafluoroacético y ácido trifluoroacético) o bases (hidróxido sódico y morfolina) para conseguir un rango de pH de 2 a 11,5 [146]. En general, la mayoría de métodos utilizan disoluciones reguladoras, como son las de ácido fórmico/formiato amónico o ácido acético/acetato sódico, como fase móvil acuosa. Por otro lado, la correcta selección y modificación del pH de la fase móvil presenta otras aplicaciones analíticas, ya que se puede utilizar para controlar la retención de ciertos analitos [147] y para mejorar la separación de mezclas de analitos [148]. Para obtener una sensibilidad óptima, se necesita una correcta elección de los disolventes, pH y aditivos adicionados a la fase móvil. Se debe de tener en cuenta que los aditivos seleccionados, cuando se utiliza una fuente ionización a presión atmosférica (API), deben ser volátiles, para evitar la contaminación de la misma, y facilitar la ionización de los compuestos objeto de estudio. Por otro lado, los disolventes utilizados cuando se aplica ESI deben favorecer la formación de iones en disolución, mostrándose en la Tabla 1.7 los disolventes y aditivos que suelen ser utilizados en API-MS. Tabla 1.7. Disolventes y reactivos aplicados en API-MS Función

Modos de ionización

Disolventes/Reactivos

Ionización positiva

Metanol, etanol, butanol, acetonitrilo, agua, ácido acético*, ácido fórmico*, acetona*, dimetilformamida*, dimetil sulfóxido*, 2metoxietanol*, tetrahidrofurano*, cloroformo, disolventes (hexano, ciclohexano, tolueno) **, CS2**, CCl4**

Ionización negativa

Propanol, isopropanol, acetonitrilo

Ionización positiva

Ácido acético, ácido fórmico, ácido trifluoroacético (TFA), acetato amónico, formiato amónico

Ionización negativa

Hidróxido amónico, acetato amónico, formiato amónico, morfolina

Disolventes

Reactivos para ajustar el pH y/o facilitar la ionización

Reactivos para formar pares iónicos volátiles

Sales de amonio cuaternarias, trietilamina, ácido heptafluorobutírico (HFBA), hidróxido de tetraetil amonio (TEAH) o hidróxido de tetrabutilamónico (TBAH)

Reactivos para facilitar la ionización

Acetato potásico, acetato amónico

*

Disolventes usados a concentraciones menores que el 20 %

**

Disolventes aplicables para APCI pero no para ESI

41

Capítulo 1. Introducción general

1.4.2

LC-MS

ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS) MS es una técnica muy potente y consolidada, que se encuentra implantada en

laboratorios de rutina y de investigación de todo el mundo, especialmente en combinación con técnicas de separación como la cromatografía (tanto GC como LC). La técnica proporciona la especificidad y sensibilidad necesaria para la detección y cuantificación de compuestos en matrices complejas a niveles traza. Por otro lado, el acoplamiento de los sistemas cromatográficos con analizadores de MS representa la combinación ideal debido a la capacidad de identificación, cuantificación y confirmación de los compuestos objeto de análisis mediante este tipo de detección, siendo el recomendado por la UE para el control de residuos y contaminantes orgánicos [48]. 1.4.2.1

Técnicas de introducción e ionización de muestra: Interfases

El acoplamiento del sistema de separación cromatográfico con MS ha permitido avances muy importantes en la identificación y cuantificación de compuestos. Este acoplamiento se realiza mediante una interfase. En el caso de GC dicho acoplamiento fue relativamente sencillo lo que posibilitó su rápido desarrollo. Sin embargo, en el caso del acoplamiento de LC con MS la situación fue más complicada, principalmente debido a dos problemas: 1) La transformación de las moléculas en fase líquida de la fase móvil en iones en fase gaseosa, evitando la degradación térmica de los analitos. 2) La eliminación del exceso de gas y vapores procedentes de la fase móvil antes de entrar en la zona de alto vacío del espectrómetro de masas. Para solventar estos problemas se propusieron diversos diseños, aunque actualmente las interfaces más ampliamente utilizadas y con mayor éxito en el mercado son las que se incluyen dentro de la denominada API, que engloba a todas las técnicas en la que los iones se forman a presión atmosférica [149], y no a alto vacío. Entre ellas, se pueden destacar las técnicas de electronebulización (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI), fotoionización a presión atmosférica (APPI) e ionización a presión atmosférica por láser (APLI). Mientras que las dos primeras son las más comúnmente utilizadas (Tabla 1.8), las dos últimas, APPI y APLI, se emplean para la ionización de analitos de baja polaridad y apolares [150,151]. 42

Capítulo 1. Introducción general

LC-MS

Tabla 1.8. Principales características de las fuentes API Fuentes de ionización a presión atmosférica (API) Características

ESI

APCI

Ionización

En fase líquida (Evaporación iónica)

En fase gas

Analitos

Polares e iónicos

Polaridad intermedia y no iónicos

Peso molecular

Elevado (hasta 100000 Da)

Moderado ( 160.1 192.1 > 132.2 163.0 > 88.0 163.0 > 106.0

30 30 20 20

15 30 10 10

H N

Carbendazin

NHCO 2 CH 3

0.5

0.029

SCH 3 C O N C CH 3 O

0.5

0.029

1.0b

0.029

256.2 > 209.3 256.2 > 175.1

25 25

15 15

1.0b

0.829

353.7 > 228.1 353.7 > 271.3

20 20

15 15

0.01

1.289

895.1 > 327.6 895.1 > 183.1

70 70

50 50

N CH3 NH

Methomyl

NO 2

Imidacloprid

N

N Cl

CH 2

N

H

N

O S

Hexythiazox

Cl

O N C NH

CH 3

OCH 3 HO OCH 3 CH 3

Abamectin

O

O CH 3

O

O

CH 3

CH 3 O

CH 3 O

CH 3

O OH

(i) R = -CH 2 CH 3 (avermectin B1a ) (ii) R = -CH 3 (avermectin B1b )

H

O H

O H

H

R

H

CH 3 OH

a. The first MRM transition is used for quantification and the second for confirmation purposes, respectively. b. MRL established by the Spanish legislation.

previously published methods for the target pesticides. A study on the stability of the target pesticides in extracts of samples under storage was also performed. The developed method was applied to investigate the occurrence of five pesticides in 270 samples of oranges and 95 of tangerines from the Valencian Community.

Experimental Chemicals and materials Certified pesticide standards of abamectin (purity 95%), carbendazim (99%), imidacloprid (99%) and methomyl (98%) were obtained from Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany), and hexythiazox (99.9%) was provided by Riedel de Häen (Seelze– Hannover, Germany). HPLC-grade methanol and pesticide residue-grade ethyl acetate were obtained from Riedel de Häen. Anhydrous sodium sulfate (analytical reagent grade), and formic acid (content >98%) were obtained from Panreac (Barcelona, Spain). Highly purified water was obtained by ultra filtration of deionized water with a Milli-Q system (Millipore, Bedford, MA). Both highly purified water and methanol were filtered before use through a 0.45 mm cellulose filter from Scharlau (Barcelona, Spain). Mobile phases were filtered through a 0.45-mm cellulose acetate (water) or politetrafluoroethylene (methanol). Pesticide standards preparation Individual stock standards solutions of each compound were prepared by weighing the powder and dissolution in 50 mL of methanol. Next, a pesticide mixture stock solution of 4 mg/L of each compound was prepared by adequate dilution of the corresponding stock solution with methanol. This mixture was used for preparing working standard solutions in methanol with a concentration of 1 mg/L. Individual and mixture standard solutions were stored under refrigeration (T £ 4˚C). Extraction procedure Citrus fruits for validation purposes were bought in an organic greengrocer’s from Almería (Spain). A representative portion of

the sample was chopped, homogenized and stored at –20˚C until analysis. Pesticide-free samples were used as blanks for validation studies and matrix matched standard calibrations. Samples for recovery experiments were spiked with the corresponding volume of the working solution and left standing for 1 h before beginning the extraction step. Approximately 1 kg of citrus fruit was chopped into small pieces and homogenized using a mixer (Sammic SK-3); 10.0 ± 0.1 g of homogenized sample were weighted in a glass, mixed with 50 mL of ethyl acetate, and blended with a Polytron (PT MR 2100) for 2 min. Then, 20 g of anhydrous sodium sulfate was added, and the mixture was homogenized for 2 min. The extract was filtered under a vacuum through a 12 cm Büchner funnel and washed with 2 successive 25 mL portions of ethyl acetate. The risings were added to the combined extraction fractions. The filtered liquid was collected in a 250 mL spherical flask and evaporated to dryness in a rotating vacuum evaporator (Büchi, Switzerland), set at 40˚C and 250 mbar, and brought to dryness under a gentle nitrogen stream. The obtained residue was redissolved in 5 mL of methanol. UPLC-MS/MS A chromatographic analysis was carried out in an ACQUITY UPLCTM system (Waters, Milford, MA) using a column Acquity UPLC BEH C18 column (100 mm ¥ 2.1 mm, i.d.) from Waters with 1.7 mm particle size. The elution was performed using methanol–water with 0.01% formic acid (90:10 v/v) in the isocratic mode. The column temperature (30˚C), flow rate (0.35 mL/min) and injection volume (5 mL) were used in all experiments. The UPLC was coupled to a Quattro Premier tandem quadrupole instrument (Waters), equipped with an ESI source working in the positive mode. The instrument was set to collect data during multiple reaction monitoring (MRM). Nitrogen (99.9% purity, N2 FLO generator, Claind, Lenno, Italy) and argon (99.9999% purity, air liquid, Barcelona, Spain) were used as cone and collision gases, respectively. Collision-induced dissociation (CID) was performed using argon at a pressure of 4 ¥ 10–3 mbar in a collision cell. The MRM transitions as well as the cone and collision energy voltages applied are summarized in Table 1. Other parameters used for the mass

ANALYTICAL SCIENCES APRIL 2009, VOL. 25

537

Fig. 1 Reconstructed UPLC-MS/MS chromatograms based on the quantification transition of each compound in an orange matrix spiked at 0.015 mg/kg.

spectrometer were: capillary voltage, 3.0 kV; cone voltage, 20 V; extractor voltage, 5 V; source temperature, 110˚C; desolvation temperature, 350˚C; desolvation flow, 600 L/h; and cone flow, 80 L/h. Data acquisition and processing were performed using MassLynx 4.1 software with the QuanLynx program (Waters).

Results and Discussion Optimization of MS/MS conditions To optimize the MS/MS conditions of each analyte, experiments were carried out by direct infusion of a standard solution of 10 mg/L of each target pesticide using ESI in the positive mode. The standard solutions were prepared in methanol with 0.01% of formic acid and injected at isocratic flow (0.35 mL/min). Full-scan mass spectra and the MS/MS spectra were acquired in order to obtain at least one precursor and two product ions for each compound for both identification and quantification purposes, while selecting the most abundant product ion for quantification; the rest were taken as confirmation transitions. Table 1 indicates MS/MS transitions for identification and quantification, as well as the cone voltages and collision energy values optimized for the selected target compounds. Other parameters, such as desolvation and cone gas flow, source and desolvation temperature and capillary voltages were studied, indicating the optimum working conditions in the experimental section. The dwell times were 0.015 seg for all chromatographic peaks. Under these conditions, the chromatographic variables were optimized to provide good separation between pesticides, short retention times (0.72 min for carbendazim, methomyl and imidacloprid, 1.28 min for hexythiazox and 1.60 min for abamectin), and correct peak shapes, as shown in Fig. 1. Method validation The method validation included the following parameters: linearity, limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs), trueness (expressed as recovery), and precision (repeatability, intermediate precision and reproducibility). Identification and confirmation criteria were established as well.

Identification and confirmation The identification of the target pesticides was carried out by searching in the appropriate retention time windows (RTWs): retention time average ±3 standard deviations of the retention time of 10 blank orange samples spiked at a mid-level calibration standard for each compound. After identification by RTW, a confirmation was performed by the acquisition of two MS/MS transitions, and comparing the intensity ratios of both of them, quantification (Q) and confirmation (C). The Q/C value calculated for the second calibration level (standard of 0.05 mg/kg) injected in a sequence was taken as the theoretical ion ratio, and Q/C values calculated for positive findings in samples were compared to the theoretical one. A confirmation was considered to be reliable if the deviation of both the standard and the sample ion ratios was lower than 15%.24 Quantification of the target pesticides One of the main problems in the trace analysis of pesticides in complex matrices is the suppression/enhancement matrix effect. In order to determine the matrix influence, a study was carried out by comparing the calibration curves for pesticides standards prepared in orange extract against those prepared in methanol, using the ANOVA test. For all cases, covariance analysis showed that the calculated F values were lower than the tabulated values (P < 0.05), indicating that the pesticide’s behavior was significantly influenced by the matrix orange components (Fig. 2). The calibration curves prepared in orange extract for the quantification of abamectin and hexythiazox showed an enhancement of the signal over the calibration curve constructed in methanol, while the calibration curves in orange for the quantification of carbendazim, methomyl and imidacloprid showed a diminishment of the response over the calibration curve in the solvent. As a consequence, all validation experiments were performed using orange as a representative sample matrix from the crop group of citrus fruits. Quantitation of the samples was carried out by injecting daily blank sample extracts spiked with pesticides at three different concentration levels (0.010, 0.050 and 0.150 mg/kg) to obtain calibration curves. The linearity of the calibration curves was

538

ANALYTICAL SCIENCES APRIL 2009, VOL. 25

Fig. 2 Calibration curves prepared in methanol (- -) and in orange extract (—) for abamectin, carbemdazim, methomyl, imidacloprid and hexythiazox.

Table 2 Determination coefficients, recoveries, LODs and LOQs for the target pesticides in orange samples (n = 6) Pesticide Abamectin Carbendazim Methomyl Imidacloprid Hexythiazox

r2 0.9994 0.9978 0.9973 0.9980 0.9974

Recovery,a Recovery,b LOD/ LOQ/ % % mg kg–1 mg kg–1 104 110 103 104 107

74 107 98 94 84

0.2 0.1 0.2 0.3 0.4

0.5 0.4 0.7 0.8 1.2

a. Concentration level, 0.011 mg/kg. b. Concentration level, 0.050 mg/kg.

Table 3 Repeatability, intermediate reproducibility of the UPLC method

precision

and

RSD, % Pesticide

Repeatability precisiona

Intermediate precisiona

Reproducibility precisiona

0.011/ 0.050/ 0.011/ 0.050/ 0.011/ 0.050/ mg kg–1 mg kg–1 mg kg–1 mg kg–1 mg kg–1 mg kg–1 Abamectin Carbendazim Methomyl Imidacloprid Hexythiazox

8 4 1 3 7

2 1 1 1 5

10 5 2 4 8

3 2 2 5 6

17 14 11 10 16

11 10 10 11 13

a. n = 5 in all precision studies.

studied without including the origin point, and better quantitation results were obtained when the peak area rather than peak height was considered. Good linearity of the response was found for all pesticides at concentrations within the tested interval, with linear determination coefficients higher than 0.997 (Table 2) and residual values lower than 20%. The limits of detection (LODs) and quantification (LOQ) were determined as the lowest pesticide concentration injected that yielded a signal-to-noise (S/N) ratio of 3 and 10, respectively, when the quantitation ion was monitored. Excellent values were obtained with LODs lower than the MRLs established by the EU for all of the evaluated pesticides (Table 2). The trueness of the method was calculated through the recovery of each pesticide. The study was carried out at two different fortification levels, at 0.011 and 0.050 mg/kg. Satisfactory results were found in both instances. Settling down as a criterion for validation recoveries of the compounds ranged between 70 and 110%; all of the pesticides gave acceptable recoveries within the mentioned validation interval. The repeatability (intra-day) precision was assessed at the two concentration levels of the recovery studies, by extraction and analysis on the same day of five fortified orange samples for each level (Table 3). For the intermediate (inter-day) precision a set of spiked samples at two concentration levels were analyzed each day for five consecutive days. Repeatability and intermediate precision values, expressed as relative standard

deviation (RSD), lower than 8 and 10%, respectively, were obtained. In addition, the reproducibility precision (interlaboratory precision) was evaluated by extraction and analysis each week for five weeks of spiked orange samples at the two concentration levels, but in a different laboratory, by a different operator, and in consequence using a different UPLC equipment. Table 3 gives the reproducibility values along with the RSD values in the range 10 – 17%. Internal quality criteria To assure that the measurement process is under statistical control when the proposed method is applied in routine analysis, various internal quality criteria have been established. The set of samples analyzed each day was processed together with: (i) A matrix blank that eliminates a false positive due to contamination in the extraction process, instrument or chemicals used, as well as to identify the possible matrix interferences. (ii) A reagent blank obtained by performing the whole process without a sample. This sample eliminated possible false positives produced by contamination in the instrument or solvent used. (iii) A matrix blank spiked at the concentration of the second

ANALYTICAL SCIENCES APRIL 2009, VOL. 25 calibration level in order to assess the extraction efficiency. Routine recovery rates of between 60 and 120% are accepted. (iv) Calibration curves prepared daily to check both the sensitivity and the linearity in the working range of concentrations in order to avoid quantitation mistakes caused by possible matrix effects of instrumental fluctuations (R2 > 0.99 and residuals lower than 20% are requested). Stability of samples A stability study was performed to ensure an adequate preservation of processed samples, because it is necessary to have information on the ability to store extracted samples over a period of time, allowing for greater flexibility in sample processing and analysis. For that, the stability of orange extracts spiked at 0.05 mg/kg and stored at 4 and –15˚C was evaluated for 20 days, by analyzing three replicates at 1, 7, and 20 days (Table 4). During the study, a blank orange spiked at 0.05 mg/ kg was analyzed together with stability samples. Spiked orange extracts were found to be stable at the temperatures tested over 7 days, obtaining recovery values of between 73 and 104% (4˚C), and 70 and 102% (–15˚C), except for the abamectin pesticide at 4˚C (62%). However, the target compounds were not shown to be stable after 20 days (4 and –15˚C), with recovery values equal to or lower than 40%. These data reveal that pesticide degradation was independent of the conservation temperature. For both temperatures, the pesticides degraded slowly between the first and seventh day. Then, on the 20th day there was a sudden decrease in the concentration of the pesticides, with all compounds showing a concentration lower than the established MRLs. The study showed that abamectin experienced a more appreciable diminution in the pesticide concentration within a time interval of seven days. Application of the method to real samples The proposed method was applied during a 1 year period (2006) to a routine determination of target pesticides in 365 citrus fruits (oranges and tangerines) in the laboratory LAB (Almería, Spain). The laboratory is accredited by UNE-ENISO/IEC 17025 for pesticide residue analysis, and so internal quality control procedures are routinely applied in order to check if the system is under control. Of the 365 samples analyzed, pesticides were detected in 103 (28%) of them, but the levels of the pesticides were below the MRLs established by the European Union (EU) in 96 (26%) samples. The concentration levels found were higher than the established MRLs for pesticides abamectin, in two orange samples at concentrations of 0.02 and 0.02 mg/kg, and carbendazim in three orange and two tangerine samples at concentrations between 0.10 and 0.20 mg/kg. Methomyl was found in concentrations lower than 0.10 mg/kg, and imidacloprid in concentrations under 0.01 mg/kg. Hexythiazox was the mostfrequently detected pesticide, with concentrations lower than 0.09 mg/kg. In general, the present study shows that the pesticides were found at trace levels. These results indicate the necessity of using sensitive and selective methods that are able to determine and confirm low levels of pesticide residues.

Conclusion A rapid UPLC-MS/MS method has been developed and

539 Table 4 Stability study, expressed as recovery, of the target compounds in spiked orange extracts (n = 3) at different storage times Spiked extract Pesticide

24 h 4˚C

–15˚C

7d 4˚C

–15˚C

20 d 4˚C

Abamectin 73(3) 76(2) 62 (6) 65(9) 21(10) Carbendazim 101(2) 96(2) 96 (8) 98(6) 40(12) Methomyl 104(3) 102(2) 96 (7) 88(8) 20(11) Imidacloprid 100(4) 102(3) 98 (9) 102(7) 21 (9) Hexythiazox 96(5) 92(5) 88(10) 92(8) 12(12)

–15˚C 25 (9) 42(11) 20(12) 24(10) 16(11)

validated for monitoring abamectin, carbendazim, methomyl, imidacloprid, and hexythiazox in orange and tangerine samples. The method satisfies the performance characteristics requested for the analysis of pesticide residues in fruit samples. This means adequate linearity, recovery, precision (interday, intraday and reproducibility) and sensitivity (LODs lower than 0.01 mg/ kg), as well as reliable identification and confirmation criteria. The applicability of the method to routine analysis was tested, under strict quality assurance conditions, by the analysis of 365 samples over a period of 1 year, demonstrating its high throughput and robustness. The results show that despite the relatively high incident rate of the occurrence of pesticide residues (28% of positive samples), only 7% slightly overcame the established MRLs. Thus, pesticide residue monitoring programs are necessary to control the presence of pesticides in citrus fruits, and to avoid food safety problems.

Acknowledgements The authors gratefully acknowledge Spanish Ministry of Education and Science (Project AGL2006-12127-C02-01FEDER) for its financial support.

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540 13. A. Valenzuela, M. J. Redondo, Y. Picó, and G. Font, J. Chromatogr., A, 2000, 871, 57. 14. M. Hiemstra and A. De Kok, J. Chromatogr., A, 2007, 1154, 3. 15. F. Hernández, O. J. Pozo, J. V. Sancho, L. Bijlsma, M. Barreda, and E. Pitarch, J. Chromatogr., A, 2006, 1109, 242. 16. O. J. Pozo, J. M. Marin, J. V. Sancho, and F. Hernández, J. Chromatogr., A, 2003, 992, 133. 17. C. Blasco, G. Font, and Y. Picó, J. Chromatogr., A, 2005, 1098, 37. 18. S. Grimalt, O. J. Pozo, J. V. Sancho, and F. Hernández, Anal. Chem., 2007, 79, 2833. 19. A. Garrido Frenich, J. L. Martínez Vidal, E. PastorMontoro, and R. Romero-González, Anal. Bioanal. Chem., 2008, 959, 390.

ANALYTICAL SCIENCES APRIL 2009, VOL. 25 20. C. C. Leandro, P. Hancok, R. J. Fussell, and B. J. Keely, J. Chromatogr., A, 2007, 1144, 161. 21. T. Kovalczuk, M. Jech, J. Poustka, and J. Hajslova, Anal. Chim. Acta, 2006, 577, 8. 22. K. Yu, D. Little, R. Plumb, and B. Smith, Rapid. Commun. Mass Spectrom., 2006, 20, 544. 23. J. E. MacNair, K. C. Lewis, and J. W. Jorgenson, Anal. Chem., 1997, 69, 983. 24. Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and the Interpretation of Results. Official Journal of the European Union, L 221, 17th August 2002, 16.

Capítulo 2. Evaluación de seguridad alimentaria

Artículo científico 2

Artículo científico 2

95

1664 Journal of Food Protection, Vol. 73, No. 9, 2010, Pages 1664–1670 Copyright G, International Association for Food Protection

Depletion of Veterinary Drugs Used in Aquaculture after Administration in Feed to Gilthead Seabream (Sparus aurata) ´ LEZ,1 REMEDIOS FERNA ´ NDEZ FERNA ´ NDEZ,1 JOSE ´ LUIS MARTI´NEZ VIDAL,1 ROBERTO ROMERO GONZA ´ NCHEZ MUROS,2 AND ANTONIA GARRIDO FRENICH1* ´ SA MARI´A JOSE 1

Department of Analytical Chemistry and

2

Department of Applied Biology, Almerı´a University, 04071 Almerı´a, Spain

MS 09-491: Received 18 November 2009/Accepted 26 March 2010

ABSTRACT This study was conducted to evaluate the depletion of residues of the antibiotics flumequine, oxytetracycline, sulfadiazine, trimethoprim, and oxolinic acid after in-feed administration to gilthead seabream. Fish were treated with the target antibiotics at doses of 30 mg/kg of body weight per day for 10 days at two seawater temperatures. Fish in each of five tanks were fed with a different medicated feed. After in-feed administration, five fish were randomly selected at different times, and antibiotic presence was analyzed in a mixture of muscle and skin. Antibiotic concentrations were determined through a validated analytical method based on liquid chromatography separation and mass spectrometry detection. Two trials were carried out with fish at different temperatures (14.0 and 19.5uC). Depletion of antibiotics occurred more rapidly at the higher temperature. Elimination rates for all antibiotics assayed were high, which indicates that the withdrawal period for these antibiotics could be reduced. The results suggest that in gilthead seabream maintained at these two temperatures no detectable concentrations of the antibiotics used in this study will remain in edible tissues 35 days after treatment. For flumequine and oxolinic acid, the elimination time is shorter (4 and 20 days, respectively).

The three main sources of global fish production are the marine catches, inland catches, and aquaculture. Because of the economic importance of seafood consumers to the food industry, aquaculture is growing worldwide to meet market needs (11). However, the use of intensive fish farming techniques can lead to an increase in the use of antimicrobials for prevention and treatment of diseases (13). These compounds often are applied in high doses in feed (15) or in water (28). The administered dose depends on several factors such as the activity of the compound and environmental conditions such as light, temperature, or salinity. However, it is very difficult to predict how much of the drug is going to be consumed by healthy or unhealthy fish. Aquaculture practices may affect the surrounding aquatic environment, damaging water, sediment, flora, and fauna, including threatened species (27). Among the chemicals used in aquaculture, special oversight should be given to veterinary drugs used to prevent and treat bacterial diseases. In the last few years, oxytetracycline and potentiated sulfonamides (sulfadiazine and trimethoprim) have been used widely to treat several diseases such as vibriosis and ulcerative diseases (19), although other broadspectrum antibiotics such as oxolinic acid and flumequine also can be applied (27).

* Author for correspondence. Tel: z34950015823; Fax: z34950015985; E-mail: [email protected].

In aquaculture operations, antibiotics are mainly applied through medicated feed and enter the environment as a result of leaching from feces and uneaten treated feed (14). The use of antibiotics has significantly improved fish health and production efficiency in aquaculture operations (10). However, the extensive use of antibiotics as pharmaceuticals (2, 4) or growth promoters in the veterinary sector (5, 20, 29) can result in antibiotic residues in fish for human consumption (6), which could cause allergic reactions and increase the probability of development of antimicrobial resistance in resident microbial flora (18). Therefore, the residues of these antibiotics in fish for human consumption should be as low as possible to assure food safety. In this regard, both the European Union (EU) and the United States have regulated the use of veterinary drugs in aquaculture. However, no harmonization related to antimicrobial approval, maximum residue limits (MRLs), or tolerances in food fish have been defined worldwide. In the United States, the number of antimicrobials approved by the Food and Drug Administration (FDA) (31) is small compared with the number of compounds included in the EU Council Regulation 2377/90 (9). The EU has established MRLs for all antimicrobials assayed in the present study (50 mg/kg for trimethoprim, 100 mg/kg for oxytetracycline and sulfadiazine, and 600 mg/kg for oxolinic acid), whereas the only antimicrobial approved by the FDA is oxytetracycline, with a tolerance of 2 mg/kg. When antibiotics are used, guidelines for specific doses and withdrawal periods must be followed to meet the

J. Food Prot., Vol. 73, No. 9

ELIMINATION OF ANTIBIOTICS IN GILTHEAD SEABREAM S. AURATA

requirements established by the current legislation. Because fish are poikilotherms, their metabolic rate is determined by environmental temperatures, and withdrawal time is usually defined as the time at which the residues in all tissues of all observed animals have fallen below the established MRL. Therefore, withdrawal periods must be specified as degreeday values to standardize the obtained results. In the EU, Council Directive 2001/82 (10) indicates that unless the medicinal product used indicates a withdrawal period for the species concerned, a general withdrawal time of 500uC-days must be applied for off-label use of drugs in fish. The aim of this study was to evaluate the elimination rates for oxytetracycline, sulfadiazine, trimethoprim, oxolinic acid, and flumequine in gilthead seabream (Sparus aurata). The withdrawal times for these antibiotics were evaluated at two water temperatures. Although similar studies have been published (16, 17, 21–23, 28), the results from the present study should contribute to minimizing consumer risk from antibiotic residues and the environmental impact of antibiotics used in aquaculture, bearing in mind that several classes of veterinarian drugs have been evaluated. All previous reports concerning gilthead seabream were based on the depletion of a single target antibiotic: oxytetracycline (16, 23), flumequine (17, 30), or oxolinic acid (21, 22), and data were obtained via liquid chromatography (LC) using fluorescence (16, 17, 21, 22, 30) or UV detection (21). In the present study, the five target antibiotics were simultaneously evaluated in a mixture of skin and muscle through a validated analytical method that included LC coupled with single-quadrupole mass spectrometry (MS) (24). MATERIALS AND METHODS Chemicals and reagents. Oxytetracycline hydrochloride (purity . 98.5%), flumequine (purity . 99.0%), sulfadiazine (purity . 99.5%), trimethoprim (purity . 99.5%), and oxolinic acid (purity . 98.0%) were obtained from Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany). Stock standard solutions of individual compounds (with concentrations ranging from 200 to 300 mg/liter) were prepared by dissolving approximately 100 mg of the powdered standard (accurately weighed) in 100 ml of highperformance (HP) LC grade methanol (Panreac, Barcelona, Spain). A multicompound working standard solution with 10 mg/liter concentrations of each compound was prepared by appropriate dilutions of the stock solutions with methanol and stored at 220uC in the dark. This solution was stable for 3 weeks, after which it was discarded and new fresh solution was made. A 1 M citrate solution (pH 4) was prepared by dissolving citric acid (Panreac) in water and adjusting the pH with 1 M NaOH (Panreac). EDTA-Na2 was obtained from Merck (Darmstadt, Germany), and acetonitrile (HPLC grade) was purchased from Panreac. Ultrapure water was obtained with a Milli-Q Gradient water system (Millipore, Bedford, MA). Other reagents were of analytical reagent grade. Medicated and unmedicated feed products were obtained from Skretting (Burgos, Spain), and both commercial products had the same macronutrient composition (46% protein, 21% lipids, and 9.1% ash). The antibiotics concentration in feed was calculated to obtain an intake equivalent to a dose of 30 mg/kg of body weight. Experimental conditions: fish and medication. One hundred twenty-five unmedicated gilthead seabreams (150 to

1665

200 g each) were supplied by a local fish farm in Almerı´a (Spain). The depletion of antibiotics was studied at seawater temperatures of 14 and 19.5uC. These temperatures were representative of conditions on the Mediterranean coast. Fish were brought to the laboratory in a container of aerated seawater. In the laboratory, fish were randomly transferred to five cylindrical tanks (25 fish per tank). The capacity of each tank was 1,000 liters, and each tank contained 950 liters of aerated seawater. Water was renewed daily with 200% of its volume and was continuously aerated with an air pump and maintained under natural conditions of photoperiod and temperature. Maximum and minimum temperatures were recorded throughout the experiment to establish the degree-day values. The variation in temperature depended on the season. In winter, the minimum fell to 11uC only twice; the usual variations were 13 to 15uC. In spring, the temperature fluctuated between 18 and 20uC with a peak of 21uC. Before the therapeutic treatment, fish were allowed to acclimatize for 5 days in the different tanks and were fed with unmedicated feed. After the adaptation period, therapeutic treatment started with in-feed antibiotic administration for 10 consecutive days. The fish in each tank were fed with a different medicated feed: flumequine (tank 1), oxytetracycline (tank 2), potentiated sulfadiazine (sulfadiazine and trimethoprim; tank 3), and oxolinic acid (tank 4). Fish in tank 5 were given unmedicated feed as a control. After 10 consecutive days of treatment, all fish were fed an unmedicated diet for the rest of the experiment. During the experimental period, fish were fed with a commercial diet (D4 Excel, Skretting), and the food intake levels were established following the recommendations of the company for each experimental temperature. Experimental conditions: sampling. The experimental protocol involved five sample collections for each antibiotic. The first samples were collected the day after the medication was finished, and four additional samples were subsequently collected. Sampling was based on the elimination times established following the recommendations indicated by the company based on a withdrawal time established for each antibiotic in the veterinary literature: 6 days for oxolinic acid, 2 days for flumequine, and 500uC-day for tetracycline and sulfonamide. Groups of five fish for each antibiotic were randomly sampled at various days after the last administration of medicated feed. Fish were sampled on days 1, 2, 3, and 4 for flumequine, on days 1, 3, 6, and 9 for oxolinic acid, and on days 1, 7, 20, and 34 for oxytetracycline, sulfadiazine, and trimethoprim. For antibiotic residue analysis, five fish from each tank were killed following the guidelines of Royal Decree 1201/2005 (12) concerning use of animals for experiments, and the dorsal muscle was removed and stored frozen (220uC) until analysis. Experimental conditions: analytical procedures. The applied analytical procedure has been detailed previously (24). A 1-g fish sample (muscle plus skin) was mixed with 10 ml of acetonitrile, 1 ml of 1 M citric acid (pH 4.0), and 0.5 ml of 0.5 M EDTA-Na2 and homogenized with a Polytron homogenizer (Kinematica, Lucerne, Switzerland) for 3 min. The sample was centrifuged at 2,390 | g for 10 min, and the supernatant was evaporated to dryness under a gentle stream of nitrogen. The obtained residue was redissolved in 1 ml of mobile phase, injecting 20 ml into the LC system. Chromatographic analyses were carried out using an HPLC system (Waters, Millford, MA). A C18 column (150 by 2.00 mm inside diameter by 5 mm; Waters) was used for all separations, and the column temperature was set at 30uC. The elution of the compounds was performed using an aqueous solution of 0.1%

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FIGURE 1. Molecular structure of the selected antibiotics.

formic acid (eluent A) and methanol (eluent B) at a flow rate of 0.30 ml/min, applying the following gradient profile: 90% eluent A for 3 min, decrease eluent A linearly to 45% over 9 min and maintain at 45% for 3 min, decrease eluent A linearly to 10% over 3 min and maintain at 10% for 5 min, and restore eluent A to 90% over 2 min and maintain at 90% for 5 min. The HPLC system was coupled to a ZQ 2000 single quadrupole mass spectrometer (Waters-Micromass, Manchester, UK) equipped with an electrospray source working in positive mode. Data acquisition was performed with MassLynx 4.0 software (Waters). The ionization source parameters were capillary voltage of 3.5 kV, source temperature of 120uC, desolvation temperature of 350uC, flow rate for desolvation of 350 liters/h, and flow rate for cone gas of 50 liters/h from a nitrogen generator (Claind, Lenno, Italy). Quality control. To ensure the quality of results when the proposed method was applied in routine analyses, internal quality controls were used. A blank extract was used to identify falsepositive results obtained through contamination from the extraction process, instruments, or chemicals and to identify possible matrix interferences. Another blank sample was spiked at 50 mg/kg and used to evaluate the extraction efficiency. A calibration curve was prepared daily from the blank matrix extract.

RESULTS AND DISCUSSION Five drugs, i.e., sulfadiazine, trimethoprim, oxytetracycline, flumequine, and oxolinic acid, from different classes of antibiotics were evaluated in this study. Figure 1 shows the structure of the selected antibiotics. The analytical method used was developed previously (24) and it is based on LC-MS methodology. Figure 2 shows a representative LC-MS chromatogram of a fish blank sample spiked at 25 mg/kg. Table 1 provides the limits of detection (LODs),

limits of quantification (LOQs), and MRLs established by the EU (9). To evaluate the influence of water temperature on the elimination rate of the selected antibiotics, this study was carried out at two temperatures, 14.0 and 19.5uC, considered representative of conditions in winter and spring, respectively, on the Mediterranean coast. All the antibiotics were given at the same rate of 30 mg/ kg of body weight per day. The dosage ranges for antibiotics used for therapeutic purposes in fish are very large and depend on several factors such as pathology, illness severity, water conditions, weight of fish, and food intake (3, 7). In this study, the fish were healthy, and the aim of this work was to compare the antibiotic elimination rate at two temperatures. The dosage was selected to minimize the influence of different levels of antibiotic ingestion and administration time (10 days for every antibiotic used). Thus, the doses administered were in the therapeutic range for each antibiotic. Calculation of withdrawal time and elimination half-life of antibiotics. To evaluate withdrawal time and elimination half-life of the antibiotics, a first-order kinetics model was used applying the following expression, C(t) ~ C0e2bt, where C(t) is the concentration (micrograms per kilogram) at time t (day), C0 is the initial concentration, and b is the elimination rate constant (per day). To evaluate the withdrawal time, the method described by Salte and Liestøl (26) was applied, which involves the calculation of the linear regression from the logarithm of the drug residue against time, estimating the elimination half-life (tK) as 0.693/b.

ELIMINATION OF ANTIBIOTICS IN GILTHEAD SEABREAM S. AURATA

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FIGURE 2. Selected ion monitoring (SIM) chromatogram of extracts obtained from blank fish skin and muscle samples spiked at 25 mg/kg with the target antibiotics.

Table 2 shows the mean concentrations of flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid for five replicates at each sampling day for both temperatures assayed. These concentrations were obtained after treatment was finished, and a mixture of muscle plus skin was analyzed. The mean concentrations of flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid were 55, 22, 304, 268, and 62 mg/kg, respectively, on day 1 after treatment when fish were kept in seawater at 14uC. For the last samples tested (testing ended on different days after treatment had finished), antibiotic concentrations were below the LODs, except for oxolinic acid, which was detected at 23 mg/kg. However, for fish kept in seawater at 19.5uC, the mean concentrations of flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid were 11, 32, 109, 249, and 8 mg/kg, respectively, on day 1 after treatment. For the last samples tested (testing ended on different days after TABLE 1. Limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs), and maximum residue limits (MRLs) established by the European Union for the selected antibiotic Antibiotic

LOD (mg/kg)

LOQ (mg/kg)

MRL (mg/kg)

Flumequine Oxolinic acid Oxytetracycline Sulfadiazine Trimethoprim

8 7 4 6 4

20 16 10 14 11

600 100 100 100 50

treatment had finished), antibiotic concentrations were below the LODs, except for trimethoprim, which was detected at 11 mg/kg. Elimination curve equations are shown in Figure 3. Determination coefficients higher than 0.95 were obtained for all cases when the experimental data were adjusted to C(t) ~ C0e2bt. Half-lives (tK) were calculated through the corresponding values of the elimination rate constant (b) and the obtained values were 1.73, 12.79, 7.44, 1.67, and 6.11 days for flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid, respectively, when fish were kept in seawater at 14uC. However, for fish in seawater at 19.5uC, the half-lives of flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid were 1.61, 8.94, 3.66, 1.26, and 3.74 days, respectively. The theoretical withdrawal periods at both temperatures, i.e., when antibiotic concentrations would be below the MRLs and LODs, are indicated in Table 3. All antibiotics concentrations in fish were lower than the established MRLs on the first day after treatment (day 1) except those of oxytetracycline and sulfadiazine, which fell below their MRLs on days 12 and 2, respectively, when the seawater temperature was 14uC and on days 1 and 2, respectively, when the seawater temperature was 19.5uC. Flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid fell below their LODs on days 5, 31, 47, 9, and 19, respectively, when the seawater temperature was 14uC and on days 1, 27, 17, 7, and 1, respectively, at 19.5uC. The reduced theoretical withdrawal times at higher

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TABLE 2. Mean concentrations of the selected antibiotics at two seawater temperatures (14 and 19.5uC) Mean (RSD) concn (mg/kg)b Flumequine Sampling daya

1 2 3 4 6 7 9 20 34 a b

Trimethoprim

Oxytetracycline

14uC

19.5uC

14uC

19.5uC

14uC

55 (2.3) 39 (5.6) 25 (12.0) ,8

11 (9.3) ,8 ,8 ,8

22 (6.8)

32 (8.1)

304 (1.9)

20 (11.8)

11 (5.6)

133 (3.4)

11 (16.4) ,4

11 (7.2) 11 (3.4)

49 (6.4) ,4

19.5uC

109 (3.1)

35 (10.6) ,4 ,4

Sulfadiazine

Oxolinic acid

14uC

19.5uC

14uC

268 (2.6)

249 (7.6)

62 (1.6)

8 (12.1)

32 (2.8)

8 (11.9)

22 (7.5) 20 ,6

19.5uC

25 (3.6)

,7

23 (6.2)

,7

9 (8.9) ,6 ,6

Day after the last administration of medicated food. n ~ 5. RSD, relative standard deviation.

FIGURE 3. Mean concentrations of flumequine (a), oxolinic acid (b), oxytetracycline (c), sulfadiazine (d), and trimethoprim (e) in muscle and skin of gilthead seabream at seawater temperatures of 14uC (——) and 19.5uC (— —). The MRLs established by the European Union for each antibiotic also is plotted.

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TABLE 3. Time at which antibiotic concentrations fell below the MRL or LOD in fish kept in seawater at 14 and 19.5uC Withdrawal day at: 14uC Antibiotics

Flumequine Oxytetracycline Sulfadiazine Trimethoprim Oxolinic acid a b c

Below MRLa

NEc 12 2 NE NE

19.5uC Below LODb

(600) (100) (100) (50) (100)

5 47 9 31 19

Below MRL

(8) (4) (6) (4) (7)

NE 1 2 NE NE

Below LOD

(600) (100) (100) (50) (100)

1 17 7 27 1

(8) (4) (6) (4) (7)

MRL established by the European Union (degree-days) given in parentheses. LOD of the analytical method given in parentheses. NE, not established; concentration was less than that measured 1 day after administration.

temperatures were calculated from the same doses at both temperatures. Comparison of the results. The elimination rates of antibiotics depend on several environmental factors such as light, salinity, or seawater temperature. To evaluate the influence of seawater temperature on fish metabolism and consequently on the elimination rate of drugs, the time parameter also was expressed as degree-days, which were calculated by multiplying the mean daily water temperature (in degrees Celsius) by the total number of measured days. Figure 3 indicates that depletion was not similar at both temperatures, and degradation or elimination of antibiotics occurs more rapidly at higher temperatures (1, 25). Other researchers (8) have suggested that elimination rates can vary by 10% when seawater temperature changes 1uC. In the present study, the mean concentrations of antibiotics on day 1 after treatment (Table 2) were much lower at 19.5uC than those observed at 14uC, except for trimethoprim, which was the most persistent at both temperatures. These data support previous results that indicated that microbial degradation contributes more to the disappearance of trimethoprim than do environmental factors such as temperature (15). The elimination rate constants (b) of flumequine, trimethoprim, oxytetracycline, sulfadiazine, and oxolinic acid were 0.399, 0.054, 0.093, 0.414, and 0.114, respectively, at 14uC and 0.428, 0.078, 0.189, 0.551, and 0.186, respectively, at 19.5uC, i.e., they were all lower at 14uC. These findings support previous results (26) that indicated that b is highly influenced by water temperature. Elimination half-lives also were lower at 19.5uC in all cases. For the withdrawal period, the results indicate that this time period should be shorter in fish kept at 19.5uC than in fish kept at 14uC. All antibiotics except for oxytetracycline and sulfadiazine had postmedication concentrations lower than the established MRLs at both temperatures. This finding may be associated with the high concentrations of tetracycline and sulfadiazine detected when treatment was finished, suggesting that longer time is needed to eliminate these antibiotics. At 14uC, oxytetracycline and sulfadiazine concentrations fell below their MRLs on days 12 and 2, respectively, after finishing treatment, whereas antibiotic

levels fell below their MRLs on days 1 and 2, respectively, at 19.5uC. No antibiotics were detectable 34 days after treatment, although for flumequine, this period was shorter (4 days), indicating that fish without traces of some antibiotics can be obtained before the established withdrawal period. The present study provides preliminary data supporting more prudent use of selected antibiotics in gilthead seabream and suggesting a possible reduced withdrawal time after treatment. ACKNOWLEDGMENTS The authors acknowledge the Spanish Ministry of Education and Science (project ref. AGL2007-63569/ALI) for financial support. We also thank Piscifactoria Aguadulce (Almerı´a, Spain) for providing fish samples.

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Capítulo 2. Evaluación de seguridad alimentaria

Artículo científico 3

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In: Olive Oil and Health Editor: James D. Corrigan, pp 169-196

ISBN: 978-1-61728-653-7 © 2011 Nova Science Publishers, Inc.

Chapter 6

SAMPLE TREATMENT AND DETERMINATION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS AND PESTICIDE RESIDUES IN OLIVE OIL R. Fernández-Fernández, R. Romero-González, A. Garrido Frenich and J. L. Martínez Vidal Research Group “Analytical Chemistry of Contaminants”, Department of Analytical Chemistry, Almeria University, E-04071 Almeria, Spain

ABSTRACT The Mediterranean diet, which includes olive oil, is of great interest to medical researchers for its health benefits. Olive oil is a rich source of antioxidants and it has several properties to combat heart disease, diabetes and cancer. However, the presence of contaminants in olive oil is also a fact that can affect negatively human health. Contaminants, which could most impair the quality of olive oil are pesticides, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), heavy metals and mycotoxins. Among these compounds, pesticide residues and PAHs are among the most detected in olive oil, and thereby, their determination in this matrix is of great interest. Pesticides are introduced in olive, mainly during agricultural practices used against pests, while PAHs come from the incomplete incineration of fuels such as oil, gas, coal, waste and other organic substances. Due to the wide distribution of PAHs in the environment and their lipophilic nature, edible vegetable oils are contaminated with these substances. The presence of such compounds demands the development of analytical methods for the determination of pesticides and PAHs in olive oil in order to assure food quality. The analysis of pesticide residues and PAHs in olive oil involves several analytical steps such as extraction, clean-up and determination. The sample extraction and clean-up methodologies imply several techniques such as liquid-liquid extraction (LLE), solidphase extraction (SPE), gel-permeation chromatography (GPC), matrix solid-phase dispersion (MSPD) or QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) methodology. Furthermore, chromatographic techniques such as gas chromatography (GC) and liquid chromatography (LC) are mainly used for the separation of this type of compounds, whereas several types of detectors as fluorescence or mass spectrometry

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R. Fernández-Fernández, R. Romero-González, A. Garrido Frenich, et al. (MS) are applied for the detection and quantification steps. This chapter covers the main methods for the determination of pesticide residues and PAHs in olive oil. The advances of the analytical methods as well as their advantages and disadvantages are also evaluated. Sample preparation and clean-up methodologies are emphasized, as well as the chromatographic determination of these contaminants, indicating the most frequently detected compounds in olive oil.

1. INTRODUCTION Olive oil is a very important commodity in the Mediterranean basin. It is the main ingredient of the Mediterranean diet, since it possesses highly beneficial nutritional and culinary properties due to its unique composition in fatty acids and antioxidants, such as, sterols, ubiquinols and phenolic compounds [1,2]. Several studies have shown that olive oil is beneficial to human health, and its consumption has been associated with lower percentages of heart diseases [3], cancer [4,5], diabetes [6] and diseases linked to an uncontrolled free radical production [7] and they have prompted a demand for this product worldwide. However, the presence of contaminants in olive oil is also a fact that can affect negatively human health. Among the various contaminants that can be found in olive oil such as pesticide residues, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), polychlorinated biphenyls (PCBs), heavy metals and mycotoxins, pesticide residues and PAHs are of particular interest, because these are among the most detected in olive oil. In order to obtain high production and good quality oils, pesticides are applied to olive trees to protect the crop from attack by pests and the presence of weeds. In this way, the residues can be introduced to olive and then transferred to the olive oil. Most of the products used are organophosphorus insecticides [8] and herbicides [9]. On the other hand, PAHs are a group of contaminants that occurs widely in the environment as a result of incomplete incineration of organic mater. Due to the wide distribution of PAHs in the environment and their lipophilic nature, edible vegetable oils are contaminated with these substances. Bearing in mind that the presence of these contaminants could be health hazard, maximum residue limits (MRLs) in olives and olive oil have been established by European Union [10-13] and Codex Alimentarius Commission of the Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) [14]. The presence of such compounds demands the development of analytical methods for the determination of pesticides [15-18] and PAHs [19-22] in olive oil at very low concentration levels, in order to assure food quality. The analysis of these contaminants in fatty vegetable matrices such as olive oil is difficult because of the complexity of the matrix and frequently extensive sample extractions and clean-up steps are required [23]. The main problem in the extraction process of these compounds from olive oil is the high content of triglycerides (> 99 %) in the vegetable matrix. These compounds are soluble in most of organic solvents used in the extraction process, and therefore they are usually coextracted with the target compounds (pesticides and PAHs), interfering in the analytical process. Therefore, a clean-up step is necessary to remove the fatty component from the extract prior to the analysis step [22]. The extraction procedures are usually laborious and time consuming, and they should be minimized to increase extraction process throughput. In order to extract PAHs and pesticides from fatty matrices as olive oil, several extraction and clean-up processes have been used

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such as liquid-liquid extraction (LLE) [24], solid-phase extraction (SPE) [25], gel permeation chromatography (GPC) [18], matrix solid-phase dispersion (MSPD) [26] or QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) [23,27]. In relation to the determination of these type of compounds, chromatographic methods, either liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) are mainly used [23], coupled to several detectors such as fluorescence [28], nitrogen phosphorus detector (NPD) [29] or electron capture detection (ECD) [8]. However these detectors are not selective, and tedious sample preparation steps are required in order to minimize the presence of interferents during the detection. To minimize it, mass spectrometry (MS) or tanden mass spectrometry (MS/MS) detection is mainly used for the detection and quantification of this type of compounds, employing several type of analyzers such as triple quadrupole (QqQ) [17] or ion trap [16], because it is more selective than classical detectors. This chapter covers the main methods for the determination of PAHs and pesticide residues in olive oil. The advances of the analytical methods, as well as their advantages and disadvantages are also evaluated. Sample preparation and clean-up methodologies are emphasized, as well as the chromatographic determination of these contaminants, indicating the most frequently detected compounds in olive oil.

2. PRESENCE OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS AND PESTICIDE RESIDUES IN OLIVE OIL. LEGISLATION 2.1. Presence of PAHs in olive oil PAHs are a large group of organic compounds with two or more fused aromatic rings that occur widely in the environment as a result of incomplete combustion of organic matter. Many of these compounds have been shown to be genotoxic and carcinogenic properties [30]. For instance, EU has been included 15 PAHs as potentially genotoxic and carcinogenic to humans [10] (see Table 1). Moreover, some PAHs, not recognised as carcinogenic, may act as synergist [31]. Foods can be contaminated by PAHs present in the environment, and although most data on the effects of PAHs in the human population refer to occupational and environmental exposure, it has been confirmed that the main source of exposure for human beings is through food, within which the most important class is fats and oils, due to the lipophilic properties of PAHs. In fact, for non-smokers, the major route of exposure is from food with a minor contribution from inhaled air [32]. The presence of PAHs in food is mainly due to environmental contamination (deposition of airborne particulates on crops or growth in contaminated soil) or technological process [33]. Olives do not take up significant amounts of PAHs from the soil, but can be contaminated from air particles through deposition of contaminated matter. Thus, contamination of olive skins depends directly on environmental pollution levels and inversely on fruit size [34]. In the oil mill, olive oils can be contaminated by PAHs because the combustion fumes during the extraction process. For instance, the presence of PAHs in crude olive pomace oil is during the drying of the olive pomace prior to the solvent extraction process to obtain the residual oil. The olive pomace is dried by direct contact with combustion fumes and therefore, the

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presence of PAHs in oil will depend on the type of fuel and the solid residue from the solvent extraction [35]. PAHs levels in olive oils can be significantly reduced by refining. However this process can not be applied to edible virgin olive oil because it is not allowed by the European Union and the International Olive Oil Council (IOC) in order to preserve its nutritional and organoleptic properties [36]. Thus, if virgin olive oil has been contaminated, PAH levels can not be reduced without loosing the quality score of the oil. On the other hand, refined oils (deodorization, bleaching, charcoal treatment) reduce considerably the content of PAHs. Table 2 shows the presence of PAHs in several types of olive oils. It must be indicated that the most frequently PAHs found in virgin olive oil were phenanthrene, anthracene, fluoranthene, naphthalene, pyrene, acenaphthene, benzo(a)pyrene and benzo(ghi)perylene, with concentrations higher than 200 µg/kg in some cases. On the other hand, the concentration of PAHs in refined oil is in the range of few µg/kg. This difference is mainly due to the use of activated carbon during the bleaching step in the refining process, which removes PAHs to a great extent [37]. Table 1. Summary of the most important PAHs analysed in olive oil. Compound Acenaphthene1 Acenaphtylene1 Anthracene1 Benzo(a)anthracene1,2 Beno(b)fluoranthene1,2 Benzo(k)fluoranthene1,2 Benzo(ghi)perylene1,2 Benzo(a)pyrene1,2 Chrysene1,2 Dibenzo(a,h)anthracene1,2 Fluoranthene1 Fluorene1 Indeno(1,2,3-cd)pyrene1,2 Napthalene1 Phenanthrene1 Pyrene1 Benzo(j)fluoranthene2 Cyclopenta(c,d)pyrene2 Dibenzo(a,e)pyrene2 Dibenzo(a,h)pyrene2 Dibenzo(a,i)pyrene2 Dibenzo(a,l)pyrene2 5-methylchrysene2 1 2

16 EPA priority list UE PAHs of concern in food

Molecular weight (amu) 154 152 178 228 252 252 276 252 228 278 202 166 276 128 178 202 252 226 302 302 302 302 242

CAS No 83-32-9 208-96-8 120-12-7 56-55-3 205-99-2 207-08-9 191-24-2 50-32-8 218-01-9 53-70-3 206-44-0 86-73-7 193-39-5 91-20-3 85-01-8 129-00-0 205-82-3 27208-37-3 192-65-4 189-64-0 189-55-0 191-30-0 3697-24-3

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Table 2. PAHs levels (µg/kg) in different olive oil samples. Compound

Type of olive oil [Reference]1 Virgin Virgin Virgin Virgin [38] [39] [22] [40] (10) (6) (15) (54)

Acenaphthene

0.4-1.0 1.33 (n=10) (n=2)

NS

Acenaphthylene

0.4-5.7 NS (n=10) NQ-5 2.53 (n=10) (n=3)

NS

Benz(a)anthracene

NS

NS

NS

Benzo(a)pyrene

NS

3.33 (n=2)

Benzo(b)fluoranthene

NS

NS

0.3– 1.2 (n=6) NS

Benzo(c)fluorene

NS

NS

NS

Benzo(e)pyrene

NS

2503 (n=3)

Benzo(ghi)perylene

NS

1.83 (n=2)

Benzo(k)fluoranthene

NS

NS

Chrysene

NS

32.53 (n=2)

0.3– 2.0 (n=5) 0.5– 1.5 (n=7) 0.9– 1.4 (n=3) NS

Coronene

NS

NS

Cyclopenta(cd)pyrene

NS

4.43 (n=1) NS

Anthracene

NS

Virgin Refined Pomace Extra [41] [22] [22] virgin (2) (15) (10) [21] (10) 0.9-44 0.86- NS NS NS (n=54) 2.28 (n=2) 0.6-6 NS NS NS NS (n=54) < 2.3-5 0.18- NS NS NS (n=54) 0.40 (n=2) NS 0.48- NS NS