plant cell culture & micropropagation - abctp - Ufla [PDF]

ISSN 1808-9909 Volume 2, Número 2, 2006

PLANT CELL CULTURE & MICROPROPAGATION

Cultura de Células & Micropropagação de Plantas Publicação Científica da Associação Brasileira de Cultura de Tecidos de Plantas Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 2, n. 2, p. 53-106, 2006

A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”, editada semestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600 exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.

Para se associar à ABCTP consulte o site: PERMUTA A revista “Plant Cell Culture & Micropropagation” deseja fazer permuta com revistas de áreas afins.

ABCTP Universidade Federal de Lavras - Departamento de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal - Caixa Postal: 3037 - Lavras – MG - CEP 37200-000 E-mail: [email protected] FICHA CATALOGRÁFICA Plant Cell Culture & Micropropagation = Cultura de Células & Micropropagação de Plantas. – v. 1, n. 1 (jan./jun. 2005)- . – Lavras : Ed. UFLA, 2005v. il. Semestral (junho e dezembro). Publicação Científica da Associação Brasileira de Cultura de Tecidos de Plantas (ABCTP). ISSN 1808-9909 1. Cultura de Tecidos de Plantas. I. Associação Brasileira de Cultura de Tecidos de Plantas. II. Universidade Federal de Lavras. Departamento de Biologia. Setor de Fisiologia Vegetal. CDD (22ª ed.) 580.72405

INDEXADO por: AGRIS AGROBASE

DIRETORIA Presidente – Renato Paiva – UFLA Secretário – Moacir Pasqual – UFLA Secretário Adjunto – Antônio Carlos Torres – EMBRAPA Hortaliças Tesoureiro – Guilherme Augusto Canella Gomes – Benger do Brasil

COMISSÃO EDITORIAL EDITOR CHEFE Renato Paiva – UFLA

CONSELHO EDITORIAL Antônio Carlos Torres – EMBRAPA Hortaliças Moacir Pasqual – UFLA Renato Paiva – UFLA

REVISÃO DE REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Luiz Carlos de Miranda – UFLA

NOMENCLATURA CIENTÍFICA Manuel Losada Gavilanes – UFLA

EDITORAÇÃO Christyane Aparecida Caetano – Editora UFLA Alézia Conceição Modesto Ribeiro – Editora UFLA Luciana Carvalho Costa – Editora UFLA

REVISÃO DE PORTUGUÊS Amanda Jackeline Santos Silva

REVISÃO DE INGLÊS Renato Paiva – UFLA

SECRETARIA Cr ist iano Mar t inot t o – UFLA Daiane Peixot o Var gas – UFLA

EDI TORES ASSOCI ADOS Enio Luiz Pedrotti - UFSC Fr ancisco de Assis Paiva Campos - UFC Gilber t o Bar bant e Ker bauy - USP J oão Bat ist a Teixeir a - EMBRAPA Recur sos Genét icos e Biot ecnologia J osé Ant ônio Pet er s - UFPEL Kasumit su Mat sumot o- EMBRAPA Recur sos Genét icos e Biot ecnologia Lilia Gomes Willadino - UFRPE Linda St yer Caldas - UNB Luciana Ribas - UFPR Magdi Ahmed I br ahim Alouf a - UFRN Mar guer it e Ger maine Ghislaine Q uoir in- UFPR Miguel Pedr o Guer r a - UFSC Miklos Gábor Fár i – Univer sidade de Debr ecen – Ungr ia Otto Jesu Crocomo – ESALQ - USP Renat o de Oliveir a Resende - UNB Schuyler Kor ban – Univer sidade de I llinois - Est ados Unidos Silvio Lopes Teixeira - UENF Ter ezinha Rangel Camar a – UFRPE Wagner Apar ecido Vendr ame – Univer sidade da Flór ida – Est ados Unidos Wagner Campos Ot oni – UFV

CONSULTORI A CI ENTÍ FI CA (Vol. 2, N. 2) Alexandr e Hof f mann – EMBRAPA Uva e Vinho Alexandr e Mor ais do Amar al – EMBRAPA-I AC Aloisio Xavier – UFV Ant ônio Chalf un J unior – UFLA Eur ico Eduar do Pint o de Lemos – UFAL Evar ist o Maur o de Cast r o – UFLA Gilber t o Bar bant e Ker bauy – USP J oão Bat ist a Teixeir a – EMBRAPA Cenar gem José Raniere F. Santana – UEFS Luiz Ant ônio Biasi – UFPR Miguel Pedr o Guer r a – UFSC Osmar Alves Lameir a – EMBRAPA Amazônia Or ient al Ot t o J esu Cr ocomo – ESALQ/ USP Ricar do Tadeu de Far ia – UEL Wagner Campos Ot oni – UFV

ISSN 1808-9909

Plant Cell Culture & Micropropagation CONTEÚDO 01. In vitro propagation of Melissa officinalis L. and production of essential oil. In vitro propagation of Melissa officinalis L. and production of essential oil. Simone da Silva, Celso Luiz Salgueiro Lage, Maria Apparecida Esquibel, Rosane Aguiar da Silva San Gil, Alice Sato.....................................................................................................................................................................................

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02. Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) em diferentes concentrações de sais de Knudson C e carvão ativado. In vitro growth of Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) in different concentrations of Knudson C salts and activated charcoal. Aparecida Gomes de Araujo, Moacir Pasqual, Alba Regina Pereira, Herminio Souza Rocha.....................

61

03. Propagação in vitro de plântulas de orquídea em diferentes meios de cultura e concentrações de citocinina. In vitro propagation of orchid plantlets cultivated in different culture media and cytokinin concentrations. Aparecida Gomes de Araujo, Moacir Pasqual, Adriano Bortolotti da Silva, Fabíola Villa, Hermínio Souza Rocha, Fernanda Carvalho Costa.......................................................................................................

68

04. Efeito do vírus das estrias da bananeira na micropropagação e no crescimento das plantas da cultivar caipira durante a aclimatização. Effect of banana streak virus on micropropagation and plant growth of cultivar caipira during acclimatization. Daniela Garcia Silveira, Antônio da Silva Souza, Paulo Ernesto Meissner Filho, Tales Miler Soares, Ranulfo Correa Caldas, Kátia Regina Barbosa Leão....................................................................................

74

05. Características morfofisiológicas de brotações de Agapanthus umbellatus var. minor multiplicadas em biorreator de imersão temporária. Morphological and physiological characteristics Agapanthus umbellatus var. minor of shoots propagated in bioreactor of temporary immersion. Luciana Alves Fogaça, Denilson Dortzbach, Antonio Carlos Alves, Enio Luiz Pedrotti.............................

80

06. Capacidade de regeneração in vitro de tomateiro cultivar Santa Clara. In vitro regeneration capacity of tomato plant cultivar Santa Clara. Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza, José Magno Queiroz Luz, Alcione Silva Arruda, Denise Garcia Santana, Mariana de Souza e Silva da Costa Teixeira, Luciana Londe, Adelaide Siqueira Silva, Elisângela Rodrigues Figueira......................................................................................................................

88

07. Indução de calos a partir de cultura de anteras de cafeeiro (Coffea arabica L.) cv. Catuaí Vermelho 99 e 44.

Callus induction from anther culture of coffee plant (Coffea arabica L.) cv. Catuaí Vermelho 99 and 44. Adelaide Siqueira Silva, José Magno Queiroz Luz, Denise Garcia Santana, Patrícia Crystie Vieira Mustafa, Moacir Pasqual, Glaucia de Fatima Moreira Vieira e Souza.........................................................

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Plant Cell Culture & Micropropagation COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA 08. Proliferação in vitro de brotos de Curauá utilizando diferentes volumes de meio de cultura. In vitro shoot proliferation of Ananas erectifolius using different volumes of culture medium. Flávia Dionísio Pereira, José Eduardo Brasil Pereira Pinto, Helen Cristina de Arruda Rodrigues, Luciana Domiciano Silva Rosado, Luiz Alberto Beijo, Osmar Alves Lameira.....................................................

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IN VITRO PROPAGATION OFof Melissa Melissa officinalis L. AND PRODUCTION In vitro propagation officinalis L. and production... 53 OF ESSENTIAL OIL IN VITRO PROPAGATION OF Melissa officinalis L. AND PRODUCTION OF ESSENTIAL OIL SIMONE DA SILVA1, CELSO LUIZ SALGUEIRO LAGE2, MARIA APPARECIDA ESQUIBEL3, ROSANE AGUIAR DA SILVA SAN GIL4, ALICE SATO5 1

Doutoranda em Biotecnologia Vegetal –UFRJ/IBC Chagas Filho – Av. Brigadeiro Trompowsky, S/N, Ccs – Bloco G – Sala G2-050 – Cidade Universitária – Laboratório de Fisiologia Vegetal – Ilha do Fundão – 21949-900 – Rio de Janeiro, RJ – [email protected] 2 Dr. em Biofísica –UFRJ – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – Laboratório de Fisiologia Vegetal – Ilha do Fundão – 21949-900 – Rio de Janeiro, RJ – [email protected] 3 Pós-Doutorado em Bioeletrogênese – UFRJ – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – Laboratório de Fisiologia Vegetal – Ilha do Fundão – 21949-900 – Rio de Janeiro, RJ – [email protected] 4 Dra em Química Orgânica – Ufrj/ DQO – Edifício do Centro de Tecnologia – Bloco A – Sala 605 – Ilha do Fundão – Cidade Universitária – Caixa Postal 068556 – 21941-972 – Rio de Janeiro, RJ – [email protected] 5 Dra. em Biotecnologia Vegetal – UNIRIO/DCN – Centro de Ciências Biológicas e da Saúde – Av. Pasteur, 458 Prédio da ECB – 4ºandar/ Sala 415, URCA – 22290-240 – Rio de Janeiro, RJ – [email protected] ABSTRACT This work presents an efficient protocol for micropropagation of Melissa officinalis L. through axillary bud proliferation obtained from in vitro germinated seeds on basal Murashige & Skoog medium (MS). The explants were grown on MS supplemented with different growth regulators: NAA (0.5 mM); KIN (0.5 mM); BA (0.5 mM); GA3 (2.8 µM) and IAA (0.5 mM). Higher shoot proliferation and rooting rates were obtained on MS supplemented with 0.5 µM IAA. Micropropagated plants were acclimatized and transferred to soil with success. The essential oil composition in shoots of in vitro and field-grown (ex vitro) plants was determined by gas chromatography/ mass spectrometry. The major components of essential oils detected in both plant materials were pujone, neral, geraniol and geranial. M. officinalis in vitro plantlets developed on MS media, showed 1.4 higher proportions of nerol and 4.1 of geraniol, when compared with field grown plants.

principais componentes do óleo essencial encontrados em ambos os materiais vegetais foram a pujona, neral, geraniol e geranial. As plantas de Melissa officinalis desenvolvidas in vitro, em MS, apresentaram aumento de 1,4 vezes na proporção do nerol e de 4,1 na de geraniol, quando comparadas às plantas ex vitro.

Index terms: Growth regulators, medicinal plant, tissue culture.

nervousness, and rheumatism. The essential oil is a well-

RESUMO Este trabalho apresenta um protocolo rápido e eficiente para propagação in vitro de Melissa officinalis L. através da proliferação de gemas axilares de plantas obtidas de sementes germinadas em meio basal de Murashige & Skoog (MS). Os explantes foram cultivados em meio de Murashige & Skoog (MS), 1962, com adição de diferentes reguladores de crescimento: Ácido alfanaftaleno-acético (ANA – 0,5 mM); Cinetina (KIN – 0,5 mM); Benziladenina (BA – 0,5 mM); Ácido Giberélico (GA3 – 2,8 µM) e Ácido Indolacético (AIA – 0,5 mM). O alongamento e formação de segmentos nodais máximos foram obtidos com AIA. Explantes desenvolveram 5 novos brotos, com 10 cm em média e 100% de enraizamento, em 30 dias de cultura. Plantas micropropagadas foram aclimatadas e transferidas para o solo com sucesso. A composição do óleo essencial de partes aéreas de plantas produzidas in vitro e plantas crescidas em campo (ex vitro) foi determinada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Os

Termos para indexação: Reguladores de crescimento, planta medicinal, cultura de tecidos.

INTRODUCTION Melissa officinalis L. (Lamiaceae) is a well-known herb used to give fragrance to different food and beverage products. It has also been used as a medicinal plant for treatment of headaches, gastrointestinal disorders, known antibacterial and antifungal agent, and it is also responsible for the mild depressive and spasmolytic properties of the plant. Literature data pointed out antioxidant properties of methanolic extracts of Melissa officinalis, which are mostly due to high portion of phenolic acids, revealing significant antimicrobial, particularly antibacterial activity of this essential oil (MIMICA-DUKIC et al., 2004). The chemical composition of the essential oil of Melissa officinalis leaf (0.2-1% on dry weight) has been studied. The major compounds (10-40%) are citral (neral and geranial), and these are accompanied by limonene, cineole, geraniol, ß-caryophyllene and spathulenol. The

(Recebido em 06 de setembro de 2005 e aprovado em 21 de junho de 2006)

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54 leaf

SILVA, S. da et al. also

contains

polyphenolic compounds:

hydroxycinnamic derivatives with verbascoside (5.3%), flavonoids, such as luteolin 7-glucoside and luteolin 7diglucuronide (0.8%). These compounds probably intervene in the antispasmodic activity. Iridoid glucosides were also reported, and the infusion contains potassium (CARNAT et al., 1999). Cultivation of medicinal plants for the purpose of extraction of active constituents may face certain limitations such as climate, season, water availability, diseases and pests, and scarcity of naturally growing plants. Such limitations led to the use of tissue culture techniques for production of the active constituents. Tissue culture provides means of rapid propagation of a large number of uniform plants while maintaining their genotype. Beneficial uses of tissue culture for the purpose of extraction of secondary metabolites include avoidance of collection of endangered wild species; production of secondary metabolites due to rapid growth of cultures in vitro (ARIKAT et al., 2004). Due to the importance of this plant for multiple purposes, and the difficulty to produce active compounds in vitro, the application of methods that provide higher number of cloned plants of M. officinalis is justified, aiming to select high quality plant lines to extensive culture and extraction of pharmaceutical products. In Brazil, M. officinalis is used in phytomedicine by pharmaceutical industries. One of the most critical problems of phytomedicine is the natural variation of plants chemical constituents (CURRIER et al., 2000). This variation could be originated from genetical factors or under influence of environmental characteristics. The use of in vitro systems have been reported as an effective tool for obtaining genetically uniform plants which can be the source for less variable pharmaceutical preparations. Plant regeneration of M. officinalis has been

(MÉSZÁROS et al., 1999), using various types and concentrations of cytokinins, auxins and triacontanol (TANTOS et al., 1999). The aim of this work is to develop a micropropagation method in order to obtain a significant number of monoclonal plants for further field cultivation, comparing the essential oil content and composition between micropropagated and field-grown plants. MATERIALS AND METHODS Plant material Representative specimens from field grown plants of M. officinalis were selected and submitted to Erika Von Sohsten Medeiros and Angela Vaz (Rio de Janeiro Botanical Garden) for the taxonomic confirmation. A voucher nº RB – 365926 is deposited at the Herbarium of Rio de Janeiro Botanic Garden. Melissa officinalis seeds were obtained from commercial market ISLAR, batch Nº 8250. The seeds were germinated and grown to the seedling stage in vitro. Seeds were pre-treated by immersion into 2% commercial bleach solution (Globoâ) for 20 min, and then rinsed thoroughly in running tap water. After that, the seeds were surface sterilized in 70% ethanol for 20 min followed by 15 min in a 20% commercial bleach solution containing 2-3 drops of Tween 20, under aseptic conditions and rinsed three times with sterile distilled water. The seeds were cultured on MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) solid medium supplemented with 30 g.L-1 sucrose, 1.48 mM thiamineHCl, 2.43 mM pyridoxine-HCl, 4.1 mM nicotinic acid and 0.6 mM myo-inositol. The pH value was adjusted at 5.8 ± 0.1 before addition of 8 g.L-1 of agar and the media were sterilized in autoclave (120 °C during 15 min). The cultures were incubed at 25 ± 1 °C under a 16 h light / 8 h dark regime, at an irradiance of 23.0 mmol.m-².s-1 (white light illumination Sylvaniaâ fluorescent tubes).

achieved using as explants cotyledonary nodes of 10-day-

Establishment of in vitro shoot cultures

old Melissa officinalis seedlings (TAVARES et al., 1996),

From in vitro 8-day-old germinated seeds, plants (2,0-3,0 cm in length) of three different clones designated

shoot tips from plants cultivated at greenhouse

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In vitro propagation of Melissa officinalis L. and production... as clones 1, 2 e 3 were selected and axillary shoot induction takes place from nodal segments (1 cm in length) subcultivated on MS hormone-free media (MS0). These materials were used as donors of explants to be tested with different culture media: 0.5mM a-naphthaleneacetic acid (NAA); 0.5mM kinetin (KIN); 0.5mM benzyladenine (BA); 2.8 mM gibberellic acid (GA3) and 0.5mM indole-3acetic acid (IAA). Cultures were grown in 300 mL glass flasks containing 40 ml of media each. Shoot proliferation rate, length of both shoots and roots and calli formation were monitored as growth parameters. Each treatment was replicated 3 times using 100 explants per repetition. Subcultures were performed at 30 days intervals. Acclimatization A total of 60 in vitro rooted microshoots (those grown on MS + IAA during 30 days with average height of 10 cm were removed from the medium and the agar washed gently with tap water. They were transferred to 6.0 cm diameter plastic pots containing soil and humus (3:1 v/v) and kept at a greenhouse. High humidity environment was provide by covering the plants with a plastic foil and watering them, one time per day during the first 2 weeks. Then, plants were gradually exposed to greenhouse conditions for 1 month, and finally transferred to the field, where they were cultivated during one year until complete life cycle. Extraction Field-grown and fresh in vitro plantlets aerial parts (100 g each) were submitted to hydro distillation for 1.40 h, in a Clevenger type apparatus as recommended by the Brazilian Pharmacopoeia (1988), in replicate (n = 2). The time between the isolation and analysis was the same in all experiments to preclude differences in composition due to external factors (SILVA et al., 2003). Gas chromatographic and gas chromatography-mass spectrometric analysis Gas chromatography with flame ionization detection (GC/FID) was carried out on a Varian Star Model

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3350 instrument using a capillary column coated with DB5 (30 m x 0.25 mm i d , 0.25 mm film thickness; J & W Scientific, Folsom, CA, USA). The GC oven was heated using the following program: 40 oC to 220 oC at 4 oC min-1 with an initial isothermal period of 1 min, splitless. The detector and injector temperatures were held at 280 oC. Hydrogen was used as carrier gas. The injection consisted of 1.0 µL of distilled oil diluted with hexane. The GC/MS analyses were carried out on a Hewlett-Packard (Agilent Technologies, Avondale, USA) Model 5972 MSD coupled to a HP 5890 GC. The GC conditions were the same as above, except for the fact that helium was used as carrier gas. The mass spectrometer was operated on electron impact mode at 70 eV. Molecular assignments were performed with the help of the Wiley 275 standard library of mass spectra, literature data (ADAMS, 1995), authentic geraniol standard (Sigma, Part Number: G5135) and mass spectra interpretation besides the comparison with previously published elution order (KREIS & MOSAND, 1994). Quantification was performed from GC profiles using area percent, since in the literature the FID response factor for most of monoterpenes is determined as 1 (CARNAT et al., 1999). Statistical analysis Data for each experiment were subjected to analysis of variance (ANOVA) and means were compared using the Tukey-Kramer test. Percent data were submitted to significance test – difference between two percentages using the Statistica for Windows TM, 5.0 version. A significance level of 5% was used for all statistical analysis. RESULTS AND DISCUSSION In vitro multiplication of Melissa officinalis was followed during four developing cycles. Micropropagation papers usually present an efficient protocol evaluated in only one developing cycle. This kind of protocol however may fail when the cultures have to be kept during long time, many successive subcultures being necessary in order to produce large number of clonal plants.

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SILVA, S. da et al.

In vitro establishment

The influence of plant growth regulators and their

In this work three different clones of M. officinalis were used and they had shown similar development responses on in vitro cultures. The clones 1 and 2 had in vitro multiplication rate lower than the clone 3, which means a decrease in the absolute number of nodal segments (Fig. 1A and B). From these results, the clone 3 was selected to run the tests. The average number of four new nodes was produced by explant on MS0 after 30 days, and this value was used as a control to evaluate effects of the presence of growth regulators in the media (Tab. 1).

interactions on micropropagation of different plant species have been discussed in detail by Lameira et al. (2005), Rout et al. (1989), Rout & Das (1997a,b), Skirvin et al. (1990) and Zieslin et al. (1989). In this work, addition of IAA to MS presented the best results among all tested growth regulators, in all evaluated parameters. However, to shoot production there is no statistical difference to the control. The analysis of effects of the other growth regulators shows that only 0.5mM NAA was able to improve shoot production, although it is not able to promote rhizogenesis.

FIGURE 1 – Nodal segments development of three clones of Melissa officinalis on MS+ 0.5 M IAA during 30 days: A) Multiplication rate of in vitro culture from 2nd to 4th subcultures. B) Number of nodal segments developed per clone. TABLE 1 – Effect of growth regulators in Melissa officinalis axillary segments culture after four weeks of culture. Multiplication Node/ Root Root Root Rate (n° of Shoot Plantlet Frequency Number/ Length Length (CM) Nodal Segment/ x±se (%) Explant x±se (CM) x±se Explant) MS0 1.7:1B 6.8C 4:1 B 50 4.03 0.8B 1.05 1.1B 3.0 0.6B C D C C C 1.1:1 3.3 3:1 50 0.5 M KIN 3.49 1.1 0.73 0.9 2.7 0.7C C E D D C 1.1:1 2.2 2:1 50 2.8 M GA3 1.00 0.3 0.71 0.9 2.5 0.7C B B A A A 1.9:1 9.5 5:1 100 0.5 M IAA 10.00 0.9 8.97 0,8 13.7 0.8A A A C C 9.0 3:1 0 0 0.5 M NAA 3.0:1 3.33 1.6 1.1:1C 3.3D 3:1 C 0 0 0.5 M BA 3.85 5.4C *Value are means (x) ± standard error (se), n=100. Values in the same column followed by the same letter do not differ statistically at Pd”0.05 Culture Media

Shoot / Explant x±se*

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In vitro propagation of Melissa officinalis L. and production... The use of MS plus 0.5mM Kinetin or 0.5mM BA

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Acclimatization

or 0.5mM NAA promoted the development of three nodal

Melissa officinalis leaves are very sensitive to

segments per elongated plant in 30 days culture (Tab.

water loss and this process is irreversible; it was necessary

1). However, when BA was used these new shoots

to provide a high humidity environment during the first

exhibited apical necrosis. When GA3 (2.8 mM) was added

acclimatization period; plants were covered with a plastic

to medium, there was induction of only one shoot per

foil during 2 weeks before being gradually exposed to

explant and after 30 days there were 2 nodes per elongated shoot.

greenhouse conditions.

The acclimatization procedure

used for in vitro plants was successful and a total of 100%

There was no rooting in explants placed on MS added of NAA and BA. In MS medium containing KIN or GA3 and in basic MS, 50% of the shoots developed new roots, in 30 days of culture. The best result of rhizogenesis was presented by explants cultured in MS plus IAA, where 100% of shoots rooted with more than 8 new roots per explant (Tab. 1). In terms of root length, the cultures in MS supplemented with IAA presented longer roots when compared with the other media compositions used at the present work. In short, the addition of 0.5mM of IAA was chosen as that presenting the best results in all evaluated parameters (Fig. 2A). The action of IAA on the in vitro plant development was in accordance to the known effects of such hormone (CLELAND, 1995). Shoot elongation was obtained concomitantly with rooting in media MS plus 0.5 mM IAA. That is specially interesting, once it may reduce the micropropagation process through nodal segments explants to only three steps: germination, shoot elongation and multiplication concomitant to

survival rate (n=60) was obtained. Acclimatized plants appeared normal and did not exhibit any morphological abnormalities or variations. These results permitted the soil cultivation (Fig. 2B), without chemical defensives during one year up to the complete vegetative cycle (flowering). Essential oils content Comparative analysis of the chromatographic profiles showed high percentage of neral and geranial in relation to nerol and geraniol in field grown (ex vitro) plantlets and in MS0 (in vitro). The relative content of the principal components of essential oil of the aerial parts of M. officinalis are presented as mean peaks area (%) on Fig. 2C: geranial (38.13 and 43.64), neral (26.74 and 31.7), geraniol (3.29 and 15.3) and nerol (1.16 and 1.87) in plants cultured ex vitro and in vitro, respectively. Plantlets developed in vitro, on MS0 media, showed an increase of 1.4 times in the proportion of nerol and 4.1 times of geraniol, when compared with ex vitro cultured plants.

rooting; this represents gain of time, culture medium

Field plants are exposed to considerable more

and constitutes a quick micropropagation process.

stressful conditions, such as lower relative humidity, higher

Tavares et al. (1996) reported a micropropagation

light levels, and herbivory those are the more stressful.

utilizing cotyledonary nodes as explants. The highest

The latter conditions tend to favor a greater essential oil

average number of shoots in the two inoculations was

accumulation (TAVARES et al., 2004). On other hand,

obtained with 2 mg.L-1 of BA: 24 axillary shoots per

plantlets grown in vitro have been continuously exposed

explant, 7 in the first inoculation and 17 in the second

to a unique microenvironment that has been selected to

one. Shoots of the two inoculations were excised after

provide minimal stress and nearly optimal conditions for

30 and 60 days, respectively.

plant multiplication.

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SILVA, S. da et al.

FIGURE 2 – A) In vitro culture of Melissa officinalis on MS + IAA in 30 days of culture. B) Ex vitro culture, six months after transference to soil; maximum height 60 cm. C) Composition and percentage of the most abundant essential oil components of Melissa officinalis from aerial parts (100 g Fresh Weight) from in vitro e ex vitro culture.

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In vitro propagation of Melissa officinalis L. and production... CONCLUSIONS Melissa officinalis micropropagation can be made using nodal segments from in vitro plants during 5 weeks in MS media without growth regulators and posterior subculture in MS media with 0.5 mM IAA for a better development. Multiplication rates of 4.4 and 4.0 were obtained at the 3rd and 4th subcultures, respectively. It was observed a significant difference between the effects of auxins IAA and NAA. The latter exerted an unsatisfactory influence on the nodal segment formation; shoot length and rooting, when compared with the results obtained with IAA. The plants produced in vitro were vigorous and after acclimatization they were well adapted. After 1 month at the greenhouse the survival rate was 100%. Considering that the main objective of this work is to produce monoclonal plants to be used by phytomedicine industries, it is important that the method presents a large number of buds per explant. This result, plus an efficient acclimatization stage, can save time and produce monoclonal plants in sufficient number to be used in commercial field culture. Our results showed a change in the essential oil composition in the proportion of active compounds. However, the characteristics of the oil of in vitro and ex vitro M. officinalis plants were not altered. The manipulation of the culture media composition is an important biotechnological tool for the optimization

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of the essential oils production. With this technique, this work developed a protocol for highly production of plants and productivity in the components (geraniol, geranial and

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CRESCIMENTOCrescimento IN VITRO Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) 61 in vitro DE de Laelia tenebrosa (Orchidaceae)... EM DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE SAIS DE KNUDSON C E CARVÃO ATIVADO IN VITRO GROWTH OF Laelia tenebrosa (ORCHIDACEAE) IN DIFFERENT CONCENTRATIONS OF KNUDSON C SALTS AND ACTIVATED CHARCOAL APARECIDA GOMES DE ARAUJO1, MOACIR PASQUAL2, ALBA REGINA PEREIRA3, HERMINIO SOUZA ROCHA4 1

Doutoranda em Agronomia/Fitotecnia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras, MG – [email protected] 2 Dr., Professor Titular do Departamento de Agricultura – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras/MG – [email protected] 3 Doutoranda no Jardim Botânico do Rio de Janeiro – ENBT/JBRJ – Pacheco Leão 915 – 22460-030 – Rio de Janeiro, RJ. 4 Doutorando em Agronomia/Fitopatologia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras, MG – [email protected]

RESUMO Objetivou-se testar diferentes concentrações de carvão ativado adicionado ao meio Knudson C no crescimento in vitro de orquídeas. Plântulas de Laelia tenebrosa (L.A Rolfe) L.A. Rolfe com 1 a 1,5 cm de comprimento e contendo raízes, foram inoculadas em frascos contendo 40 mL de meio de cultura. Os tratamentos consistiram na combinação de concentrações de carvão ativado (0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 g L-1) e sais minerais de Knudson C (0; 50; 100; 150 e 200%) acrescidos de sacarose (20 g L-1). O meio foi solidificado com 6 g L-1de ágar e o pH ajustado para 5,8±0,1, antes da autoclavagem a 121°C e 1,1 atm por 20 minutos. Após a inoculação, os frascos foram mantidos sob 25 ± 1°C, fotoperíodo de 16 horas e 32 mM m-2 s-1 de irradiância. Após 150 dias, verificou-se que a adição de 2g L-1 de carvão ativado ao meio com metade dos sais de Knudson C promoveu melhor crescimento in vitro das plântulas de Laelia tenebrosa. Termos para indexação: Orquídea, meio de cultura, cultura de tecidos. ABSTRACT The objective of this work was to test the effect of Knudson C medium supplemented with different concentrations of activated charcoal on the in vitro growth of orchids. Plantlets of the Laelia tenebrosa (L.A Rolfe) L.A. Rolfe measuring 1-1.5 cm in length containing roots were inoculated in flasks containing 40 mL of culture medium. The treatments consisted of different concentrations of activated charcoal (0; 0.5; 1.0; 2.0 and 4.0 g L1 ) combined with Knudson C salts (0; 50; 100; 150 and 200%) supplemented with sucrose (20 g L-1). The medium was solidified with agar (6 g L-1) and pH adjusted to 5.8±0.1 before autoclaving at 121ºC and 1.1 atm during 20 minutes. After inoculation the explants were transferred to culture rooms with temperature maintained at 25±1ºC, during a 16 hours photoperiod with a light intensity of 32 µM m-2s-1. The best in vitro growth rates of

Laelia tenebrosa plantlets were obtained using Knudson C 50% supplemented wi th 2 g L-1 activated charcoal, after 150 days of supplemented with culture. Index terms: Orchid, culture medium, tissue culture.

INTRODUÇÃO A produção de orquídeas a partir germinação assimbiótica é uma alternativa viável para obtenção de grande número de plantas, em curto espaço de tempo, suprindo assim a necessidade dos produtores de orquídeas na aquisição de mudas. Na cultura de tecidos, os meios de cultura geralmente são compostos de uma fonte de carboidratos, macro e micronutrientes e outras substâncias como vitaminas, aminoácidos, açúcares, agente solidificante, reguladores de crescimento (GEORGE & SHERRINGTON, 1984) e, eventualmente, aditivos, como antibióticos, carvão ativado e componentes complexos. Knudson (1922) observou que era possível o cultivo de sementes em meio artificial, contendo minerais e açúcar, sem a presença de fungos micorrízicos. Posteriormente, em 1946, ele aperfeiçoou esse meio de cultura, sendo, atualmente, o mais utilizado comercialmente na germinação e desenvolvimento de orquídeas (ARDITTI & ERNST, 1992). No entanto, são necessários estudos,

(Recebido em 23 de fevereiro de 2006 e aprovado em 10 de julho de 2006)

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ARAUJO, A. G. de et al.

pois são descritos vários meios de cultura para muitos gêneros e espécies diferentes. No cultivo e subcultivo de plântulas do gênero Cattleya, George et al. (1987) sugerem o meio Knudson C (1946) ou Reinert & Mohr (1967). Segundo Arditti & Ernst (1992), os meios de propagação para Cattleya, Laelia, Laeliocattleya e Brassocattleya podem ser os mesmos citados anteriormente. Villalobos et al. (1994) sugerem o meio Vacin & Went (1949) para Cattleya, Encyclia e Oncidium, suplementado com 25% de água de coco e o meio Knudson C suplementado com 60 g L-1 de polpa de banana para orquídeas do gênero Stanhopea. O carvão ativado normalmente é adicionado ao meio de cultura em concentrações que variam de 0,2% a 3% (BEYL, 2000). O seu efeito não-seletivo pode proporcionar resultados negativos na micropropagação. Pesquisas relatam a adsorção de tiamina, ácido nicotínico (WEATHERHEAD et al., 1978), piridoxina, ácido fólico, reguladores de crescimento e quelatos de ferro (JOHANSSON et al., 1990). Entre os efeitos proporcionados pela adição do carvão ativado ao meio de cultura, principalmente à organogênese e à embriogênese estão: escurecimento do meio de cultura, favorecendo o enraizamento; adsorção de substâncias inibitórias produzidas pelo próprio meio ou explante; adsorção de reguladores de crescimento e outros compostos orgânicos e liberação de substâncias naturalmente presentes no carvão que beneficiariam o crescimento in vitro das culturas (PAN & STADEN, 1998). Arena & Pastur (2001) citam que a adição de carvão ativado ao meio de cultura promoveu alongamento das brotações de Berberis buxifolia, mas reduziu o índice de multiplicação. Hazra et al. (2002) relataram o efeito sinergístico do carvão ativado na multiplicação e enraizamento de brotações de algodoeiro. Amin & Jaiswal

A diversidade de resultados obtidos com a utilização de carvão ativado deve-se, principalmente, ao genótipo da espécie em questão, à adsorção de algumas substâncias químicas e compostos orgânicos, além de metabólitos tóxicos liberados no cultivo in vitro (Wang & Huang, 1976). Este trabalho teve como objetivo verificar efeito de diferentes concentrações de sais de Knudson C e carvão ativado sobre o crescimento in vitro de plântulas de orquídea da espécie Laelia tenebrosa (L.A Rolfe) L.A. Rolfe. MATERIAL E MÉTODOS Plântulas da espécie Laelia tenebrosa com 1 a 1,5 cm de comprimento oriundas de sementes germinadas in vitro e contendo raízes, foram inoculadas em frascos contendo 40 mL do meio de cultura Knudson C, nas concentrações de 0 (apenas água destilada e ágar), 50, 100 (concentração da formulação original), 150 e 200% de sais minerais, combinado com carvão ativado (0; 0,5; 1; 2 e 4 mg L-1) suplementado com sacarose (20 g L-1). O pH do meio foi ajustado para 5,8 ± 0,1, antes da adição de ágar (6 g L-1). O meio foi vertido em frascos de vidro com capacidade para 250 cm3, vedados com tampas plásticas translúcidas não perfuradas e autoclavados à pressão de 1,1 atm e à temperatura do 121°C, durante 20 minutos. Após a inoculação, os frascos contendo os explantes foram mantidos em sala de crescimento com irradiância em torno de 32 mmol m-2 s-1, temperatura de 25 ± 1°C e fotoperíodo de 16 horas. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 5 x 5, com quatro repetições de cinco plântulas cada uma. Decorridos 150 dias, avaliou-se a média do número de folhas, número de raízes, comprimento da maior raiz, comprimento da parte aérea e massa fresca de plântulas. Os dados foram comparados por meio de regressão polinomial empregandose o programa Sisvar (FERREIRA, 2000).

(1987), Anderson (1980) e Damiano (1978) relataram o efeito favorável do carvão, quando utilizado em baixas

RESULTADOS E DISCUSSÃO

concentrações no enraizamento de brotações de

Apenas para a variável número de folhas houve interação entre os níveis de sais e carvão ativado. Porém,

morangueiro, framboeseira e goiabeira, respectivamente.

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Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae)...

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por meio do teste F, somente as concentrações de 50 e

meio de cultura inibe a formação de folhas em plântulas de

100% de sais do meio Knudson C foram significativas em

Brassocattleya ‘Pastoral’ x Laeliocattleya ‘Amber Glow’.

relação às concentrações de carvão ativado.

O efeito não seletivo do carvão ativado pode proporcionar

Os melhores resultados (6,5 e 5,85) foram verificados com 50% (metade) dos sais de Knudson C -1

combinado com 2,75 g L de carvão ativado e 100% de -1

sais com 4 g L de carvão, respectivamente (Figura 1). Com o aumento da concentração do meio de cultura, há necessidade de maior concentração de carvão. Sendo assim, o meio com 50% de sais, além de proporcionar melhores resultados, é menos oneroso. Estes resultados contradizem os de Silva et al. (2003), que verificaram que a adição de carvão ativado ao

FIGURA 1 – Número de folhas em plântulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentrações de sais de Knudson C e carvão ativado.

resultados negativos na micropropagação (PAN & STADEN, 1998). À medida em que aumentaram as concentrações de sais de Knudson C, maiores quantidades de raízes foram formadas (Figura 2A). Observou-se maior número de raiz (4,3) com 96,5% de sais. Para o fator carvão ativado, as melhores respostas (3,95 raízes) foram verificadas com a utilização de 3,04 g L-1 adicionadas ao meio de cultura (Figura 2B). Para muitas espécies, o enraizamento é favorecido pela adição de carvão ativado ao meio de cultura. Hazra et al. (2002) relataram o efeito sinergístico do carvão ativado na multiplicação e enraizamento de brotações de algodoeiro. O meio MS com metade dos sais minerais, acrescido de 20 g L-1 de sacarose, 7 g L-1 de ágar e 1 g L-1 de carvão ativado, promoveu maior quantidade de raízes em plântulas de Cattleya nobilior Rchb. f. (REIS et al., 2003). Segundo Paiva et al. (2005), além de um equilíbrio hormonal favorável à formação de raízes, outros fatores internos têm sido relacionados com a iniciação do processo de enraizamento, como presença de sacarose, alta relação C/N e nutrientes minerais (fósforo, cálcio, zinco e boro). O meio Knudson C não possui micronutrientes, apresenta uma concentração maior de cálcio e tem baixas

FIGURA 2 – Número de raízes em plântulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentrações de sais de Knudson C (A) e concentrações de carvão ativado (B). Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 61-67, 2006

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concentrações de N e K, em relação ao MS e WPM, o que provavelmente favoreceu tanto o número quanto o comprimento de raízes (PASQUAL, 2001) O maior comprimento de raiz (3,31 cm) foi verificado com a utilização de 100% de sais de Knudson C. A partir do ponto máximo (100%) houve diminuição do comprimento radicular, provavelmente devido ao desbalanço nutricional (Figura 3A). Com o aumento das concentrações de carvão ativado houve um incremento linear no comprimento de raízes. Melhores resultados foram observados com a utilização de 4 g L–1 de carvão ativado (Figura 3B). Como a relação foi direta, pode-se inferir que o efeito estimulante do carvão ativado no comprimento da maior raiz continuaria para concentrações superiores a 4 g L-1. A adição de carvão ativado no meio de cultura foi benéfica, promovendo tanto o número quanto o crescimento de raízes. O carvão contém impurezas que podem favorecer o crescimento de raízes já existentes e induzir emissão de novas raízes (PASQUAL, 2001). Melhores resultados para comprimento da parte aérea (1,8 cm) foram observados quando se utilizou o meio Knudson C na concentração de 121% de sais (Figura 4A), porém, na concentração de 50%, obtiveram-se explantes com 1,7 cm de comprimento. Essa diferença observada (0,1 cm) é muito pequena, o que não justifica a utilização de um meio mais concentrado, mas a redução do mesmo à sua metade.

O enraizamento in vitro pode ser favorecido com o uso de meio de cultura com a metade ou 75% da concentração normal de sais. Em algumas espécies, altas concentrações de sais, principalmente a presença de íons amônio, favorecem o desenvolvimento de raízes, enquanto que em outras, podem ser inibidoras (PASQUAL et al., 2001). O maior comprimento da parte aérea (1,9 cm) foi obtido na presença de 4 g L–1 de carvão ativado (Figura 4B); a concentração de 2 g L –1 proporcionou um comprimento de 1,8 cm. Comparando-se os níveis 4 e 2 g L–1 de carvão ativado, nota-se pequena diferença (0,1 cm), o que justifica a utilização de 2 g L–1. O carvão ativado contém impurezas que quando liberadas no meio de cultura podem beneficiar ou não o crescimento in vitro. Simões et al. (1999) verificaram que a concentração de 1 g L-1 de carvão ativado acrescida ao meio Knudson C proporciona o melhor desenvolvimento de brotos de Epidendrum sp. e Dendrobium sp. Maior massa fresca de plântulas (0,144g) foi verificada com a utilização de 50% de sais de Knudson C, ponto a partir do qual houve diminuição no peso (Figura 5A). Provavelmente, essa redução ocorreu devido à toxidez. A utilização de 4 g L -1 de carvão ativado proporcionou uma massa de 0,185 g nas plântulas frescas (Figura 5B).

FIGURA 3 – Comprimento da maior raiz em plântulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentrações de sais de Knudson C (A) e carvão ativado (B). Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 61-67, 2006

Crescimento in vitro de Laelia tenebrosa (Orchidaceae)...

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FIGURA 4 – Comprimento da parte aérea em plântulas de Laelia tenebrosa cultivadas em diferentes concentrações de sais de Knudson C (A) e carvão ativado (B).

FIGURA 5 – Massa fresca de plântulas de L. tenebrosa cultivadas em diferentes concentrações de sais de Knudson C (A) e carvão ativado (B). O carvão ativado é comumente utilizado na cultura de tecidos de plantas. Seu efeito é atribuído à adsorção de substâncias tóxicas produzidas pelas plantas, adsorção de fitorreguladores do meio e escurecimento do meio onde se desenvolvem as raízes das plantas (GEORGE, 1993). O melhor desenvolvimento de Phalaenopsis in vitro ocorreu na presença de carvão ativado na concentração de 2 g L-1, indicando que este possa ser um elemento importante no processo (BRESSAN et al., 1999). Apesar do carvão ativado na concentração de 4 g -1 L ter proporcionado melhores resultados, verificou-se que na concentração de 2 g L-1, os efeitos apresentam uma diferença mínima. Embora o carvão ativado não seja o componente de maior custo no preparo de meio de cultura,

a sua redução, juntamente com os sais minerais, é economicamente favorável, especialmente para a produção comercial de mudas. CONCLUSÃO A adição de 2 g L-1 de carvão ativado ao meio de cultura Knudson C com metade (50%) de sais minerais promoveu melhor crescimento em plântulas de Laelia tenebrosa, cultivadas in vitro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMIN, M. N.; JAISWAL, V. S. Rapid clonal propagation of guava through in vitro shoot proliferation on nodal explants of mature trees. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 9, n. 3, p. 235-243, 1987.

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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 61-67, 2006

68

PROPAGAÇÃO IN VITRO ARAUJO, DE PLÂNTULAS DE ORQUÍDEA EM A. G. de et al. DIFERENTES MEIOS DE CULTURA E CONCENTRAÇÕES DE CITOCININA

IN VITRO PROPAGATION OF ORCHID PLANTLETS CULTIVATED IN DIFFERENT CULTURE MEDIA AND CYTOKININ CONCENTRATIONS APARECIDA GOMES DE ARAUJO1, MOACIR PASQUAL2, ADRIANO BORTOLOTTI DA SILVA3, FABÍOLA VILLA3, HERMÍNIO SOUZA ROCHA3, FERNANDA CARVALHO COSTA4 1

Doutoranda em Agronomia/Fitotecnia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras, MG – [email protected] 2 Professor Titular Departamento Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/ UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200000 – Lavras, MG – [email protected] 3 Doutorando em Agronomia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200000 – Lavras, MG. 4 Departamento de Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37.200-000 – Lavras, MG – [email protected] RESUMO A taxa de multiplicação de orquídeas a partir de métodos convencionais é bastante baixa, não atendendo as necessidades comerciais. A cultura de tecidos permite maiores taxas de multiplicação e obtenção de plantas uniformes e sadias. Objetivou-se estudar a influência da citocinina BAP (6benzilaminopurina) em diferentes meios de cultura, na propagação in vitro de plântulas híbridas de Brassocattleya ‘Pastoral’x Laeliocattleya ‘Amber Glow’ Plântulas com aproximadamente 1,5±0,5 cm de comprimento, obtidas assimbioticamente, foram transferidas para frascos com capacidade de 250 cm3 contendo 40 mL das formulações salinas de MS, WPM e Knudson C, combinados com 0; 0,5; 1,0; 2,0; e 4,0 mg L-1 de BAP, acrescidos de 2 g L-1 de carvão ativado, solidificado com 6 g L-1 de ágar e pH ajustado para 5,8±0,1. Após a inoculação, os frascos foram incubados a 25±2oC, 35 ìmol.m-2.s-1 de intensidade luminosa e sob fotoperíodo de 16 horas. Após 90 dias, observou-se que melhores resultados para propagação in vitro em plântulas de orquídea Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’ são obtidos com o meio WPM. A suplementação de 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro. Para a multiplicação, maior quantidade de brotos é conseguida em meio MS na ausência de BAP.

in flasks of 250 cm3 volume, containing 40 mL MS, WPM and Knudson C salt formulations, combined with BAP (0; 0.5; 1; 2 and 4 mg L-1), supplemented with 2 g L-1 activated charcoal, solidified with 6 g L-1 agar and pH adjusted for 5.8 ± 0.1. After the inoculation, the plantlets maintained in a growth room at 25±2ºC, 35 mMol m -2 s -1 light intensity and 16 hours photoperiod. After 90 days, the best results for the in vitro propagation of orchid plantlets Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’ were obtained with half strength WPM. The supplementation of 4 mg L-1 BAP to the WPM medium favors in vitro growth. For the multiplication phase, the largest number of sprouts is achieved with full strength MS medium in the absence of BAP.

Termos para indexação: Orquídea, crescimento in vitro, citocinina.

1983), totalizando 7% das plantas ornamentais do mundo

ABSTRACT The multiplication rate of orchids by conventional methods is considerably low and does not attend its commercial needs. Tissue culture results in larger multiplication rates and produces uniform and healthy orchid plantlets. The objective of this work was to study the influence of the cytokinin BAP (6benzilaminopurine) in different culture media, for ther in vitro propagation of Brassocattleya ‘Pastoral’x Laeliocattleya ‘Amber Glow’ hybrid plantlets. Plantlets measuring approximately 1.5 ± 0.5 cm length, deriving from in vitro germination were inoculated

A propagação de orquídeas pode ser tanto vegetativa quanto por meio de sementes. Estas, embora produzidas em grande quantidade, não possuem endosperma funcional prescindindo para tanto da associação simbiótica com fungos micorrízicos, dentre os quais, a Rhizoctonia que é um dos gêneros mais importante (PIERIK, 1987; SHEEHAN, 1983).

Index terms: Orchid, in vitro growth, cytokinin.

INTRODUÇÃO As orquídeas são consideradas as plantas ornamentais há mais tempo cultivadas pelo homem. Pertencem à família Orchidaceae, a maior entre as monocotiledôneas e também entre as plantas ornamentais, com 600 - 800 gêneros e 25.000-35.000 espécies (SHEEHAN, (Van Der PIJL & DODSON, 1966).

(Recebido em 08 de dezembro de 2005 e aprovado em 10 de julho de 2006)

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 68-73, 2006

Propagação in vitro de plântulas de orquídea... Knudson (1922) observou que era possível o cultivo de sementes em meio artificial, contendo apenas sais

69

no sucesso da micropropagação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).

nutritivos e açúcar, na ausência de fungos. Posteriormente,

O maior entrave no processo de micropropagação

em 1946, o mesmo autor aperfeiçoou este meio de cultura

de orquídeas está relacionado ao tempo necessário para a

sendo, atualmente, um dos mais utilizados comercialmente

produção de mudas a partir de plantas híbridas

na germinação e desenvolvimento de orquídeas (ARDITTI

selecionadas e a utilização de meio de cultura adequado

& ERNST, 1992). No entanto, são necessários estudos,

para cada espécie. Assim, objetivou-se estudar o efeito de

pois são descritos vários meios de cultura para muitos

diferentes concentrações de BAP e formulações de minerais

gêneros e espécies diferentes. O meio de cultura mais

nutritivos em meios de cultura na propagação in vitro de

utilizado na cultura de tecidos em geral é o MS (Murashige

plântulas de orquídea oriundas do híbrido Brassocattleya

& Skoog, 1962), podendo-se encontrar o uso de outros

‘Pastoral’ x Laeliocattleya ‘Amber Glow’.

meios como Knudson C (1946) e WPM (Wood Plant

MATERIAL E MÉTODOS

Medium) de Loyd & McCown (1980). Reguladores de crescimento em diferentes

Plântulas híbridas oriundas de sementes

concentrações têm sido usados conforme a espécie e a

germinadas assimbioticamente, em meio Knudson C,

metodologia utilizada. Podem ser necessários para a

obtidas do cruzamento entre Brassocattleya ‘Pastoral’ x

germinação de sementes, formação de calos e brotações

Laeliocattleya ‘Amber Glow’, com aproximadamente

adventícias (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998;

1,5±0,5 cm de comprimento, foram transferidas para frascos

PASQUAL, 2001).

de 250 cm3 de capacidade contendo 40 mL de meio de

O regulador de crescimento BAP (6-

cultura e vedados com tampas plásticas translúcidas. Os

benzilaminopurina) é uma citocinina largamente utilizada

tratamentos consistiram de diferentes formulações salinas

para estimular a indução de brotos em plantas ornamentais.

(MS, WPM e Knudson C, em suas formulações originais)

Para o cultivo in vitro de orquídeas do grupo Cattleya, a

combinadas com 0; 0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg L-1 de BAP,

citocinina BAP, geralmente é utilizada nas concentrações

acrescidos de 2 g L-1 de carvão ativado, solidificado com

que variam entre 0,05 e 10 mg L-1 (CARVALHO, 2002).

6 g L-1 de ágar e pH ajustado para 5,8±0,1 antes da

Martini et al. (2001), trabalhando com a orquídea

autoclavagem obtida a 121ºC e 1 atm, por 20 minutos.

Gongora quinquenervis, observaram que a presença do

Posteriormente à inoculação, os frascos foram

BAP inibe a multiplicação de calos e o potencial

transferidos para sala de crescimento com temperatura

organogênico. Silva (2003) concluiu que para o estádio de

de 25±2ºC, fotoperíodo de 16 horas e 35 mmol.m-2.s-1 de

subcultivo de Brassocattleya ‘Pastoral’ x Laeliocattleya

intensidade luminosa fornecida por lâmpadas do tipo

‘Amber Glow’ não há necessidade da adição de BAP como

(Grow-lux) e luz do dia especial. O delineamento

estímulo ao desenvolvimento geral do explante. Melhor

experimental utilizado foi inteiramente casualizado, no

proliferação de brotos, formação de raízes, número de

esquema fatorial 3 x 5, com cinco repetições de quatro

folhas e comprimento de brotos em Dendrobium foram

plântulas cada, sendo cada repetição composta por um

-1

-1

obtidos com 2,5 mg L de BAP + 0,5 mg L de ANA, adicionados ao meio MS (TALUKDER et al., 2003).

frasco. Após 90 dias da instalação do experimento, foram

Além do tipo de meio, outro aspecto importante na

avaliados: número médio de brotos, comprimento médio

multiplicação in vitro está relacionado com o tipo de

da parte aérea, número médio de raízes, número médio de

citocinina e sua concentração, sendo ambos determinantes

folhas e média da massa fresca total de plântulas.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 68-73, 2006

70

ARAUJO, A. G. de et al. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para a variável número de folhas não houve significância dos fatores isolados, nem da interação entre eles. O número de raízes e massa fresca total de plântulas apresentaram significância apenas para o fator meio de cultura, enquanto que para número de brotos e comprimento da parte aérea a interação dos fatores foi significativa (Tabela 1). Com relação ao número de brotos, observou-se interação entre os fatores BAP e os meios de cultura utilizados (Tabela 1). Porém, pelo teste F verificou-se que apenas o meio MS foi significativo em relação às concentrações de BAP (Figura 1). O maior número de brotos (3,34) foi registrado na formulação de MS adicionado de 4,0 mg L-1 de BAP.

Entretanto, na ausência dessa citocinina, foi observada a formação de 3,04 brotos/planta (Figura 1). Diante da pequena diferença na quantidade média de brotos formados entre a maior concentração e o tratamento sem o regulador de crescimento, justifica-se a utilização do meio de cultura sem o BAP. Estes resultados concordam com Silva (2003) que obteve maior número de brotos (2 brotos) na ausência de BAP, para esse mesmo híbrido, porém em meio Knudson C. A não utilização de reguladores de crescimento adicionados ao meio de cultura vai influenciar na redução dos custos de produção de mudas, já que esse é um dos componentes mais onerosos. Isso é extremamente importante, principalmente, para laboratórios comerciais.

TABELA 1 – Resumo da análise de variância para as características médias de: número de folhas (NF), número de raízes (NR), número de brotos (NB), comprimento da parte aérea (CPA) e massa fresca total de plântulas (MFP) e respectivos coeficientes de variação (CV). Fontes de variação

GL

Quadrados médios

NF NR NB Meios 2 12,5683 ns 16,2740** 0,1483 ns BAP 4 18,6198 ns 4,4693 ns 0,4408 ns ns ns Meio x BAP 8 24,3984 1,3417 1,7417 ** Resíduo 45 12,4475 2,1329 0,5055 CV (%) 34,67 30,81 28,01 **, * significativo a 1% e 5% de probabilidade, respectivamente, pelo teste F.

CPA 5,3139** 0,3373 ns 1,3579 * 0,5961 24,43

MFP 0,2372* 0,0075 ns 0,0459 ns 0,0662 51,00

FIGURA 1 – Efeito do meio de cultura MS e concentrações de BAP no número médio de brotos em plântulas híbridas de Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’, após 90 dias da incubação. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 68-73, 2006

Propagação in vitro de plântulas de orquídea... O estímulo à brotação em plântulas de Spathoglottis plicata Griff. ocorreu em meio MS suplementado com 10 mg L-1 de BAP e 2,5 mg L-1 de ANA, tendo o enraizamento estimulado com 2,0 mg L-1 de AIB (NAYAK et al., 1999); TDZ também é utilizado em associação com BAP para regeneração de brotos de Rhynchostylis (BUI Le al., 1999) e de Anoectochilus (LI et al., 1999), todas orquidaceaes. Observou-se interação entre o tipo de meio de cultura e o BAP no que diz respeito ao comprimento de parte aérea das plântulas (Tabela 1). Pelo teste de F, apenas o meio WPM foi significativo em relação às concentrações de BAP (Figura 2). O maior comprimento da parte aérea (4,7 cm) foi observado quando se utilizou o meio WPM combinado com 4,0 mg L-1 de BAP (Figura 2). Como a relação foi direta, pode-se inferir que o efeito estimulatório do BAP sobre o crescimento da parte aérea continuaria mesmo em concentrações maiores que 4,0 mg L-1. Talukder et al. (2003) obtiveram melhor comprimento de brotos (0,472 cm) em plântulas de Dendrobium com utilização de 2,5 mg L-1 de BAP + 0,5 mg L-1 de ANA, adicionados ao meio MS. Relativo ao número médio de raízes, houve significância apenas para o fator meio de cultura (Tabela 1). Na Tabela 2, verifica-se que os maiores valores foram obtidos

71

com os meios WPM (5,57) seguido do MS (4,87), sendo os menores valores verificados no meio Knudson C (3,78). A emissão de novas raízes é favorecida pelo cálcio e pelo boro. O meio Knudson C apresenta uma concentração maior de cálcio e menor de boro em relação aos meios MS e WPM, que possuem concentrações semelhantes de ambos. Segundo Pierik (1987), em concentrações mais elevadas (1 a 10 mg L-1), as citocininas podem induzir a formação de gemas adventícias, quebrando a dominância apical e retardando a formação de raízes. Talukder et al. (2003) encontraram maior número de raízes (1,93/explante) em plântulas de Dendrobium com utilização de 2,5 mg L-1 de BAP + 0,5 mg L-1 de ANA, adicionados ao meio MS. O estímulo ao enraizamento em Spathoglottis plicata ocorreu em meio MS suplementado com 2,0 mg L-1 de AIB (NAYAK et al., 1999). TABELA 2 – Efeito de diferentes meios de cultura sobre o número médio de raízes em plântulas híbridas de Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’.

Meios de Cultura WPM MS KC

Número médio de raízes 5,57 a 4,87 a 3,78 b

Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5%.

FIGURA 2 – Comprimento médio da parte aérea em plântulas híbridas Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’ cultivadas em meio de cultura WPM e diferentes concentrações de BAP. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 68-73, 2006

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ARAUJO, A. G. de et al.

O efeito ora inibitório, ora estimulatório dos fitorreguladores na formação de brotos e raízes em diferentes plantas pode estar associado à própria concentração, bem como a absorção dos reguladores de crescimento pelo substrato (GEORGE, 1996), à habituação (SANTANA & PAIVA, 2001) ou à deficiência de proteína ligante promotora da atuação das citocininas (TAIZ & ZEIGER, 1998). O número de folhas não apresentou diferenças significativas para os tratamentos estudados, isoladamente, nem houve interação entre eles (Tabela 1). Talukder et al. (2003) obtiveram maior número de folhas (4,25/plântula) em Dendrobium com utilização de 2,5 mg L1 de BAP + 0,5 mg L-1 de ANA, adicionados ao meio MS. Para massa fresca de plântulas houve significância apenas para o fator meio de cultura, isoladamente (Tabela 1). Através do teste de médias constatou-se maior massa de plântulas frescas nos meios WPM e MS, com 0,524 e 0,503g, respectivamente. Resultado inferior (0,326g) foi registrado em meio Knudson C (Tabela 3). TABELA 3 – Efeito do meio de cultura na massa fresca total de plântulas do híbrido Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’. Massa fresca total de Meios de Cultura plântulas (g) WPM 0,524 a MS 0,503 a KC 0,326 b Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5%. Dignart (2003), estudando a germinação in vitro de sementes de Cattleya nobilior Rchb.f. em diferentes meios de cultura (MS, WPM, Knudson C e B5 de GAMBORG et al., 1968), observou que não houve diferenças entre os meios utilizados. O BAP adicionado ao meio de cultura provocou aumento da taxa de brotação a partir de 1 ìmol/L. Segundo (PASQUAL, 2001), os meios MS e WPM possuem concentrações similares de micronutrientes e são

ricos em nitrogênio (N) e potássio (K). Já o meio Knudson C não possui micronutrientes e tem baixas concentrações de N e K, em relação ao MS e WPM. Os melhores resultados para as variáveis analisadas foram observados em meio WPM e MS. Essa resposta, provavelmente, deveu-se ao fato de que o meio Knudson C possui diferentes sais minerais e, embora seja muito utilizado na germinação de sementes de orquídeas, parece não propiciar condições satisfatórias para o desenvolvimento de plântulas de algumas espécies de orquídeas. Sabe-se que existe uma relação entre o número de brotos e seu tamanho e nessa relação quanto maior for o número de brotos, menor o tamanho dos mesmos (GEORGE, 1996). Essa relação fez-se presente até a concentração de 2,0 mg L-1 de BAP em Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’. No entanto, em concentrações superiores tanto o número quanto o comprimento dos brotos aumentaram. Tal diversidade de resultados está relacionada principalmente ao genótipo da espécie, meio de cultura e, possivelmente, à interferência na ação dos reguladores de crescimento. Segundo Malaure et al. (1991), diferentes efeitos dos reguladores de crescimento podem ocorrer para diferentes espécies, inclusive variações dentro de uma mesma espécie. Em orquídeas o efeito dos reguladores de crescimento e de meios de cultura são diversificados, principalmente quando se utiliza um híbrido trigenérico, com alto grau de heterozigose. CONCLUSÕES Melhores resultados, para propagação in vitro de plântulas de orquídea Bc ‘Pastoral’ x Lc ‘Amber Glow’ são obtidos com o meio WPM. A suplementação de 4 mg L-1 de BAP no meio WPM favorece o crescimento in vitro. Para a multiplicação, maior quantidade de brotos é conseguida em meio MS na ausência de BAP. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARDITTI, J.; ERNST, R. Micropropagation of orchids. New York: John Wiley & Sons, 1992. 682 p.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 68-73, 2006

Propagação in vitro de plântulas de orquídea...

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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 68-73, 2006

EFEITO DO VÍRUS DAS ESTRIAS SILVEIRA, D. G. et al. DA BANANEIRA NA MICROPROPAGAÇÃO E NO CRESCIMENTO DAS PLANTAS DA CULTIVAR CAIPIRA DURANTE A ACLIMATIZAÇÃO1

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EFFECT OF BANANA STREAK VIRUS ON MICROPROPAGATION AND PLANT GROWTH OF CULTIVAR CAIPIRA DURING ACLIMATIZATION DANIELA GARCIA SILVEIRA2, ANTÔNIO DA SILVA SOUZA3, PAULO ERNESTO MEISSNER FILHO3, TALES MILER SOARES4, RANULFO CORREA CALDAS3, KÁTIA REGINA BARBOSA LEÃO5 1

Parte da Dissertação de Mestrado apresentada pelo primeiro autor ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias da Escola de Agronomia/UFBA – Cruz das Almas, BA. 2 Doutoranda em Botânica – Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS – Feira de Santana, BA – [email protected] 3 Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical – Caixa Postal 007 – 44380-000 – Cruz das Almas, BA. 4 Doutorando da Escola Superior Luis de Queiroz/Esalq – Piracicaba, SP – [email protected] 5 Engenheira Agrônoma, M.Sc, EBDA – Cruz das Almas, BA – 44380-000 – [email protected]

RESUMO Avaliaram-se os efeitos da infecção pelo vírus das estrias de bananeira (Banana Streak Virus, BSV) no desenvolvimento in vitro e no crescimento das plantas da cultivar Caipira durante a aclimatização. Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado com dois tratamentos: plantas sadias e plantas infectadas pelo BSV, com, respectivamente, 24 e 28 repetições. Os explantes foram desinfestados e estabelecidos em meio MS básico suplementado com 30 g/L de sacarose, solidificado com 2 g/L de ‘Phytagel’ e pH ajustado em 5,8. Foram efetuados cinco subcultivos em meio com 4 mg/L de BAP (6benzilaminopurina) e as plantas obtidas foram enraizadas nesse mesmo meio de cultura sem reguladores de crescimento. Após essa etapa, transferiram-se as plantas para a aclimatização em câmara úmida, onde permaneceram por 30 dias. Avaliaram-se as taxas de multiplicação, a presença in vitro dos sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas infectadas durante a micropropagação e aclimatização, as perdas por contaminação envolvendo fungos e bactérias nas fases da micropropagação e a altura das plantas na fase da aclimatização. A infecção pelo BSV não afetou significativamente a multiplicação e o crescimento in vitro das plantas, sendo os sintomas do vírus visíveis em todas as fases da micropropagação e na aclimatização das plantas infectadas. A maior porcentagem de contaminação ocorreu na fase de estabelecimento in vitro dos explantes, independentemente dos tipos de plantas utilizadas. Após 30 dias de aclimatização, as plantas com BSV apresentaram altura inferior às plantas sadias. A presença do vírus não influenciou a taxa de multiplicação dos explantes, porém afetou o crescimento das plantas infectadas. Termos para indexação: Musa, BSV, cultura de tecidos, propagação in vitro.

used experimental design was a completely randomized with two treatments: healthy plants and plants infected by BSV, with 24 and 28 replications, respectively. The explants were disinfected and established in a basic MS medium supplemented with 30 g/L sucrose, solidified with 2 g/L ‘Phytagel’ and pH adjusted to 5.8. Five subcultures were carried out in a medium containing 4 mg/L BAP (6-benzylaminopurine), and the plantlets were rooted in the same culture medium without growth regulators. Afterwards, the plantlets were transferred to a humid chamber for acclimatization during a 30-day period. Multiplication rates, presence of BSV symptoms on in vitro explants obtained from plants infected during the micropropagation and acclimatization periods, losses caused by fungal and bacterial contamination, and plantlet height at the acclimatization stage were evaluated. The infection by BSV presented no significant effect on the multiplication rate and in vitro plant growth, although the virus symptoms were visible in all the micropropagation phases and during the acclimatization of infected plants. The highest percentage of contamination occurred during the in vitro establishment phase regardless the used plants. After 30 days of acclimatization, the plants with BSV presented a lower height compared to the healthy plants. Although the presence of the virus had no influence on the explant multiplication rate, it affected the growth of infected plants. Index terms: Musa, BSV, tissue culture, in vitro propagation.

INTRODUÇÃO As bananeiras estão sujeitas as várias doenças causadas por fungos, bactérias, nematóides e vírus, que são limitantes à sua capacidade de produção. Entre as

ABSTRACT The effects of the banana streak virus (BSV) infection on in vitro development of the cultivar Caipira were evaluated. The

viroses que ocorrem no Brasil, destaca-se a causada pelo vírus das estrias da bananeira (Banana streak virus, BSV)

(Recebido em 12 de abril de 2006 e aprovado em 28 de agosto de 2006)

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mudas infectadas sua principal forma de disseminação

no Banco de Germoplasma de Bananeira da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical e plantas infectadas com BSV com 28 repetições. Foram usadas mudas do tipo chifrinho, sendo que as matrizes infectadas com BSV, com altura média de 12 cm, foram infestadas pela cochonilha vetora Planacoccus citri Risso alimentadas em folhas de banana ‘Mysore’ com sintomas de BSV, em casa-devegetação. Aproximadamente 15 dias após a infestação todas as 28 plantas estavam com os sintomas da virose.

(LOCKHART & AUSTREY, 1988; LOCKHART, 1994). A

Para o estabelecimento in vitro, realizou-se a limpeza

transmissão é feita de maneira semi-persistente pela cochonilha-

das matrizes por meio de uma série de cortes, removendo-

dos-citros, Planococcus citri Risso, e pela cochonilha-da-cana-

se parte do rizoma e do pseudocaule até o tamanho

de-açúcar, Saccharicoccus sacchari cocherell (LOCKHART,

aproximado de 5,0 cm de altura por 1,5 cm de diâmetro,

1993; LOCKHART & AUSTREY, 1988).

lavando-se com detergente e água deionizada. A

que é particularmente importante para os programas de melhoramento genético e de multiplicação comercial de cultivares, uma vez que pode ser incorporada ao genoma e transmitida pelas sementes de plantas infectadas (DANIELLS et al., 1995), além de não existir um método eficiente para limpar uma planta infectada com BSV (LOCKHART, 1994). Esse vírus não é transmitido mecanicamente, sendo as

O BSV inicialmente causa na bananeira um estriado

desinfestação foi feita em câmara de fluxo laminar,

clorótico de linhas descontínuas, dispersas e concentradas

imergindo os explantes em solução de álcool 70%, por

em partes da lâmina foliar. Com o envelhecimento das

cinco minutos, e em solução 1:1 de água sanitária comercial

folhas, o estriado causa necrose de coloração marrom-café

(2% de cloro ativo) com água deionizada, por 30 minutos.

a negro (RAMIREZ & RIVERA, 1994). As plantas

Em seguida, foram realizadas três lavagens com água

infectadas geralmente não mostram sintomas em todas as

deionizada esterilizada e reduzidos os explantes até o

folhas (CORDEIRO & KIMATI, 1997; LOCKHART, 1986).

tamanho final de 0,6 cm de altura por 0,4 cm de diâmetro.

Outros sintomas do BSV são a redução do vigor da planta

As etapas de estabelecimento, multiplicação e

e a diminuição do tamanho dos frutos, que também ficam

enraizamento foram realizadas em meio nutritivo MS básico

deformados (RAMIREZ & RIVERA, 1994).

(MURASHIGE & SKOOG, 1962), suplementado com 30 g/

Este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos

L de sacarose, solidificado com 2 g/L de “Phytagel” e pH

da infecção pelo BSV na multiplicação in vitro e no

ajustado para 5,8. Apenas na fase de multiplicação o meio

crescimento durante a aclimatização das plantas de

MS foi suplementado com 4 mg/L de 6-benzilaminopurina

bananeira da cultivar Caipira. Além disso, avaliou-se a taxa

(BAP). Em todas as etapas os explantes foram dispostos

de contaminação por fungos e bactérias na etapas da

sobre 25 mL de meio de cultura, em frascos com 12 cm de

micropropagação, devido a importância dessa variável na

altura por 5 cm de diâmetro.

multiplicação in vitro das plantas.

A multiplicação foi realizada em cinco subcultivos das gemas e brotos, sendo efetuada a subdivisão longitudinal dos explantes sempre que possível. O estabelecimento e os cinco subcultivos foram realizados com intervalos de 30 dias. Após os subcultivos, as plantas permaneceram 30 dias em enraizamento. O estudo foi desenvolvido sob condições de temperatura de 27 ± 1ºC, fotoperíodo de 16 horas e intensidade

MATERIAL E MÉTODOS O estudo dos efeitos do BSV na micropropagação da cultivar Caipira (grupo AAA) foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical. Utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado com dois tratamentos: plantas sadias com 24 repetições coletadas

luminosa de 22 µE/m2/s.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 74-79, 2006

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SILVEIRA, D. G. et al.

Após o enraizamento in vitro, 47 plantas sadias e 40 plantas infectadas com BSV foram transferidas para copos plásticos de 300 cm3, contendo o Plantmax® e vermiculita (2:1), permanecendo 30 dias sob condições de 85% de umidade relativa do ar e 60% de sombreamento, em casa-de-vegetação. Na fase de estabelecimento e em cada subcultivo foram avaliadas as taxas de multiplicação e a presença dos sintomas do BSV nos explantes provenientes das plantas infectadas. Na fase de aclimatização avaliaram-se a presença de sintomas nas plantas infectadas e as suas respectivas alturas. As medidas foram tomadas do coleto até a extremidade apical da folha mais alta. Os dados referentes ao número de gemas obtidas nos cinco subcultivos foram transformados em raiz quadrada. Foi estabelecida uma regressão linear para cada tratamento em função dos subcultivos. RESULTADOS E DISCUSSÃO A infecção pelo BSV não afetou significativamente o crescimento e a multiplicação das plantas, sendo que o número de gemas cresceu linearmente em função dos subcultivos em ambos os tratamentos. Trabalhando com plantas micropropagadas de bananeira sadias e infectadas com o vírus do topo em leque (Banana bunchy top virus, BBTV), Thomas et al. (1995) observaram que aquela virose também não afetou a capacidade das plantas em crescer e multiplicar. Nas análises de regressão realizadas para os dois tratamentos (plantas sadias e plantas com BSV), o acréscimo no número de gemas em função dos subcultivos pode ser explicado por um modelo de regressão linear (Figura 1). As estimativas da regressão linear para plantas com BSV e plantas sadias foram altamente significativas e os coeficientes de determinação (R2) próximos de 1. Foi observado que as linhas determinadas a partir das equações obtidas são quase superpostas, evidenciando um comportamento semelhante, entre os dois tratamentos, com relação ao número de gemas por subcultivo. Em todas as fases da micropropagação os sintomas do BSV foram visíveis, ocorrendo, nas folhas das plantas infectadas estriados cloróticos com linhas descontínuas e

FIGURA 1 – Curvas de regressão linear obtidas a partir dos dados de gemas em cada subcultivo da cultivar de bananeira Caipira, sadias e infectadas com BSV. Cruz das Almas (BA), Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, 2006. *Dados transformados por x . dispersas (Figura 2). Esses mesmos sintomas foram observados em plantas de bananeira infectadas com BSV mantidas a campo (RAMIREZ & RIVERA, 1994). As contaminações que ocorreram nos materiais in vitro foram também avaliadas. As maiores taxas de contaminação aconteceram na fase de estabelecimento in vitro dos explantes, obtendo-se níveis de 21% e 32% para as plantas sadias e infectadas com BSV, respectivamente (Figura 3). Os elevados índices de perdas nesta etapa foram causados principalmente por contaminação bacteriana. Segundo Oliveira & Silva (1997), as maiores contaminações bacterianas dos explantes de bananeira ocorrem na fase de estabelecimento in vitro do que nos demais subcultivos. Oliveira et al. (2000), trabalhando com plantas livres de vírus, obtiveram taxas de contaminação nesta fase entre 10% e 45%, as quais estão próximas às obtidas neste trabalho. Durante a fase de multiplicação, as perdas por contaminação foram menores, variando de 1,4% a 7,4% para as plantas sadias e de 0% a 12,1% no caso das plantas infectadas com BSV, sendo que a maior parte do material foi contaminada por fungos não-patogênicos. Estes valores foram bem inferiores àqueles obtidos por Oliveira et al. (1999) (13,1%) que utilizaram genótipos diplóides, triplóides e tetraplóides de bananeiras sadias.

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Efeito do vírus das estrias da bananeira...

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FIGURA 2 – Planta de bananeira ‘Caipira’ infectada com BSV na fase de enraizamento in vitro apresentando estriados cloróticos com linhas descontínuas e dispersas nas folhas. Cruz das Almas (BA), Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, 2006.

FIGURA 3 – Taxas por contaminação (%) de explantes da cultivar Caipira na fase de estabelecimento (Est.) e ao longo de cinco subcultivos (Sub.). Cruz das Almas (BA), Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, 2006. Durante o enraizamento in vitro não houve diferença significativa na altura das plantas. Porém, com 30 dias de aclimatização as plantas com BSV apresentaram altura significativamente inferior às plantas sadias (Tabela 1). Soares et al. (2000) cultivaram mudas de bananeira ‘Caipira’ sadias e infectadas com BSV durante 141 dias em casa-devegetação e observaram que a infecção pelo vírus implicou

em significativa redução no crescimento inicial, afetando o porte, o desenvolvimento do sistema radicular e a área fotossintetizante das plantas. Verifica-se assim, que a infecção pelo BSV prejudicou o crescimento inicial das plantas, afetando a altura daquelas infectadas, mesmo em um período relativamente curto, indicando que em períodos mais longos, o prejuízo com relação ao crescimento pode ser ainda maior, aconteceu no estudo desenvolvido por Soares et al. (2000). Os sintomas do BSV permaneceram visíveis em todas as plantas infectadas durante e após a fase de aclimatização. Esse resultado foi diferente ao obtido por Dahal et al. (1999) quando micropropagaram híbridos de Musa, pois os sintomas só foram visíveis em plantas com três meses após o enraizamento. Provavelmente, essa diferença foi devido às condições onde os trabalhos foram conduzidos, casa-de-vegetação e campo, respectivamante, bem como aos genótipos estudados. Observações semelhantes foram também efetuadas por Gauhl & PasbergGauhl (1995) e Ortiz (1996), ao estudarem a incidência de viroses em diferentes genótipos de bananeira.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 74-79, 2006

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SILVEIRA, D. G. et al.

TABELA 1 – Médias das alturas das plantas após o enraizamento in vitro e 30 dias de aclimatização em casade-vegetação. Cruz das Almas (BA), Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, 2006.

Alturas (cm) Plantas de Enraizamento 30 dias de bananeira ‘Caipira’ in vitro aclimatização Sadias 6,37 a* 26,90 a BSV 7,28 a 21,92 b * Médias seguidas pelas mesmas letras, nas colunas, não diferem estatisticamente entre si pelo teste F ao nível de 5 % de significância.

CONCLUSÕES A infecção pelo BSV não influenciou a taxa de multiplicação dos explantes, embora os sintomas do vírus tenham sido visíveis em todas as fases da micropropagação e durante os primeiros 30 dias da aclimatização das plantas infectadas. Todavia, o crescimento das plantas infectadas foi afetado pela presença do vírus. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CORDEIRO, Z. J. M.; KIMATI, H. Doenças da bananeira. In: KIMATI, H. et al. (Ed.). Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. São Paulo: Agronômica Ceres, 1997. v. 2, p. 112-136. DAHAL, G.; GAUHL, F.; PASBERG-GAUHL, C.; HUGHES, J. d’A.; THOTTAPPILLY, G.; LOCKHART, B. E. L. Evalution of micropropagated plantain and banana (Musa spp.) for banana streak badnavirus incidence under field and greenhouse conditions in Nigeria. Annals of Applied Biology, Warwick, v. 134, n. 2, p. 181-191, Apr. 1999. DANIELLS, J.; THOMAS, J. E.; SMITH, M. Seed transmission of banana streak virus confirmed. InfoMusa, Montpellier, v. 4, n. 1, p. 7, 1995. GAUHL, F.; PASBERG-GAUHL, C. Temporal dynamics of banana streak badnavirus (BSV) symptoms in Musa clones in southern Nigeria. Phytomedizin, Hohenheim, v. 25, n. 1, p. 27, 1995. LOCKHART, B. E. L. Banana streak virus (BSV). In: INTERNATIONAL NETWORK FOR THE

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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 74-79, 2006

Efeito do vírus das estrias da bananeira... SOARES, T. M.; MEISSNER FILHO, P. E.; ROCHA, H. S. Efeitos do vírus das estrias da bananeira na cultivar Caipira (AAA). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 16., 2000, Fortaleza. Anais... Fortaleza: Sociedade Brasileira de Fruticultura, 2000. 172 p. 1CD-ROM.

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THOMAS, J. E.; SMITH, M. K.; KESSLING, A. G.; HAMILL, S. D. Incosistent transmission of banana bunchy top virus in micropropagated bananas and its implication for germplasm screening. Australian Journal of Agricultural Research, Collingwood, v. 46, n. 3, p. 663-671, 1995.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 74-79, 2006

CARACTERÍSTICAS 80

MORFOFISIOLÓGICAS DE BROTAÇÕES DE FOGAÇA, L. A. et al. Agapanthus umbellatus var. minor MULTIPLICADAS EM BIORREATOR DE IMERSÃO TEMPORÁRIA1

MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL CHARACTERISTICS Agapanthus umbellatus var. minor OF SHOOTS PROPAGATED IN BIOREACTOR OF TEMPORARY IMMERSION LUCIANA ALVES FOGAÇA2, DENILSON DORTZBACH3, ANTONIO CARLOS ALVES4, ENIO LUIZ PEDROTTI5 1

Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor junto ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos vegetais, CCA/ UFSC – Florianópolis, SC. 2 Engenheira Agrônoma, Mestre em Recursos Genéticos Vegetais – CCA/UFSC – UFSC Trindade – Florianópolis, SC – 88040-900 – [email protected] 3 Empresa Catarinense de Pesquisa Agropecuária – Rodovia Admar Gonzaga, 1340 – Bairro Itacorubi, Florianópolis, SC – [email protected] 4 Engenheiro Agrônomo, Professor, Dr., Departamento Fitotecnia – CCA/UFSC – UFSC – [email protected] 5 Engenheiro Agrônomo, Professor, Dr., Departamento Fitotecnia – CCA/UFSC – UFSC –Rodovia Admar Gonzaga, 1346 – 88 040 900 – Florianópolis- SC – [email protected] RESUMO Com o presente trabalho, objetivou-se estudar alguns aspectos morfológicos e fisiológicos de plântulas de Agapanthus umbellatus L’Hér var. minor multiplicadas em biorreatores de imersão temporária (BIT). Foram testadas quatro concentrações de sacarose no meio de cultura e duas intensidades luminosas, em um total de oito tratamentos, formando um fatorial 2 x 4. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado. Os resultados obtidos indicaram que as condições ambientais, principalmente luz e concentração de sacarose do meio de cultura, influenciaram o desenvolvimento e o crescimento das plântulas quando multiplicadas. Observou-se que a ausência de sacarose, mesmo no nível mais elevado de intensidade luminosa, não estimulou a fotossíntese das plântulas. A combinação de 30 g.L-1 de sacarose e 70 mM.m-2.s-1 de luz proporcionou maior numero de folhas, massa fresca e seca, concentração de clorofila a, b e total, fatores estes que têm grande influência na fase de aclimatização. Termos para indexação: Plantas ornamentais, micropropagação, sacarose, intensidade luminosa. ABSTRACT The objective of the present work was to study morphological and physiological characteristics of Agapanthus umbellatus L’Hér var. minor plantlets propagated in bioreactor of temporary immersion (BIT). Four sucrose concentrations and two light intensities were analyzed, totalizing eight treatments. The experimental design used was a completely randomized with a 2 x 4factorial. The results indicated that the environment conditions, mainly light and sucrose concentrations of the culture medium influenced plantlets development and growth. It was observed that the absence of sucrose, even in the highest level of light intensity, had no stimuli on plantlet photosynthesis. The combination of 30 g L-1 sucrose and 70 mM m-2 s-1 light had promoted higher leaf number, fresh and dry weight, concentration of chlorophyll a, b and total,

parameters that present high influence during the acclimatization’s phase. Index terms: Ornamental plants, micropropagation, sucrose, light intensity.

INTRODUÇÃO Agapanthus umbellatus var. minor também conhecida como Agapantho ou Lírio do Nilo, é uma angiosperma da família Amaryllidaceae, pertencente à ordem Liliales (BOTANY, 2003). é uma espécie ornamental muito utilizada como flor de corte devido à sua durabilidade. No entanto, o maior interesse econômico nesta espécie decorre do seu uso como forração em jardins e praças (LORENZI & SOUZA, 1995). Sua propagação é tradicionalmente efetuada através da divisão de touceiras. No entanto, esta técnica apresenta uma série de desvantagens, visto que a taxa de propagação é baixa, cerca de dez mudas por planta ao ano, além de possibilitar a dispersão de pragas e doenças que poderão ocorrer no viveiro de produção. Sendo assim, a micropropagação pode ser uma ferramenta muito promissora para esta espécie. O processo de micropropagação induz a um grande número de mudanças anatômicas, morfológicas e fisiológicas que muitas vezes tem limitado o cultivo in vitro de algumas espécies (DESJARDINS, 1993). A

(Recebido em 18 de julho de 2005 e aprovado em 25 de agosto de 2006)

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 80-87, 2006

Características morfofisiológicas de brotações... heterogeneidade de respostas às plântulas que ocorrem na cultura de tecidos é promovida não só por fatores inerentes ao tecido vegetal (genéticos e fisiológicos), mas também por modificações do ambiente in vitro. As modificações do ambiente in vitro envolvem a qualidade e intensidade de luz, fotoperíodo, temperatura, umidade, reguladores de crescimento exógenos, fonte de carbono e estresse mecânico. Estes são determinantes na morfogênese, no crescimento e no desenvolvimento de plântulas in vitro (GEORGE, 1996; KOZAI et al., 1990; SALISBURY, 1981). Além disso, interferem no número de folhas, teor de clorofila, densidade estomática (LIAN et al., 2002; PREECE & SUTTER, 1991), na fotossíntese e na fase de aclimatização (DESJARDINS et al., 1995). Um dos principais fatores que causam grande influência na fotossíntese de plântulas cultivadas in vitro é a intensidade luminosa (GALZY & COMPAN, 1992). A quantidade e a qualidade da luz, bem como o fotoperíodo, podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de plântulas in vivo (SMITH, 1982) e plântulas in vitro (ECONOMOU & READ, 1987; VLAHOS et al., 1992). Esta influência se deve ao grande impacto sobre o acúmulo de pigmentos, biossíntese de clorofila, diferenciação de cloroplastos e anatomia da folha (DESJARDINS et al., 1995). Outro fator que vem sendo estudado e que pode determinar um papel importante no controle da atividade fotossintética de plântulas in vitro é a utilização de carboidratos exógenos, pois o crescimento da maioria das culturas in vitro é sustentado pela sacarose ou outros açúcares adicionados ao meio de cultura (PREECE & SUTTER, 1991). Estes podem ser utilizados pelas plântulas quando a taxa de fotossíntese não permite assegurar um balanço positivo em carbono, definindo assim uma nutrição mixotrófica ou heterotrófica (GALZY & COMPAN, 1992). Baseado na hipótese de que a composição do meio de cultura e a intensidade luminosa influenciam a morfologia e a fisiologia de plântulas micropropagadas, o presente trabalho teve como objetivo estudar aspectos morfológicos e fisiológicos de plântulas de Agapanthus

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umbellatus L’Hér var. minor multiplicadas em biorreator de imersão temporária (BIT). Para tanto, foi avaliado o desenvolvimento e o crescimento desta espécie durante a fase de multiplicação, em função da variação de níveis de sacarose e intensidade luminosa. MATERIAIS E MÉTODOS Este trabalho foi realizado no Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal, localizado no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina, em Florianópolis - SC. O trabalho consistiu de um ensaio, onde foram utilizadas brotações de Agapanthus umbellatus var. minor. obtidas da terceira repicagem, mantidas em meio geleificado MS + 17,8 mM de BAP. Após serem individualizadas e padronizadas, tendo o seu tamanho variando entre 2,5 e 3,0 cm de comprimento, as brotações foram transferidas para o BIT (ETIENNE & BERTHOULY, 2002) contendo 500 mL de meio líquido e sais de MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) em condições assépticas, suplementado com concentração de 8,9 mM de BAP. O pH foi ajustado com NAOH (1N) em 5,9 antes da autoclavagem (durante 15 minutos sob 121ºC e 1,5 atm de pressão). O delineamento experimental utilizado no ensaio foi o inteiramente casualizado. Foram testados quatro concentrações de sacarose no meio de cultura (0, 1,5; 3,0 e 4,5%) e duas intensidades luminosas (70 e 140 mmol.m-2.s-1), providas por lâmpadas brancas fluorescentes (PHILIPS – TLT 40W), em um total de oito tratamentos, formando um fatorial 2 x 4. Cada tratamento foi composto por três frascos (repetição) contendo 50 plantas cada um. Os frascos foram mantidos em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas e temperatura média de 22ºC com variação de ± 2ºC, por um período de 60 dias. Após 60 dias de cultivo, foram avaliadas as seguintes características dos explantes: número e tamanho das brotações (cm), número de folhas/brotação, massa fresca e seca (g) da parte aérea e raiz, utilizando-se amostras de 25 plântulas por repetição escolhidas ao acaso.

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FOGAÇA, L. A. et al.

A determinação do conteúdo de clorofila “a, b e total” consistiu na coleta de amostras de 100 mg de massa fresca. As amostras foram incubadas com 7,0 mL de DMSO (dimetilsulfóxido) sem maceração, por 30 minutos a 65°C. Após filtragem, seu volume foi completado para 10 mL com DMSO. Desses extratos, 2 mL foram analisados em espectrofotômetro (UV - visível, SHIMADZU), para os valores de absorbância entre 645 e 663 nm. Os valores obtidos foram submetidos à fórmula de Arnon (1949), conforme descrito por Hiscox & Israelstam (1979): Chl a = (0,0127 X D663) – (0,00269 X D645) e Chl b = (0,0229 X D645) – (0,00468 X D663). A clorofila total foi a soma da “Chl a e Chl b” de cada tratamento, foram utilizadas 25 amostras. A determinação da densidade estomática (número de estômatos por mm2 de superfície foliar) foi realizada nas amostras das quais extraiu-se a clorofila. Após a extração da clorofila, as folhas foram cortadas e somente o terço médio das folhas foi usado para análise. Em seguida foram fixadas sobre lâminas histológicas com a ajuda de uma lamínula e de algumas gotas de água esterilizada. A observação foi realizada na epiderme das faces adaxial e abaxial da folha, com o auxílio de um microscópio ótico (OLYMPUS CH30, ocular WH10 X 22), com um aumento de 400 vezes e com um campo conhecido de 0,24 mm2. Para cada lâmina foram feitas leituras em cinco campos. Os dados obtidos foram avaliados por meio da análise de variância (ANOVA) seguindo o modelo para experimento bifatorial inteiramente casualizado. O número de brotações, o número de folhas e a densidade estomática foram transformados em Öx+1 para a análise. As médias dos tratamentos foram separadas pelo teste de comparação de médias de Duncan a 5% de probabilidade, conforme recomendações de Stell & Torrie (1980). RESULTADOS E DISCUSSÃO A concentração de sacarose no meio de cultura apresentou uma ação positiva e interativa com a intensidade luminosa na proliferação de brotações (Tabela 1), visto que, a ausência de sacarose no meio de cultura resultou em insucesso no crescimento das plântulas de Agapantho,

principalmente nos primeiros dias. Após o desenvolvimento inicial (aproximadamente 10 dias) foi constatada estagnação no crescimento das plântulas, seguido de atrofia e necrose das brotações. Após 20 dias de cultivo ocorreu a morte das brotações. Isso mostrou que folhas de plântulas de Agapantho não fixaram carbono suficiente para sustentar seu crescimento na ausência de sacarose. Portanto, para a espécie em estudo foi necessária a adição de uma fonte de carbono no meio de cultura para o seu desenvolvimento in vitro. Segundo Capellades et al. (1991) e Desjardins et al. (1995), a total remoção de carboidratos no meio de cultura para algumas espécies, freqüentemente, torna-se prejudicial para o crescimento das plântulas, o que pode prejudicar o processo de micropropagação e aclimatização, pois, durante o cultivo in vitro, as plântulas perdem parcialmente o autotrofismo e, conseqüentemente, necessitam de uma fonte de carbono. O maior número de brotações foi obtido com a intensidade luminosa de 70 mmol.m-2.s-1 e a concentração de 45 g.L-1 de sacarose (Tabela 1). Enquanto que com a intensidade luminosa de 140 mmol.m-2.s-1 o maior número de brotações foi obtido com a concentração de 30 g.L-1 de TABELA 1 – Número de brotações/explante de plântulas de Agapanthus umbellatus var. minor multiplicadas biorreator de imersão temporária suplementado com diferentes concentrações de sacarose e intensidades luminosas no período de 60 dias. Intensidade Luminosa ( mol.m-2.s-1) Concentração 70 1 140 1 Sacarose (g.L-1) 0 0,00 dA 0,0 dA 15 3,70 cB 5,44 cA 30 5,53 bB 6,51 aA 45 7,45 aA 5,85 bB CV % 6,7 Médias seguidas pela mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem significativamente pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. 1/ Observações transformadas segundo ( x+1).

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 80-87, 2006

Características morfofisiológicas de brotações... sacarose. Isso demonstrou um alto grau de mixotrofia dessa espécie. O tamanho das brotações e o número de folhas (Tabela 2) foram afetados apenas pelo efeito simples dos fatores, não havendo interação entre sacarose e luz. O maior tamanho das brotações foi alcançada quando os explantes foram submetidos a 15 g.L-1 de sacarose e 140 mmol.m-2.s-1 de intensidade luminosa (Tabela 2). Verificouse também que o aumento da concentração desse carboidrato no meio de cultura não favoreceu o alongamento das brotações. Provavelmente, o aumento da intensidade luminosa favoreceu a taxa de fotossíntese das plântulas, permitindo um balanço positivo de carbono, afetando o crescimento e o desenvolvimento de plântulas in vitro (LEE et al., 1995). Por outro lado, o maior número de folhas de Agapantho foi obtido na concentração de 30 g.L-1 de sacarose (Tabela 2). A intensidade luminosa não teve influência sobre essa variável. Contrastando com os dados obtidos no presente trabalho, Konow & Wang (2001) determinaram que a intensidade luminosa de 40 mmol.m2 -1 .s promoveu um aumento no número de folhas de Phalaenopsis, enquanto plântulas que se desenvolveram em ambiente com intensidade de 10 e 80 mol.m-2.s-1 apresentaram um menor número de folhas. Segundo os autores, o aumento no número de folhas pode indicar que

83

houve estímulo da fotossíntese in vitro. Outro efeito observado em plântulas de Agapantho neste trabalho foi a presença de folhas mais claras e vitrificadas (folhas com aspecto vítreo, pouco desenvolvidas, aparência suculenta e translucente), na grande maioria das plântulas multiplicadas em meio suplementado com 15 g.L-1 de sacarose e intensidade luminosa de 70 mmol.m-2.s-1. Estes resultados podem indicar que o aparato fotossintético não tenha se desenvolvido adequadamente (CAPPELADES et al., 1991; DESJARDINS et al., 1995), afetando a acumulação de massa fresca. Possivelmente, a presença de folhas vitrificadas foi influenciada pelo uso de meio líquido, pois de acordo com George (1996) e Etienne & Berthouly (2002), o meio líquido favorece a produção de folhas vitrificadas quando comparado com meio geleificado. No entanto, observou-se que para os demais tratamentos em concentrações maiores de sacarose (30 e 45 g.L-1) a presença de brotações vitrificadas foi rara ou nenhuma. Neste sentido, o desenvolvimento de brotações com esta característica pode estar relacionado à concentração de sacarose no meio, e à diferença osmótica entre as brotações e o meio de cultura (DEBERGH et al., 1981). Este resultado também foi obtido na multiplicação de rosas, na qual onde a redução na concentração de sacarose para 10 g.L-1, na fase de multiplicação, promoveu um aumento significativo na presença de plantas vitrificadas, e quando submetidas

TABELA 2 – Tamanho de brotações e número de folhas/brotação de plântulas de Agapanthus umbellatus var. minor multiplicadas em biorreator de imersão temporária suplementado com diferentes concentrações de sacarose e intensidades luminosas no período de 60 dias. Tamanho de brotações (cm) Número de folhas/brotação Intensidade Luminosa ( mol.m-2.s-1) 70 140 Média 70 140 Média 0 0,00 0,00 0,00 d 0,00 0,00 0,00 d 15 2,75 3,96 3,35 a 4,07 4,08 4,08 b 30 2,95 2,95 2,95 b 4,14 4,04 4,09 a 45 2,45 2,20 2,33 c 4,00 4,08 4,04 c Média 2,04 b 2,28 a 2,76 a 2,75 a CV % 25,95 4,67 Médias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas, não diferem significativamente pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. Concentração Sacarose (g.L-1)

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 80-87, 2006

84

FOGAÇA, L. A. et al.

a concentrações de 30 e 40 g.L-1 a presença de plântulas

Tais resultados corroboram as afirmações feitas referentes

vitrificadas foi rara (LANGFORD & WAINWRIGHT, 1987).

à variável número de brotações, em que demonstrou-se

Outro fator que possivelmente pode ter

que foi possível reduzir a concentração de sacarose em

influenciado a presença de plântulas vitrificadas in vitro

maiores intensidade luminosas, confirmando o grau de

foi a baixa intensidade luminosa (GEORGE, 1996), pois

mixotrofia.

plântulas de Agapantho multiplicadas sob intensidade de -2. -1

-1

Ao analisar a concentração de clorofila em

140 mmol.m s e 15 g.L de sacarose não apresentaram

folhas de Agapantho, verificou-se que não houve

característica de vitrificação. Estes dados indicaram que o

interação significativa entre as concentrações de

aumento da intensidade luminosa evitou a presença de

sacarose e intensidade luminosa. Os teores de clorofila

plantas vitrificadas, além de proporcionar um incremento e

a, b e total (Tabela 4) foram maiores nas concentrações

estímulo na atividade fotossintética (GEORGE, 1996).

de 30 g.L-1 sacarose. Serret et al. (1995) mostraram que

A produção de massa fresca e seca das brotações

o aumento da concentração de açúcares (30 g.L-1) no

foram influenciadas pela interação entre a concentração

meio de cultura promoveu maior produção de clorofila,

de sacarose e a intensidade luminosa (Tabela 3). Plântulas

impedindo a fotoinibição, realização de fotossíntese e

de Agapantho multiplicadas sob intensidade de 70

aumento do ganho de massa em plantas de Gardênia

-2. -1

mmol.m s apresentaram a maior produção de massa -1

fresca e seca dentro das concentrações de 30 g.L . Nas -1

cultivadas in vitro. Em relação ao efeito da intensidade luminosa, não

concentrações de 15 e 45 g.L os resultados obtidos

houve efeito deste fator sobre essas variáveis, ainda que,

foram inferiores (Tabela 3). Por outro lado, quando se

Economou & Read (1987); Galzy & Compan (1992); Vlahos

-2. -1

aumentou a intensidade para 140 mmol.m s , a melhor

et al. (1992); George (1996) tenham observado que a

produção de massa fresca e seca ocorreu dentro da

intensidade luminosa é um fator que está estreitamente

-1

concentração de 15 g.L de sacarose (Tabela 3). Verificou-

relacionado à síntese de clorofila. No entanto, no presente

se assim que, o aumento da concentração de sacarose no

trabalho sugere-se a menor intensidade 70 mmol.m-2.s-1 com

meio de cultura proporcionou efeitos negativos na

o objetivo de que não ocorra um aumento na velocidade

produção de massa fresca e seca, quando as plântulas

de decomposição da clorofila com intensidade mais

foram submetidas à intensidade luminosa mais elevada.

elevada.

TABELA 3 – Massa fresca e seca de brotações de Agapanthus umbellatus var. minor multiplicadas em biorreator de imersão temporária suplementado com diferentes concentrações de sacarose e intensidades luminosas no período de 60 dias. Massa fresca (g) Massa seca (g) Intensidade Luminosa ( mol.m-2.s-1) Concentração 70 140 70 140 Sacarose (g.L-1) 0 0,00 dA 0,0 dA 0,00 dA 0,00 dA 15 0,67 cB 1,06 aA 0,069 cB 0,109 aA 30 0,82 aA 0,76 bB 0,085 aA 0,081 bB 45 0,75 bA 0,49 cB 0,078 bA 0,051 cB CV % 28,73 26,55 Médias seguidas pela mesma letra, minúscula nas colunas e maiúscula nas linhas, não diferem significativamente pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 80-87, 2006

Características morfofisiológicas de brotações...

85

TABELA 4 – Concentrações de clorofila a, b e total (mg/g massa fresca) em folhas de Agapanthus umbellatus var. minor multiplicadas em biorreator de imersão temporária por um período de 60 dias, submetidas a 4 concentrações de sacarose e dois níveis de intensidade luminosa. Clrofila a (mg/g massa fresca) Concentração Sacarose (g.L-1) 0 15 30 45 Média CV %

Clrofila b (mg/g massa fresca) Intensidade Luminosa ( mol.m-2.s-1)

70

140

Média

0,00 2,11 5,02 4,86 2,99 a

0,00 2,48 5,09 4,20 2,94 a 7,40

0,00 d 2,95 c 5,05 a 4,53 b

70 0,00 0,89 2,00 1,95 1,21 a

140

Média

0,00 0,76 2,11 1,79 1,16 a 8,20

0,00 d 0,83 c 2,05 a 1,87 b

Clrofila total (mg/g massa fresca) 70 0,00 3,01 7,03 6,82 4,21 a

140

Média

0,00 3,25 7,21 6,33 4,20 a 8,50

0,00 d 3,13 c 7,10 a 6,58 b

Médias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas, não diferem significativamente pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade.

Em relação aos estômatos, através de observação microscópica foi possível verificar que o Agapantho possui folhas com característica anfiestomática, caracterizada pela presença de estômatos em ambas as faces (face abaxial e adaxial). Esta característica tem sido considerada como um mecanismo adaptativo para maximizar a condutância de CO 2 , quando luz e água são fatores limitantes (KRAMER, 1969). Através da análise estatística para densidade estomática da face adaxial, verificou-se que não houve interação entre os fatores sacarose e intensidade luminosa, havendo portanto efeito isolado dos fatores. A maior densidade estomática da face abaxial foi obtida na concentração de 45 g.L-1 (Tabela 5). Não houve efeito da intensidade luminosa para essa variável. Por outro lado, a maior densidade estomática na face adaxial foi obtida na concentração de 45 g.L-1 de sacarose e 140 mmol.m-2.s-1 de intensidade luminosa (Tabela 5), verificando a influência positiva da intensidade luminosa para essa variável. As folhas de plântulas multiplicadas na concentração de 15 g.L-1 de sacarose apresentaram menor densidade estomática em ambas as faces (Tabela 5), com

formato anormal, largos e salientes, características estas não desejáveis, pois segundo Preece & Sutter (1991), uma alteração a nível estrutural e/ou morfológico podem impedir o funcionamento do aparelho estomático e grande parte dos estômatos assim formados são incapazes de se fechar. Possivelmente, este resultado se deve às características de vitrificação que as folhas do tratamento 15 g.L-1 de sacarose e 70 mmol. m-2.s-1 de intensidade luminosa apresentaram (BLANKE & BELCHERL, 1989) e a falta de energia armazenada no explante com a falta de carbono, que é proveniente da sacarose adicionada ao meio de cultura (DESJARDINS et al., 1995). Estes resultados corroboram os obtidos por Viña et al. (2001) que demonstraram que folhas vitrificadas de abacateiro apresentaram estômatos grandes, com saliência, células subsidiárias assimétricas e deformadas e seu ostíolo completamente aberto. Tal anomalia pode ser atribuída à perda da elasticidade das paredes das células-guarda, o que impediria o seu movimento de abertura e fechamento, que conseqüentemente afeta o desenvolvimento das plântulas ao serem transferidas para condições ex vitro, através da excessiva perda de água.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 80-87, 2006

86

FOGAÇA, L. A. et al.

TABELA 5 – Densidade estômatica (estômatos/mm2) da face adaxial e abaxial de folhas de Agapanthus umbellatus var. minor multiplicadas em biorreator de imersão temporária suplementado com diferentes concentrações de sacarose e intensidade luminosa por um período de 60 dias. Densidade estomática (estômatos/mm2) Epiderme da face Adaxial Epiderme da face Abaxial Intensidade Luminosa ( mol.m-2.s-1) Concentração 70 140 Média 70 140 Média Sacarose(g.L1) 0 0,00 0,00 0,00 d 0,00 0,00 0,00 d 15 25,87 30,26 28,02 c 34,08 47,52 40,53 c 30 65,24 56,28 60,64 b 99,77 85,84 92,68 b 45 54,12 70,16 61,88 a 88,09 108,07 97,83 a Média 28,56 b 30,89 a 42,56 a 47,05 a CV % 14,74 12,06 Médias seguidas pela mesma letra nas linhas e colunas, não diferem significativamente pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. CONCLUSÃO Condições ambientais, tais como intensidade luminosa e concentração de sacarose adicionada ao meio de cultura influenciaram no desenvolvimento e crescimento das plântulas de Agapanthus umbellatus var. minor quando multiplicadas em meio líquido no BIT. Plântulas de Agapantho foram incapazes de se desenvolver em meio sem sacarose, sendo portanto necessária a adição de uma fonte de carbono, visto que a espécie em estudo apresentou uma taxa de fotossíntese incapaz de assegurar um balanço positivo em carbono. Houve uma grande variação nas respostas obtidas, no entanto, fazendo uma avaliação em conjunto das variáveis recomenda-se 30 g.L-1 de sacarose e intensidade luminosa de 70 mmol.m-2.s-1. No entanto, deve-se ressaltar que estudos mais aprofundados devem ser conduzidos, para verificar o efeito destas combinações sobre o desempenho de plântulas durante a fase de aclimatização. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BLANKE, M. M.; BELCHER, A. R. Stomata of apple leaves cultured in vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 19, n. 1, p. 85-89, 1989. BOTANY. Disponível em: Acesso em: 20 nov. 2003.

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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 80-87, 2006

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CAPACIDADE DE REGENERAÇÃO VITRO DE TOMATEIRO SOUZA, G. de F. M. V.IN e et al. CULTIVAR SANTA CLARA IN VITRO REGENERATION CAPACITY OF TOMATO PLANT CULTIVAR SANTA CLARA

GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA1, JOSÉ MAGNO QUEIROZ LUZ2, ALCIONE SILVA ARRUDA3, DENISE GARCIA SANTANA2, MARIANA DE SOUZA E SILVA DA COSTA TEIXEIRA4, LUCIANA LONDE5, ADELAIDE SIQUEIRA SILVA6, ELISÂNGELA RODRIGUES FIGUEIRA7 1

Mestranda em Fitotecnia – UFU – Caixa Postal 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected] Professor, Dr. Instituto de Ciências Agrárias – UFU/ICIAG – Caixa Postal 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected] 3 Dra em Genética e Bioquímica, Professora contratada da UEG – Unidade Universitária de Ipameri – Rodovia GO 330 Km 24 – Anel Viário S/N – 75780-000 – Ipameri, GO – [email protected] 4 Engenheira Agrônoma – UFU – Conab Sede - SGAS 901 Bloco “A” Lote 69 - Asa Sul – 70.390-010 – Brasília, DF – [email protected] 5 Dra em Genética e Bioquímica – IGB/UFU – Av. Pará, 1720 – Campus Umuarama – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected] 6 Mestranda em Agronomia/Fitotecnia – UFU/ICIAG – Bolsista FAPEMIG – Caixa Postal 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected] 7 Mestre em Agronomia/Fitotecnia – UFU/ICIAG – Caixa Postal 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected] 2

RESUMO A cultivar de tomateiro Santa Clara (Lycopersicon esculentum Mill.) foi avaliada quanto ao seu potencial de regeneração in vitro, a partir de três tipos de explantes e três meios de cultura seguidos de três repicagens. Os explantes foram: cotilédone decapitado, cotilédone fendido e cotilédone aparado nas extremidades. Os meios de cultura foram: MI: macro e micronutrientes do MS, vitaminas B5 de Gamborg et al. (1968), suplementado com 30 g/L de sacarose e de 8 g/L de ágar, pH 5,8; MII: meio MI suplementado com 1 mg/L de BAP, e 30 g/L de glicose; MIII: meio MI suplementado com 2,5 mg/L de BAP e 0,2 mg/L de AIA. Para as repicagens foi utilizado o meio MI suplementado com 0,5 mg/L, 0,8 mg/L e 1,0 mg/L de BAP para a primeira, segunda e terceira repicagens, respectivamente. No enraizamento foi usado o meio MI suplementado com 0,5 mg/ L de AIA e as plântulas enraizadas foram transferidas para substrato comercial Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratório. A maior indução de regeneração tanto de calos quanto de brotos foi observada nos métodos cotilédone fendido e cotilédone aparado quando colocados no meio MIII, no entanto, a indução de regeneração foi mais rápida quando usado cotilédone decapitado indicando um alto potencial de organogênese espontânea, sendo que o meio MI foi o melhor. Os resultados obtidos com as diferentes concentrações de BAP nos três ciclos de repicagem não diferiram entre si e 82% das plantas enraizadas aclimataram-se com sucesso.

following three pricking-outs. The explants were as follows: decapitated cotyledon, split cotyledon and rim-trimmed cotyledon. The culture media were: MI: MS macro and micronutrients, vitamins B5 of Gamborg et al. (1968), supplemented with 30g/L sucrose and 8g/L agar, pH 5.8; MII: medium MI supplemented with 1 mg/L BAP and 30 g/L glucose; MIII: medium MI supplemented with 2.5 mg/L BAP and 0.2 mg/L IAA. For the pricking-outs, the media MI was supplemented with 0.5 mg/L, 0.8 mg/L and 1.0 mg/L BAP for the first, second and third pricking out, respectively. As for rooting, the MI medium was supplemented with 0.5 mg/L IAA, and the rooted seedlings were transplanted to the sterilized commercial substrate Plantimax, and then acclimatized in laboratory. Higher callus induction and sprout regeneration was observed for the methods of split and rim-trimmed cotyledon placed into medium MIII. Nevertheless, the induction for regeneration was much faster when the decapitated cotyledon method was used, indicating a high potential of spontaneous organogenesis, in which the media MI was the best. The results obtained with the different concentrations of BAP in the three cycles of pricking-out did not differ among themselves and 82% of the rooted plants were acclimatized successfully.

Termos para indexação: Lycopersicon esculentum, melhoramento do tomateiro, cultura de tecidos.

INTRODUÇÃO

ABSTRACT The tomato plant cultivar ‘Santa Clara’ (Lycopersicon esculentum Mill.) was evaluated as for its in vitro potential of regeneration, using three types of explants and three culture media,

Index terms: Lycopersicon esculentum, tomato breeding, tissue culture.

O tomate pertence ao gênero Lycopersicon e a espécie cultivada, cosmopolita, é botanicamente denominada de Lycopersicon esculentum (FILGUEIRA, 2000). As cultivares atualmente plantadas podem ser

(Recebido em 03 de outubro de 2003 e aprovado em 04 de setembro de 2006)

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 88-93, 2006

Capacidade de regeneração in vitro de tomateiro...

89

reunidas em cinco grupos: Santa Cruz, Salada, Cereja,

Clara, do grupo Santa Cruz, a partir de diferentes tipos de

Italiano, Agroindustrial. No presente trabalho foi utilizada

explantes e meios de cultura, criando e otimizando

a cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz, pois ela continua

protocolos para sua regeneração in vitro.

sendo a cultivar mais plantada no Brasil.

MATERIAL E MÉTODOS

A tomaticultura está associada a sérios problemas fitossanitários, sobretudo viroses, além do ataque de

No Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do

fungos, bactérias e insetos praga. Cria-se, com isto, a

Instituto de Genética e Bioquímica da Universidade Federal

necessidade de se pesquisar novas alternativas ou

de Uberlândia, foi avaliada a capacidade de regeneração

obtenção de novos genótipos com resistência múltipla a

in vitro do tomateiro, cultivar Santa Clara, usando três

doenças e pragas; entre essas, os estudos sobre

tipos de explantes e três meios de cultura, seguido de três

regeneração e transformação genética (FÁRI et al., 2000).

repicagens. O experimento foi realizado em delineamento

A engenharia genética abriu uma nova perspectiva

em blocos casualizados em esquema fatorial (3x3) com três

para o melhoramento genético do tomateiro a partir do

repetições. As plantas regeneradas foram enraizadas e

final da década de 80 (WIJBRANDI & BOTH, 1993),

aclimatadas em laboratório.

visando aumentar a produtividade e melhorar a qualidade

Sementes comerciais da cultivar Santa Clara, após

por meio da obtenção de resistência a estresses bióticos e

serem desinfestadas por um minuto em álcool etílico a 96%

abióticos. A cultura de tecidos destaca-se durante o

e em hipoclorito de sódio comercial a 20% (v/v) com duas

processo de realização das técnicas de transformação

gotas de detergente comercial, durante 25 minutos, foram

genética, pois é necessário induzir gemas vegetativas e,

enxagüadas 5 vezes em água bidestilada esterilizada e

em seguida, regenerar brotos alongados e plantas

inoculadas em meio MS 100% (MURASHIGE & SKOOG,

completas a partir de células ou tecidos geneticamente

1962), solidificado com 7 g L-1 de ágar–ágar por, sem

modificados.

reguladores de crescimento. O meio foi distribuído em

Para a otimização de protocolos para o tomateiro,

frascos de vidro estéreis utilizados para cultura de tecidos

alguns fatores que afetam a eficiência de transformação

com 30 mL de meio MS. As culturas foram mantidas em

têm sido examinados, dentre eles, o tamanho do explante e

sala de crescimento, com temperatura de 25+2 ºC,

o tipo de explante, hipocótilo ou cotilédone (FRARY &

fotoperíodo de 16 horas e luminosidade de 50 mmol m-2.s-

EARLE, 1996).

1

. As plântulas obtidas aos 14, 15 e 20 dias após a semeadura,

No Brasil, há poucos trabalhos na área de

foram usadas como fonte de explantes para os blocos 1, 2

regeneração in vitro e de transformação genética de

e 3, respectivamente. Os explantes foram inoculados, de

cultivares de tomateiro e pouco se conhece sobre a

acordo com os métodos descritos a seguir, em placas de

capacidade de regeneração das principais cultivares

Petri devidamente esterilizadas e autoclavadas, contendo

brasileiras (FÁRI et al., 2000). Alguns pesquisadores, como

30 mL de meio de cultura, com 16 unidades por tipo de

Faria & Illg (1993), analisaram a regeneração in vitro de

explante por meio de cultura utilizado. Cada 16 explantes

algumas espécies e cultivares de tomateiro, observando

constituiu uma parcela do experimento, sendo composta

uma baixa capacidade morfogênica das cultivares se

por duas placas de Petri, cada uma com 8 explantes.

comparadas com a espécie selvagem Lycopersicon

Os tipos de explantes foram os seguintes:

pimpinellifolium (L.) P. Miller.

A - que consistiu na decapitação de plântulas, onde

Com este trabalho, objetivou-se teve como objetivo avaliar o potencial de regeneração in vitro da cultivar Santa

essa decapitação ocorreu diretamente abaixo do nó do cotilédone, ficando o hipocótilo com as radículas.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 88-93, 2006

90

SOUZA, G. de F. M. V. e et al. B - método de cotilédones fendidos, os cotilédones

Avaliou-se

a

indução de

regeneração,

o

foram fendidos ao longo da nervura central, da extremidade

alongamento de brotos e o enraizamento e aclimatação

até sua metade, de acordo com o protocolo de Fári et al.

das plantas regeneradas.

(2000).

Os dados de contagem foram transformados para C - cotilédones foram aparados e seguiu-se o

x 0,5 . As análises de normalidade e homogeneidade

protocolo descrito por Redenbaugh et al. (1992). Os

foram realizadas pelo software Prophet. Os dados obtidos

cotilédones aparados nas extremidades distal e proximal

foram submetidos à análise de variância e as médias

(ápice e pecíolo), foram inoculados com a face abaxial em

comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de

contato com o meio.

probabilidade, pelo software SANEST (ZONTA &

Foram realizadas três repicagens para alongar os brotos. Cerca de 30 dias após a inoculação dos explantes foi realizada a primeira repicagem. Os intervalos entre as repicagens foram em torno de 5 semanas.

MACHADO, 1989). RESULTADOS E DISCUSSÃO Para cotilédone decapitado ocorreu um início de

Os tratamentos consistiram na inoculação dos três

formação de calosidade por volta de 10 dias após inoculação

tipos de explantes descritos nos três meios de cultura

e o surgimento de brotos ocorreu cerca de 12 dias depois da

abaixo, com três repetições por tratamento.

inoculação, sem a formação de calos propriamente ditos. A

Meio MI: macro e micronutrientes de Murashige &

indução de regeneração foi mais rápida quando usado esse

Skoog (1962) e vitaminas B5 de Gamborg et al. (1968),

tipo de explante, indicando um alto potencial de

suplementado com 30 g/L de sacarose e de 8 g/L de ágar-

organogênese espontânea, sendo que o meio MI foi o melhor

ágar, pH 5,8; meio MII: meio de cultura MI, suplementado

para a indução e número total de brotos (Tabela 1).

com 1 mg/L de zeatina, e 30 g/L de glicose, conforme

No cotilédone fendido, o início de formação de

McCormick (1991); meio MIII: meio de cultura MI

calosidade aconteceu com aproximadamente 10 dias após

suplementado com 2,5 mg/L de BAP e 0,2 mg/L de AIA,

inoculação. Por volta de 18 dias depois da inoculação

segundo Rhim et al. (1995).

iniciou-se o surgimento de brotos e já existiam calos

Para as repicagens foi utilizado o meio MI

formados. Para esse tipo de explante nos meios MI e MII

suplementado com 0,5 mg/L, 0,8 mg/L e 1,0 mg/L de BAP

ocorreu apenas a formação de calos, enquanto no meio

para a primeira, segunda e terceira repicagens,

MIII ocorreu a formação de calos e calos com brotos, sendo

respectivamente.

alto o número total de brotos (Tabela 1). Supõe-se que a

Para enraizamento foi usado o meio MI

maior superfície de corte tenha influência significativa

suplementado com 0,5 mg/L de AIA. As plântulas

sobre esse fenômeno, onde, a maior superfície de corte do

enraizadas foram transferidas para substrato comercial

cotilédone resulta em maior capacidade de regeneração

Plantimax esterilizado e aclimatadas em laboratório.

(FÁRI et al., 1995b).

Os brotos com 2 cm de comprimento foram

No cotilédone aparado com cerca de 10 dias após

transferidos para o meio de enraizamento citado e

inoculação ocorreu o início de formação de calos e 20 dias

permaneciam nesse meio durante 15 dias. Após esse período

depois da inoculação ocorreu o surgimento de brotos e já

os brotos eram transplantados para substrato comercial

existiam calos formados. Para esse tipo de explante nos

Plantimax autoclavado, irrigados com água uma a duas

meios MI, MII e MIII ocorreu a formação de calos, no

vezes por dia até a aclimatação. A aclimatação ocorreu em

entanto, apenas no meio MIII ocorreu a formação de calos

torno de 20 dias, em condições de laboratório.

com brotos (Tabela 1).

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 88-93, 2006

Capacidade de regeneração in vitro de tomateiro...

91

TABELA 1 – Freqüência de indução de regeneração in vitro da cultivar Santa Clara do grupo Santa Cruz. Uberlândia, UFU, 2001.

Variáveis Nº de explantes com calos Nº de explantes com brotos Nº total de calos Nº total de brotos

Meios I II III I II III I II III I II III I II III

Cotilédone decapitado 3,96 aA 0,00 bB 0,00 bB 10,95 aA 0,50 bA 1,30 bB 3,96 aA 0,00 bB 0,00 bB 18,50 aA 0,50 bA 1,30 bB 48 32 24

Tipos de Explantes Cotilédone fendido 0,50 cB 6,32 bA 15,99 aA 0,00 bB 0,00 bA 12,17 aA 0,50 cB 6,32 bA 36,30 aA 0,00 bB 0,00 bA 27,60 aA 32 40 40

Cotilédone aparado 1,42 bB 6,72 aA 5,97 bB 0,00bB 0,00 bA 8,50 aA 1,69 cB 6,45 bA 26,55 aA 0,00 bB 0,00 bA 29,34 aA 40 32 48

Nº de explantes* Total de 104 112 120 explantes Dados seguidos de mesma letra nas colunas (a,b,c) e nas linhas (A,B) não diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. *A diferença entre o nº de explantes de um método para outro é devida a parcelas (ou parte delas) perdidas. Nos três ciclos de repicagens a capacidade de alongamento dos brotos foi igual, indicando que as concentrações de BAP não diferiram estatisticamente entre si, dentro de cada tipo de explante. Em relação ao número de brotos alongados, na primeira e terceira repicagens o cotilédone decapitado apresentou maior número, já na segunda repicagem não houve diferença entre os tipos de explantes (Tabela 2). As plantas, após serem enraizadas, foram transferidas para aclimatação, obtendo-se 82% de plantas aclimatadas. Cerca de 20 dias após transplantio para o substrato as plantas já estavam aclimatadas. Após a terceira repicagem ainda existiam cerca de 334 brotos para serem novamente repicados e 51 brotos prontos para serem enraizados, perfazendo um total geral de 549 brotos obtidos até a fase estudada. Para o tipo de explante cotilédone decapitado, foram obtidos 181 brotos, equivalentes a 1,74 brotos por explante. Para o explante cotilédone fendido o número de brotos por

explante foi igual a 1,45 e para o cotilédone aparado, foram obtidos 1,70 brotos por explante. Esses resultados foram semelhantes aos obtidos por Fári et al. (2000), para as cultivares IPA-5 e IPA-6, os quais concluíram que a utilização de cotilédones fendidos e cotilédones aparados produziram uma regeneração alta e onde a maior indução foi conseguida utilizando-se um meio igual ao MIII utilizado nesse experimento. A indução de regeneração também foi mais rápida quando usado cotilédone decapitado indicando um alto potencial de organogênese espontânea. A cultivar Santa Clara mostrou-se mais eficiente na formação de brotos alongados observados na primeira repicagem, enquanto as cultivares utilizadas por Fári et al. (2000), IPA5 e IPA-6, necessitaram de duas repicagens para o alongamento dos brotos, no entanto, a cultivar IPA-5 mostrou-se mais eficiente na produção de brotos por explante. Fári et al. (2000) utilizaram zeatina durante os três ciclos de repicagem, enquanto nesse experimento foi utilizado BAP.

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 88-93, 2006

92

SOUZA, G. de F. M. V. e et al.

TABELA 2 – Capacidade de alongamento e enraizamento de brotos da cultivar Santa Clara, durante os três ciclos de repicagem. Uberlândia, UFU, 2001. Meios

M1 + 0,5 mg/L BAP M1 + 0,8 mg/L BAP Repicagem 1 Repicagem 2 Tipos de Nº de Nº de Nº total Nº total Explante brotos brotos de brotos de brotos s alongados alongados A 31,17 bA 8,99 aA 36,84 bA 8,66 aA B 53,6 aA 4,66 bA 62,44 aA 6,33 aA C 35,27 bA 4,00 bA 43,68 bA 5,66 aA Total

M1 + 1,0 mg/L BAP Repicagem 3 Nº de Nº total brotos de brotos alongados 31,74 bA 8,1 aA 51,58 aA 4,50 bA 39,28 bA 3,12 bA

M1+ 0,5 mg/l AIA Nº total de Nº total de plantas plântulas enraizadas aclimatadas 80 67 41 33 43 35 164 135

Nº total geral de brotos 181 163 205 549

Dados seguidos de mesma letra nas colunas (a,b) e nas linhas (A,B) não diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Tipos de explantes: A - cotilédone decapitado; B - cotilédone fendido; C - cotilédone aparado.

Os resultados aqui obtidos também foram semelhantes aos de Fári et al. (1995b), que trabalhando com transformação genética da berinjela (Solanum melongena L.), observaram que a maior superfície de corte do cotilédone resultou em maior capacidade de regeneração. Também foram obtidos resultados semelhantes aos de Nogueira et al. (2001), que estudando a regeneração in vitro de tomateiro Santa Clara, utilizando como explantes cotilédones, concluíram que o meio com uma combinação adequada de auxina e citocinina (1,0 mg L1 de zeatina e 0,1 mg L-1 de AIA), promoveu uma maior média de regeneração e um maior número médio de brotações por explante. Costa et al. (2000), trabalhando com as cultivares IPA-5 e IPA-6, chegaram a uma conclusão semelhante, onde meio suplementado com 1,0 mg L-1 de zeatina + 0,1 mg L-1 de AIA, e meio suplementado com 2,5 mg L-1 de BAP + 0,2 mg L-1 de AIA, determinaram a maior freqüência de regeneração de explantes cotiledonares e também um maior número de brotos alongados por explante. McCormick et al. (1986), pesquisando a morfogênese in vitro de L. esculentum, observaram que a presença de 2,5 mg L-1 de BAP e 1,0 mg L-1 de AIA ou 1,0 mg L-1 de BAP e 0,2 mg L-1 de AIA produziu um maior número de ramos por explante, a partir de explantes de cotilédones e hipocótilos. Ohki et al. (1978), utilizando segmentos de hipocótilos de L. esculentum, sugeriram que o efeito positivo da combinação

de auxinas e citocininas na regeneração in vitro pode ser causado por uma maior capacidade das células dessa espécie em utilizar e adaptar-se à combinação de auxinas e citocininas, de que somente citocininas. Para os mesmos autores, a variabilidade observada nas respostas morfogênicas in vitro para diferentes citocininas pode ser causada pela variação na razão de degradação dessas substâncias nos tecidos vegetais ou no meio de cultivo. Segundo Caldas et al. (1999), uma alta relação citocinina/auxina normalmente leva a maior indução de parte aérea (brotos) em explantes in vitro, principalmente quando a citocinina usada é o BAP, que induz a formação de grande número de brotos e alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação. Tanto no presente trabalho, quanto nos trabalhos acima citados foram utilizados meios com pelo menos uma combinação com alta relação citocinina/auxina, e meios contendo apenas citocinina. CONCLUSÕES A maior indução de regeneração tanto de calos quanto de brotos foi observada nos métodos cotilédone fendido e cotilédone aparado quando colocados no meio com BAP (2,5 mg/L) e AIA (0,2 mg/L) (MIII). Um ciclo de repicagem foi suficiente para obtenção de brotos alongados. A maior regeneração de brotos alongados ocorreu com o método cotilédone decapitado.

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Capacidade de regeneração in vitro de tomateiro... AGRADECIMENTOS Ao Instituto de Genética e Bioquímica e ao Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Uberlândia, pelo financiamento deste projeto, e a todos que auxiliaram direta e/ou indiretamente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos. In.: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa, 1999. v. 1, 509 p. COSTA, M.; NOGUEIRA, F. T. S.; OTONI, W. C.; BROMMONSCHENKEL, S. H. Regeneração in vitro de cultivares de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) industrial ‘IPA-5’e ‘IPA-6’. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 3, p. 671-678, jul./set. 2000. FÁRI, M.; NAGY, I.; CSÁNY, M.; MITYKÓ, J.; ANDRÁSFALVY, A. Agrobacterium mediated genetic transformation and plant regeneration via organogenesis and somatic embryogenesis from cotyledon leaves in eggplant (Solanum melogena cv. Kecskeméti lila). Plant Cell Reports, Berlin, v. 15, n. 1/2, p. 82-86, Dec. 1995b. FÁRI, M.; RESENDE, G. M.; MELO, N. F. Avaliação da capacidade de regeneração in vitro em tomateiro industrial. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 35, n. 8, p. 1523-1529, ago. 2000. FARIA, R. T.; ILLG, R. D. Introgressão da capacidade de regeneração de plantas in vitro no tomateiro (Lycopersicon esculentum). In: ENCONTRO BRASILEIRO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL, REDBIO, Brasília, 1993. v. 1, p. 102. FILGUEIRA, F. A. R. Novo manual de olericultura: agrotecnologia moderna na produção e comercialização de hortaliças. Viçosa: Editora UFV, 2000. 402 p. FRARY, A.; EARLE, E. D. An examination of factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated transformation of tomato. Plant Cell Reports, Berlin, v. 16, n. 3/4, 235-240, Dec. 1996.

93

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Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 88-93, 2006

94INDUÇÃO

DE CALOS A PARTIR SILVA, A. DE S. et al.CULTURA DE ANTERAS DE CAFEEIRO (Coffea arabica L.) CV. CATUAÍ VERMELHO 99 E 44 CALLUS INDUCTION FROM ANTHER CULTURE OF COFFEE PLANT (Coffea arabica L.) CV. CATUAÍ VERMELHO 99 AND 44

ADELAIDE SIQUEIRA SILVA1, JOSÉ MAGNO QUEIROZ LUZ2, DENISE GARCIA SANTANA2, PATRÍCIA CRYSTIE VIEIRA MUSTAFA3, MOACIR PASQUAL4, GLAUCIA DE FATIMA MOREIRA VIEIRA E SOUZA2 1

Mestranda do Curso de Agronomia – Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Av. Engenheiro Diniz, 1178 – Caixa Postal 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG – [email protected] 2 Professor, Dr., – Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Instituto de Ciências Agrárias – Curso de Agronomia – AV. Pará, Bloco 2E, SALA 14,campus Umuarana – Caixa-Postal 593 – 38400-902 – Uberlândia, MG. 3 Bióloga, Universidade Federal de Uberlândia/UFU – Centro de Ciências Biomédicas – Departamento de Agronomia – Rua Amazonas s/nº - Laboratório de Cultura de Tecidos sala 2E-14 – Umuarama – 38400920 – Uberlandia, MG – [email protected] 4 Doutor, Departamento de Adgricultura/ DAG – Universidade Federal de Lavras /UFLA – Campus universitário – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras, MG – mpasqualuflabr RESUMO No Brasil, o café ainda apresenta poucos progressos com relação à aplicação da cultura de tecidos vegetais, tornando-se de grande importância o conhecimento sobre a atuação dos reguladores de crescimento. Com este trabalho, avaliou-se o comportamento de duas cultivares de Coffea arabica L.: Catuaí Vermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44, denominadas respectivamente de Catuaí Vermelho 99 e Catuaí Vermelho 44, quanto à ausência e presença de luz e quantificou-se a interação entre os reguladores de crescimento 2,4-D e BAP. O experimento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal de Uberlândia. As anteras das cultivares Catuaí Vermelho 99 e 44 foram inoculadas em meio basal MS suplementado com quatro concentrações de 2,4-D (9,05; 18,1; 27,1 e 36,2 mM) e duas concentrações de BAP (0 e 8,9 mM), na presença de luz e ausência de luz. As avaliações para a oxidação, intumescimento e calosidade foram realizadas aos 30 dias após a inoculação no meio de cultura e o diâmetro dos calos aos 45 dias. Após 30 dias de cultivo os calos obtidos foram classificados em: friáveis, esverdeados, esbranquiçados e cinza. Os resultados mostraram que, para ocorrer intumescimento das anteras, formação e aumento do tamanho dos calos de ambas, cultivares é necessário que haja interação entre a auxina (2,4-D) e a citocinina (BAP). Dentre os tipos de calos, os de coloração cinza foram os que apresentaram maior freqüência para as duas cultivares. Termos para indexação: Melhoramento, calos, reguladores de crescimento, cafeeiro.

the Plant Tissue Culture Laboratory of the Universidade Federal de Uberlândia. Anthers from both cultivars were inoculated in MS basal medium supplemented with four concentrations of 2,4-D (9.05; 18.1; 27.1 and 36.2 mM) and two concentrations of BAP (0 or 8.9 mM), in the presence and absence of light. Oxidation, intumescences and callus formation evaluations were obtained 30 days after inoculation, and callus diameter measured at 45 days of inoculation. The observed callus was classified as friable, greenish, whitish or gray. The results showed that anther intumescences, callus formation and growth, of both cultivars demand the interaction between the auxin (2,4-D) and the cytokinin (BAP). Callus presenting gray color were the most frequent for both cultivars. Index terms: Plant breeding, callus, growth regulators, coffee plant.

INTRODUÇÃO O cafeeiro pertence à família Rubiaceae, na qual o gênero Coffea abrange cerca de 60 espécies, sendo as mais comuns no mercado Coffea arábica L. e Coffea canephora Pierre ex Froehn. Os programas de melhoramento do café demandam aproximadamente 25 anos desde a hibridação até a obtenção de uma nova cultivar (PASQUAL et al., 2002). A cultura de anteras é considerada uma ferramenta importante, pois possibilita a obtenção de linhas

ABSTRACT In Brazil, coffee still presents little progress regarding the application of plant tissue culture which turns important the understanding of the action of growth regulators. This work evaluated the in vitro performance of two Coffea arabica L. cultivars: Catuaí Vermelho LCH-2077-2-5-99 and LCH-2077-25-44, known as Catuaí Vermelho 99 and Catuaí Vermelho 44, respectively, in the presence and absence of light and the interaction of 2,4-D and BAP. The experiment was carried out at

homozigóticas em uma única etapa (ANDRADE, 1998), acelerando drasticamente o processo de obtenção de novas cultivares. Sendo assim, a técnica de cultura de anteras vem auxiliar no melhoramento da cultura, pois permite a obtenção de haplóides em gerações segregantes, o que leva à rápida produção de plantas homozigotas por meio

(Recebido em 14 de outubro de 2003 e aprovado em 29 de outubro de 2006)

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v. 2, n. 2, p. 94-101, 2006

Indução de calos a partir de cultura... da duplicação do número de cromossomos numa única etapa, substituindo as gerações de auto fecundação. Acrescenta-se a isso o fato de os haplóides serem livres dos problemas de dominância e recessividade, por possuir apenas um alelo em cada loco gênico. No Brasil, Coffea arabica ainda apresenta poucos progressos com relação à aplicação da cultura de anteras. Daí a importância de se produzir mais conhecimentos sobre a atuação dos reguladores de crescimento na expressão androgenética de Coffea arabica, identificação de genótipos androgênicos, bem como a determinação de condições físicas mais adequadas à incubação de anteras nessa espécie. Nos programas de melhoramento, as técnicas convencionais têm apresentado resultados promissores na cultura do café, no que se refere ao aumento de produtividade e obtenção de novas cultivares. Um fator importante para o sucesso da cultura de anteras é conhecer o estádio ideal de desenvolvimento dos micrósporos, com o intuito de se obter uma melhor resposta androgenética; utilizando micrósporos recém-liberados da tétrade meiótica até no máximo o estádio binucleado. A fase uninucleada responde positivamente ao processo embriogênico porque, nesta fase, os micrósporos apresentam uma parede celular delgada, o que a torna mais receptiva aos fatores externos. Em estádios mais avançados da microsporogênese, ocorre um engrossamento da parede celular, sendo esta uma característica do grão de pólen maduro do café, prejudicando o processo de regeneração (ASCANIO & ARCIA, 1994). Os autores Grando & Moraes Fernandes (1993) sugerem que o potencial embriogênico do grão de pólen pode ser determinado tanto no período da meiose quanto no período da pré-mitose do micrósporo, pois nestes dois momentos o micrósporo ainda teria metabolicamente características esporofíticas, o que permite a diferenciação do grão de pólen em embrião e posterior formação de uma planta. Segundo Mantell et al. (1994), são possíveis vários tipos de desenvolvimento do micrósporo in vitro, sendo

95

que tanto o núcleo generativo quanto o vegetativo pode se dividir continuamente, originando um embrióide haplóide, ou ainda, a primeira mitose produziria dois núcleos semelhantes e estes se dividiriam repetidamente, resultando na formação de embrióides haplóides. A composição do meio de cultura também é de grande importância para o sucesso da cultura de anteras, não existindo, contudo, uma recomendação generalizada. Na maioria das espécies, a androgênese se verifica em meios que contém sais minerais, sacarose, vitaminas, reguladores de crescimento e ágar (MORAES FERNANDES, 1990). A consistência do meio normalmente é semi-sólida, mas os meios líquidos estão sendo cada vez mais usados, pois têm vantagens no aumento do rendimento pela maior obtenção de embriões e calos (PIERIK, 1987). O presente trabalho teve como objetivo aplicar a técnica da cultura de anteras em diferentes cultivares de Coffea arabica, verificando os vários fatores que influenciam a indução de calos. MATERIAL E MÉTODOS Experimentos de Indução e Regeneração de Calos Esta etapa constituiu-se de dois experimentos, cada um com uma cultivar, tendo sido conduzidos no laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Universidade Federal de Uberlândia em Uberlândia - Minas Gerais, no período de setembro de 2002 a janeiro de 2003. Foram utilizados botões florais de duas cultivares de Coffea arábica: Catuaí Vermelho LCH-2077-2-5-99 e LCH-2077-2-5-44, denominadas respectivamente de Catuaí Vermelho 99 e Catuaí Vermelho 44, plantadas na área experimental do Campus Umuarama dessa Universidade. Os botões florais foram coletados no período de 8 às 9 horas da manhã e armazenados em placas de Petri contendo papel de filtro umedecido em água destilada e colocados dentro de uma caixa de isopor para evitar a desidratação, até serem conduzidos ao laboratório. No laboratório, o comprimento dos botões foi medido com o auxílio de um paquímetro e utilizaram-se

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botões florais entre 4,5 a 6,0 mm de comprimento em todos os experimentos. Os botões foram envoltos em gaze previamente autoclavada e desinfestados em uma solução de álcool 70% por alguns segundos e por 10 minutos em solução de hipoclorito de sódio a 0,2%, sob agitação. Em seguida, na câmara de fluxo laminar, foram lavados 3 vezes em água destilada e autoclavada. Após este processo, as anteras foram retiradas dos botões com o auxílio de uma lupa, uma pinça fina e bisturi nº 10; sendo os últimos flambados para cada botão, tomando-se o cuidado para não ferir as anteras. Logo após, as anteras foram imersas por 1 segundo em solução de ácido ascórbico na concentração de 600 mgL-1, hipoclorito de sódio 0,2% e água destilada e autoclavada, respectivamente. Após este processo as anteras foram inoculadas em tubo de ensaio, contendo 20 mL do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), suplementado com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e 6- benzilaminopurina (BAP) em diferentes concentrações, com pH ajustado para 5,8. Este meio foi esterilizado em autoclave vertical à temperatura de 121° C, sob pressão de 1 atm por 20 minutos. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados com 10 repetições em esquema fatorial 4 x 2 x 2, sendo que os fatores foram compostos de quatro concentrações de 2,4-D (9,05; 18,1; 27,1; 36,2 mM), duas concentrações de BAP (0 e 8,9 mM) perfazendo oito tratamentos, incubados na ausência ou presença de luz em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 2°C e 16 horas de fotoperíodo. Nos dois experimentos, cada tratamento teve 10 repetições, sendo um tubo com 10 anteras considerado uma repetição. Aos 30 dias após a inoculação das anteras, foram avaliadas as porcentagens de oxidação, de intumescimento e de formação de calos (calosidade), e aos 45 dias foi medido o diâmetro dos calos. Os calos obtidos das duas cultivares após 45 dias de inoculação das anteras foram transferidos para o meio MS suplementado com 30 gL-1 de sacarose, 6gL-1 de agar e de 2,4-D/BAP nas seguintes concentrações de 18,1/0; 18,1/

2; 27,1/0 e 36,2/0 mM, com pH ajustado para 5,8 associando a ausência e presença de luz. Após a permanência destes calos no meio de cultura por 30 dias, aqueles provenientes da cultivar Catuaí Vermelho 99, incubados na presença de luz foram transferidos para o meio de cultura contendo 27,1 mM de 2,4-D; enquanto que aqueles incubados na ausência de luz foram transferidos para meio contendo 36,2 mM de 2,4D. Já os calos da cultivar Catuaí Vermelho 44, incubados na presença de luz, foram transferidos para meio contendo 18,1 mM de 2,4-D e 8,9 mM de BAP; e os incubados na ausência de luz, transferidos para o meio contendo 18,1 mM de 2,4-D. Após 30 dias neste tratamento, foram avaliadas as características referentes ao tipo de calo (friáveis, esverdeados, esbranquiçados e cinza). Os dados obtidos foram testados quanto à normalidade e à homogeneidade, necessitando de transformação em arco seno para os dados em porcentagem e raiz quadrada de (x + 0,5) para os dados referentes ao diâmetro dos calos. RESULTADOS Interação entre os Reguladores de Crescimento e o Fotoperíodo Para a cultivar Catuaí 99, em todas as concentrações de 2,4-D e independentemente da concentração de BAP, a oxidação foi menor na ausência de luz, diferindo estatisticamente da fase em que se tinha presença de luz. No entanto, nos calos cultivados nas concentrações de 9,05 e 27,1 mM de 2,4-D e 8,9 mM de BAP na ausência de luz foi observado um aumento significativo na oxidação das anteras, o mesmo acontecendo na concentração de 27,1 mM de 2,4-D na presença de luz. No entanto, resultado inverso foi observado para a concentração de 36,2 mM de 2,4-D (Tabela 1). Os resultados do percentual de intumescimento variaram bastante, em função da luminosidade e reguladores de crescimento (Tabela 1). Na presença do

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Indução de calos a partir de cultura...

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BAP e concentração 8,9 mM de 2,4-D, tanto na presença

concentração de 27,1 mM de 2,4-D, nas demais

ou ausência de luz o intumescimento dos calos não diferiu

concentrações de 2,4-D, independente da concentração

significativamente. Já na concentração de 18,1 mM de 2,4-

do BAP, a incubação na ausência de luz apresentou

D na presença de luz se mostrou melhor, promovendo um

médias de calosidade significativamente maiores (Figura

aumento significativo do intumescimento das anteras.

2). A presença do BAP promoveu aumento significativo

Quanto às concentrações de 27,1 e 36,2 mM de 2,4-D

na calosidade das anteras na concentração 27,1 mM de

cultivados na presença de luz se mostrou melhor ao

2,4-D na ausência de luz, e na concentração de 36,2 mM

intumescimento quando comparado àqueles cultivados na

de 2,4-D na presença de luz. Nas demais concentrações

ausência de luz (Figura 1).

não houve diferença significativa entre presença ou

A presença de calos aumentou significativamente com a incubação das anteras na ausência de luz e na

ausência de BAP, tanto na ausência ou presença de luz (Tabela 1).

TABELA 1 – Médias do número de anteras oxidadas, intumescidas e com calos, e diâmetro dos calos (mm), em função de diferentes concentrações de 2,4-D e ausência ou presença de BAP em duas condições de luminosidade (presença ou ausência de luz) para anteras do genótipo cv 99.

Luminosidade1 2,4-D BAP Oxidação (%) Intumescimento (%) Calosidade (%) Diâmetro (mm) luz Escuro Luz Escuro luz Escuro luz Escuro M M 0 9,80 b A 3,95 a A 0,00b B 4,34 a A 0,00 b A 7,40 a A 0,00 b A 3,09 a A 9,05 8,9 9,99 b A 8,23 a B 3,98 a A 3,27 a B 0,07 b A 6,15 a A 0,00 b A 3,00 a A 0 9,99 b A 5,24 a A 0,00 b B 4,47 a A 0,07 b A 7,50 a A 0,00 b B 3,68 a A 18,1 8,9 9,35 b A 5,11 a A 6,14 a A 4,07 b A 0,30 b A 7,20 a A 3,00 b A 3,87 a A 0 7,45 b A 0,00 a A 5,34 a A 0,00 b B 5,30 a A 0,00 b B 3,18 a B 0,00 b B 27,1 8,9 9,14 b B 5,90 a B 6,25 a A 6,34 a A 7,08 a A 8,09 a A 3,77 a A 2,98 b A 0 9,99 b B 4,40 a A 6,07 a A 4,92 b A 0,97 b B 8,15 a A 3,00 a B 2,77 a A 36,2 8,9 8,13 b A 4,26 a A 4,93 a B 5,27 a A 3,78 b A 7,58 a A 3,98 a A 2,98 b A 1 Médias seguidas por letras diferentes, minúsculas na linha e maiúsculas na coluna dentro de cada concentração de 24-D, diferem entre si pelo teste de Tuckey a significância de 5%.

FIGURA 1 – Anteras da c.v Catuaí Vermelho 99 na concentração de 18,1 M de 2,4-D na presença de luz.

FIGURA 2 – Calos de anteras incubadas na ausência de luz e na concentração de 27,1 M de 2,4-D.

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Quanto ao diâmetro, nas concentrações 9,05 e 18,1 M de 2,4-D, a ausência de luz promoveu aumento significativo no diâmetro dos calos, diferindo-se estatisticamente do tratamento na presença de luz. Somente para a concentração de 27,1 mM de 2,4-D, na ausência do BAP, não houve diferença significativa para a característica, independentemente do fotoperíodo. Nas demais concentrações de 2,4-D, o tratamento na presença de luz promoveu um aumento significativo no diâmetro dos calos. No tratamento em que houve a associação da presença de luz e de BAP não diferiu estatisticamente do tratamento em que houve a ausência de BAP quando a concentração de 2,4-D foi de 9,05 mM, nos demais proporcionou aumento significativo no diâmetro dos calos. Para o tratamento na ausência de luz, apenas na concentração de 27,1 mM de 2,4-D a ausência de BAP promoveu diminuição significativa no diâmetro de calos. Nas demais concentrações não houve diferença significativa entre presença ou ausência de BAP (Tabela 1). Para as variáveis intumescimento e calosidade da cultivar cv. 44, a interação entre 2,4-D e BAP não diferiram estatisticamente quanto presença e ausência de luz nas

concentrações 9,05 e 36,2 mM de 2,4-D, e que também não difere para o diâmetro na concentração de 18,1 mM de 2,4D. Já na concentração 27,1 mM de 2,4-D há uma semelhança quanto ao intumescimento, calosidade e diâmetro que diferem das demais concentrações, não apresentando portanto, uma boa interação. A melhor interação para intumescimento, calosidade e diâmetro, encontra-se respectivamente: na concentração 9,05 mM de 2,4-D na presença de luz, na concentração 18,1 mM de 2,4-D na ausência de luz e na concentração 9,05 mM de 2,4-D na ausência de luz. Já as piores interações estão na concentração 27,1 mM de 2,4-D na luz tanto para o intumescimento quanto para o diâmetro, analisados na Tabela 2. De acordo com a Tabela 2, observou-se que os melhores resultados, ou seja, as interações independem da presença ou ausência de BAP. Na Tabela 3, notou-se uma maior oxidação das anteras quando incubadas no claro, estas apresentaram uma maior oxidação em relação as que foram incubadas no escuro tornando-se mais tarde calos previamente oxidados.

TABELA 2 – Médias do número de anteras intumescidas e com calos, diâmetro dos calos (mm) em função de diferentes concentrações de 2,4-D e ausência ou presença de BAP em duas condições de luminosidade (luz e escuro) para anteras do genótipo cv 44. Luminosidade1 2,4-D BAP Intumescimento (%) Calosidade (%) Diâmetro (mm) Luz Escuro Luz Escuro Luz Escuro ( M) ( M) 0 9,07 a A 7,75 a A 7,79 bA 9,48 aA 6,09 bA 8,00 aA 9,05 8,9 8,43 a A 8,75 a A 8,89 aA 9,46 aA 6,07 aA 4,20 bB 0 8,87 a A 8,52 a A 9,39 aA 9,90 aA 4,90 aA 4,66 aA 18,1 8,9 9,06 a A 7,86 a A 9,17 aA 9,59 aA 4,20 aA 4,93 aA 0 6,00 b A 7,72 a A 6,94 bA 8,95 aA 0,00 bA 3,73 aA 27,1 8,9 0,22 b B 8,27 a A 2,94 bB 8,37 aA 0,00 bA 3,76 aA 0 8,28 a A 7,37 a A 9,28 aA 9,39 aA 4,14 bA 5,95 aA 36,2 8,9 8,66 a A 7,25 a A 9,49 aA 8,66 aA 3,29 aA 3,76 aA 1 Médias seguidas por letras diferente, minúsculas na linha e maiúsculas na coluna dentro de cada concentração de 24-D, diferem entre si pelo teste de Tukey a significância de 5 %.

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Indução de calos a partir de cultura... Nesta etapa, a maioria dos calos encontrados para as três cultivares apresentaram coloração cinza (Tabelas 4, 5 e 6). A perda gradativa da coloração natural dos calos, passando de verdes para a cor marrom, a diminuição do ritmo de crescimento dos mesmos, a estagnação do processo de formação de embrióides, seguido do surgimento de áreas necrosadas na superfície são sinais que caracterizam a senescência da cultura (SILVA, 2002). DISCUSSÃO A resposta das anteras da cultivar Catuaí Vermelho 99 com relação à oxidação indica que a mesma está associada à combinação entre auxina e citocinina, promovendo os menores índices de oxidação. À medida que se aumentou a concentração de 2,4-D na presença de BAP, houve um aumento gradativo da oxidação até atingir um ponto máximo, em torno de 80% na dosagem de 27,1 mM de 2,4-D. Já na TABELA 3 – Médias de oxidação das anteras, entre as diferentes concentrações de 2,4-D, em duas condições de luminosidade (luz e escuro) para anteras da cultivar Catuaí Vermelho 44.

Concentrações 2,4-D ( M ) 9,05 18,1 27,1 36,2

Claro 7,49 a 4,20 a 9,99 a 3,08 a

OXIDAÇÃO (%) Escuro 2,69 b 2,70 b 2,21 b 3,34 a

99

ausência de BAP a oxidação foi bem maior quando comparada à porcentagem de oxidação na concentração de 9,05 mM de 2,4-D. De acordo com Wang & Huang (1976), o cultivo in vitro, por um período longo, induz a formação de compostos fenólicos no meio que podem causar necrose e posteriormente morte dos calos. Maciel (2001) e Palú (2002) citam que pelos resultados obtidos para a indução de calogênese em anteras de cafeeiro, observa-se que é necessária uma auxina juntamente com uma citocinina. Dentre as auxinas sintéticas, o 2,4-D é sem dúvida o mais adequado à indução e manutenção do calo (GAMBORG et al., 1976). Para Thomas & Ravindra (1997), o maior problema na iniciação de culturas lenhosas é a ocorrência de compostos fenólicos que estão ligados com processos de regulação de crescimento, especialmente com as auxinas, que dependendo da sua concentração endógena no tecido, resulta na indução desses compostos. TABELA 4 – Tipos de calos obtidos após 30 dias em meio MS com 36,2 M de 2,4-D, na ausência de luz, da cultivar Catuaí Vermelho 99.

Tipos de Calos

Número de Número de Calos Calos com diâmetro acima de 0,5 mm Friáveis 03 Esverdeados 13 06 Esbranquiaçados 03 Cinza 26

1

Médias seguidas por letras diferentes minúsculas na linha dentro de cada concentração de 2-4-D, diferem entre si pelo teste de Tukey a significância de 5 %.

Dados de contagem, não transformados; O recultivo em meio MS com 36,2 M de 2,4-D, na presença de luz, teve 100% de contaminação após sua inoculação.

TABELA 5 –Tipos de calos obtidos após 30 dias em meio MS com 18,1 M de 2,4D e 8,9 M de BAP, na presença de luz, da cultivar Catuaí Vermelho 44.

TABELA 6 – Tipos de calos obtidos após 30 dias em meio MS com 18,1 M de 2,4D, na ausência de luz, da cultivar Catuaí Vermelho 44.

Tipos de Calos

Número de Calos

Número de Calos com diâmetro acima de 0,5 mm

Friáveis 25 Esverdeados 11 69 Esbranquiaçados 19 Cinza 350 Dados de contagem, não transformados.

Tipos de Calos

Número de Calos

Número de Calos com diâmetro acima de 0,5 mm

Friáveis 58 Esverdeados 23 Esbranquiaçados 94 Cinza 203 Dados de contagem, não transformados.

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SILVA, A. S. et al.

O fotoperíodo que estas anteras foram submetidas influenciou também na porcentagem de oxidação, sendo que no escuro e na presença de 2,4-D (8,9 mM) a oxidação foi mínima. À medida que foi aumentando a concentração da auxina foi aumentando também a oxidação, porém este aumento foi bem menor quando comparado ao cultivo das anteras na presença de luz. A oxidação fenólica tem sido controlada em diferentes espécies lenhosas pela redução da intensidade luminosa (MARKS & SIMPSON, 1990), associada com a substituição freqüente do meio de cultura, e dessa forma, as chances de se obter sucesso no estabelecimento e cultivo de explantes de espécies lenhosas são bastante elevadas (TEIXEIRA, 2001). Em muitas espécies, por razões não conhecidas, a embriogênese direta é rara e as plantas têm que ser diferenciadas a partir de calos. Para indução destes, geralmente é necessária uma auxina (MAHESHWARI et al., 1982). Segundo Rocha (1998), para a indução e manutenção do calo a maioria das espécies parece comportar-se diferentemente não só quanto aos reguladores de crescimento; podendo ocorrer independentemente de auxinas e citocininas, dependente de ambas, ou dependente de uma ou de outra; mas também quanto à presença ou ausência de luminosidade. Sharp et al. (1973) obtiveram calos através do cultivo de sementes, folhas e anteras de C. arabica das cultivares Mundo Novo e Bourbon Amarelo. A indução de calos também foi mais eficiente na ausência de luz. Além disso, Ascanio & Arcia (1994) citam que, para o desenvolvimento do calo, as anteras devem ser mantidas no escuro, já para o desenvolvimento do embrião, os calos devem ser mantidos no claro. Não houve a formação de embriões; e isto pode ser devido às doses de reguladores ou mesmo de combinações que não foram apropriadas para estas cultivares. CONCLUSÃO Os resultados mostraram que para ocorrer intumescimento das anteras, formação e aumento do

tamanho dos calos de ambas as cultivares é necessário que haja interação entre a auxina (2,4-D) e a citocinina (BAP) e incubação no escuro. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, L. M. C. O. Otimização de técnicas de cultura de tecidos para o cafeeiro (Coffea arabica). 1998. 86 p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. ASCANIO, E. C. E.; ARCIA, M. A. M. Efecto del estado de desarrollo de las anteras y de un shock térmico sobre la androgénesis en Coffea arabica L. var. Garnica. Café Cacao Thé, Paris, v. 28, n. 2, p. 75-79, avr./juin. 1994. GAMBORG, O. L.; MURASHIGE, T.; THORPE, T.; VASIL, I. K. Plant tissue culture media. In Vitro, New York, v. 12, n. 7, p. 473-478, 1976. GRANDO, M. F.; MORAES FERNANDES, M. I. B. Proposta de um modelo para explicar a embriogênese do grão de pólen in vitro. In: ENCONTRO BRASILEIRO DE BIOTECNOLOGIA VEGETAL, 1993, Brasília, DF. Anais... Brasília, 1993. v. 1, Resumo, 69. MACIEL, A. L. de R. Embriogênese somática indireta em Coffea arabica L. 2001. 60 p. Dissertação (Mestrado em Fitotecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG. MAHESHWARI, S. C.; RASHID, A.; TYAGI, A. K. Haploids from pollen grain. Retrospect and Prospect. American Journal of Botany, Columbus, v. 69, n. 5, p. 865-879, May 1982. MANTELL, S. H.; MATTHEWS, J. A.; McKEE, R. A. Princípios de biotecnologia em plantas: uma introdução à engenharia genética em plantas. Ribeirão Preto: SBG, 1994. 333 p. MARKS, T. R.; SIMPSON, S. E. Reduced phenolic oxidation at culture initiation in vitro following the exposure of field-grown stockplants to darkness or low levels of irradiance. The Journal of Horticultural Science, London, v. 65, n. 2, p. 103-111, Mar. 1990. MORAES FERNANDES, M. I. B. Obtenção de plantas haplóides através da cultura de anteras. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S. (Ed.). Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasília: ABCTP/EMBRAPA/CNPH, 1990. p. 311-332.

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COMUNICAÇÃO PEREIRA, F. D.CIENTÍFICA et al.

PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE BROTOS DE CURAUÁ UTILIZANDO DIFERENTES VOLUMES DE MEIO DE CULTURA IN VITRO SHOOT PROLIFERATION OF Ananas erectifolius USING DIFFERENT VOLUMES OF CULTURE MEDIUM FLÁVIA DIONÍSIO PEREIRA1, JOSÉ EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO2, HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES3, LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO3, LUIZ ALBERTO BEIJO4, OSMAR ALVES LAMEIRA5 1

Doutoranda em Agronomia – Universidade Estadual de Feira de Santana/UEFS – Horto Florestal – 44055-000 – Feira de Santana, BA – [email protected] 2 Doutor em Fisiologia Vegetal – Departamento de Agricultura/DAG – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras, MG – [email protected] 3 Graduanda em Agronomia – Universidade Federal de Lavras/UFLA – Caixa Postal 3037 – 37200-000 – Lavras, MG. 4 Doutorado em Agronomia – Universidade Federal de Alfenas/UNIFAL – Departamento de Ciências Exatas – Rua Gabriel Monteiro da Silva, n ° 714 – Centro – 37130-000 – Alfenas, MG – [email protected] 5 Doutor em Agronomia – EMBRAPA – Amazônia Oriental – Trav. Dr. Enéas Pinheiro s/n – Bairro Marco – 66095-100 – Belém, PA – [email protected]

RESUMO Curauá [Ananas erectifolius L.B.Sm – Bromeliaceae] é uma espécie com grande potencial de uso de suas fibras como revestimento na indústria automobilística. Além disso, o pó do sumo do curauá tem sido utilizado no tratamento de cicatrização de lesões cutâneas. Neste trabalho avaliaram-se diferentes volumes de meio MS. Os volumes utilizados foram de 10 , 15, 20, 25 e 30 mL. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) e cada tratamento continha 19 repetições. Aos 30 dias, avaliaramse o número e o tamanho de brotações. Segundo a análise de variância, houve efeito linear do volume de meio na produção de brotos de curauá. À medida em que se aumenta o volume do meio, aumenta o número de brotos. Não houve diferença significativa nos comprimentos dos brotos. Termos para indexação: Ananas erectifolius, fibras vegetais, micropropagação.

number was observed with the increase of medium volume. No significant difference was observed on shoot lenght. Index terms: Ananas erectifolius, vegetable fiber, micropropagation.

A produção de fibras vegetais ocupa um papel relevante na economia agrícola mundial, mesmo com a intensa produção de fibras sintéticas. Matérias-primas de origens renováveis, recicláveis e biodegradáveis são uma das alternativas para a produção de manufaturados ecologicamente corretos, em conseqüência do acúmulo nos descartes de materiais não biodegradáveis, os quais tendem a aumentar com o crescimento populacional nos

ABSTRACT Ananas erectifolius L.B.Sm – Bromeliaceae is a species that presents fibers with great potential to be used as revetment for the automobile industry. Besides, the powder obtained from its juice has been used in the treatment of skin lesions cicatrisation. In this work, the effect of different volumes (10, 15, 20, 25 and 30 mL) of MS medium during the in vitro culture of axillary buds was evaluated. A completely randomized design (CDR) was used; with each treatment containing 19 replicates. After 30 days of inoculation, shoot number and size were evaluated. The analysis of variance showed a linear effect of the culture medium volume and shoot proliferation. Higher shoot

centros urbanos. A substituição de materiais derivados do petróleo na produção de compostos elastoméricos por matéria-prima renovável vai ao encontro desses ideais (ROCHA et al., 2003). As fibras sintéticas destacam-se pela elevada resistência, baixa densidade e elevada produção. Entretanto, as fibras animais e vegetais são as de maior importância, principalmente para atender aos apelos

(Recebido em 31 de agosto de 2006 e aprovado em 19 de janeiro de 2007)

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Proliferação in vitro de brotos de curauá... ecológicos e pelo número de plantas e animais produtores de fibras (SCHREIBER,1998). As plantas produtoras de fibras utilizáveis foram quantificadas por vários autores e em diferentes épocas, tendo sido enumeradas 2.000 mil plantas fibrosas e o seu total estimado em 2.300, destacando-se as florestas tropicais que encerram recursos inesgotáveis em potencial (MEDINA, 1959). O curauá [Ananas erectifolius L.B.Sm – Bromeliaceae], utilizado principalmente na fabricação de cordas, sacos e utensílios domésticos, surge como sucedâneo para o aproveitamento de fibras. O curauá é uma bromeliácea distribuída nos Estados do Pará, Acre, Mato grosso, Goiás e Amazonas e é cultivada, principalmente, por pequenos produtores da região do Lago Grande de Curuai, no município de Santarém, PA. Estudos recentes têm demonstrado o grande potencial do uso das fibras dessa planta como revestimento na indústria automobilística, devido à sua resistência, maciez e peso reduzido. O grande problema é que não há suprimento suficiente de matéria-prima para atender à indústria automobilística, pois o curauá é fiel às suas origens amazônicas e só se desenvolve em clima quente e úmido, criando um problema para a aquisição de mudas fora desta região que, por tal motivo, é escassa no mercado (SILVA, 2004). A micropropagação utilizando técnicas de cultura de tecido tem sido um valioso instrumento na propagação de diversos tipos de plantas. Embora este processo envolva diferentes etapas, depois de definido um protocolo de micropropagação, seja qual for a espécie, este pode ser otimizado, no intuito de se obter plântulas de alta qualidade e com baixo valor de produção. O tipo e tamanho de frasco e a quantidade de meio são variáveis que têm recebido pouca atenção, embora afetem diretamente a área superficial da interface meio de cultura-atmosfera, o volume de ar sobre o meio de cultura e a sua profundidade. Tais fatores também afetam a composição da fase gasosa do frasco e, conseqüentemente, o crescimento e desenvolvimento das culturas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).

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Rodrigues et al (2005) verificaram maior proliferação de brotos de Cattleya persivaliana Hort. em frascos contendo 50 mL de meio, quando comparados com aqueles de 25, 75, e 100 mL. Nicoloso & Erig (2002), trabalhando com Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen, verificaram que 10 mL de meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) proporcionaram o melhor crescimento das plântulas em biomassa quando cultivadas em tubos de 20 cm de altura x 2 cm diâmetro, em comparação com os de 25 cm de altura x 2 cm, 15 cm de altura x 2 cm. Carvalho et al. (1995), estudando a influência de fatores físicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de batata-doce (Ipomoea batatas L. Poir), verificaram que 10 mL de meio de cultura por frasco com explantes proporcionaram maior formação de gemas em relação aos volumes de 20 e 30 mL. Sendo assim, objetivou-se, neste trabalho, avaliar o volume de meio apropriado para a propagação in vitro de brotações de curauá. As brotações utilizadas como fonte de explante foram fornecidas pela EMBRAPA/CPATU situada em Belém do Pará. Gemas axilares de curauá foram inoculadas em meio MS completo, suplementado com 2,0 mg/L de BAP (6-Benzilaminopurina). Após 30 dias estas se desenvolveram e as brotações obtidas foram transferidas para o meio MS sem regulador de crescimento por 30 dias. Após este período, quatro explantes foram desfolhados completamente, ficando apenas porções basais com aproximadamente 1cm de comprimento que foram inoculadas em meio de cultura básico MS sem regulador de crescimento, em frasco de 12 cm de altura por 5 cm de diâmetro (volume interno = 300 mL), com volumes de 10, 15, 20, 25, 30 mL. Os explantes foram mantidos em sala de crescimento a uma temperatura de 26±1°C e fotoperíodo de 16 horas sob uma Irradiância de fótons de 25mmol m-2 s-1. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC). Cada tratamento continha 19 repetições

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(um frasco por repetição). Aos 30 dias avaliaram-se o número e o comprimento das brotações. O programa utilizado para análise dos dados foi o software statistica (SISVAR), tendo sido submetidas à análise de variância, com aplicação do teste F a 5% de probabilidade, analisando-se as médias por regressão polinomial. O efeito linear foi o mais adequado para explicar a evolução da taxa média de regeneração do curauá. À medida que o volume do meio de cultura aumenta, existe tendência de aumento do número de brotos. Com 25 mL de meio produziu-se maior número de brotos por frasco (25,57) e com 10 mL de meio produziu-se menor número de brotos (12,26). O tratamento com 15 mL de meio produziu 17,65 brotos, o com 20 mL, 17,50 e o com 30 mL, 22,42 (Figura 1). O volume maior de meio disponibiliza mais nutrientes e diminui também a competição entre as plântulas, o que explica a tendência em se obter um maior número de brotos à medida que se aumenta a quantidade do meio de cultura. Em todos os tratamentos as brotações obtidas foram vigorosas, com a coloração verde-escura característica das plantas matrizes. As brotações tinham também rigidez, outra característica da espécie, o que é devido à presença das fibras nas folhas. Observou-se maior concentração de raízes nas brotações maiores e não

FIGURA 1 – Número médio de brotos por frasco de curauá (Ananas erectifolius) cultivados em diferentes volumes de meio MS completo. 10, 15, 20, 25 e 30.

foi observada a presença de calos em nenhum dos tratamentos (Figura 2). Resultados semelhantes foram obtidos por Reis, Lameira, Reis (2004), trabalhando com curauá utilizando volumes de 5, 7,5, 10 e 15 mL do meio líquido MS, suplementados com 2,5 mg.L-1 de BAP (6-benzilaminopurina), os melhores resultados sendo com os tratamentos que continham 10 e 15ml, produzindo, em média, 1,21 e 1,54 brotos/explante, respectivamente. Da mesma forma, Reis et al.(2003), trabalhando com ipeca (Psychotria ipecacuanha Stokes) em meio MS acrescido de 1,5 mg. L-1de BAP nos volumes de 10, 20, 30 e 40 mL, obtiveram melhor resultado com os volumes de 30 e 40 mL (7 e 8 brotos/frasco, respectivamente). Quanto ao comprimento dos brotos, não houve diferença significativa. Os brotos tiveram um crescimento médio de 2,28 cm, sendo que no tratamento com 10 mL de meio foi 2,57 cm; com 15 mL, 2,22 cm; com 20 mL, 2,24 cm; com 25 mL, 2,24 cm e o tratamento com 30 mL, 2,15 cm. Embora não se tenham realizado estudos mais aprofundados, uma das hipóteses sugeridas para explicar tais resultados, possivelmente, está relacionada a fatores nutricionais do explante. Segundo Cappelades et al. (1991) e Pereira et al., (2001), porções basais são mais robustas, apresentando maior quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos, o que poderia levar à utilização dessas reservas pelas brotações regeneradas para sustentar seu crescimento. Esta seria uma das causas da uniformidade apresentada no tamanho das brotações em todos os tratamentos. Resultados iguais foram obtidos em estudos feitos por Rodrigues et al. (2005), quando avaliaram comprimento médio de duas espécies de orquídeas mantidas em meio de cultura cujos volumes testados eram de 25, 50, 75 e 100 mL. Portanto, verifica-se que é muito importante selecionar material com bom estado fisiológico e tamanho homogêneo, para se obter melhores resultados na proliferação das brotações e/ou na morfogênese.

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FIGURA 2 – Brotações de curauá (Ananas erectifolius) produzidas in vitro em diferentes volumes de meio MS. 1Repicagem dos brotos; 2- 10 mL de meio MS; 3- 15 mL de meio MS; 4- 20 mL de meio MS; 5- 25 mL de meio MS; 6- 30 mL de meio MS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARVALHO, R.; FAVARETTO, N.; PINTO, J. E. B. P. Influência de fatores físicos no desenvolvimento e crescimento in vitro de batata-doce (Ipomea batatas (l.) Peir. Ciência e Prática, Lavras, v. 19, n. 2, p. 158-164, abr./jun. 1995. CAPPELADES, M.; LEMEUR, R.; DEBERGH, P. Effects of sucrose on starch acumulation and rate of photosyntesis in Rosa cultured in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 25, n. 1, p. 21-26, Apr. 1991.

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curauá. Disponível: . Acesso em: ago. 2004. ROCHA, E. C.; GHELER JÚNIOR, J. Aproveitamento de resíduos gerados na aglomeração de fibras de coco com Látex natural. Matéria Técnica. Disponível em: . Acesso em: jun. 2003. RODRIGUES, J. D.; ARAÚJO, A. G.; ASSIS, F. A. A.; CAVALLARI, L. L.; PASQUAL, M. Crescimento in vitro de plântulas de orquídeas: quantidade de meio de cultura e número de explantes. In: CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UFLA – CICESAL, 18., 2005, Lavras, MG. Anais... Lavras: UFLA, 2005. 1CD-ROM. SILVA, C. País pesquisa mais fibras naturais para carros. Disponível em: . Acesso em: out. 2004. SCHREIBER, V. (Org.). Vias de desenvolvimento sustentável: as dimensões do desafio. Belém: UFBA/ NUMA/POEMA/IDESP, 1998. 495 p. (POEMA, 6).

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termos em ordem decrescente de importância. b) TÍTULO EM INGLÊS; c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no máximo 6 (seis), em letras maiúsculas, um após o outro, centralizados, e no rodapé da primeira página , deverão vir a formação acadêmica e a Instituição onde trabalham; d) RESUMO (de acordo com NBR6028 da ABNT). O resumo não deve ultrapassar a 250 (duzentos e cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos. Após o Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXAÇÃO (palavraschave), diferentes daqueles constantes do título e separados por vírgula. Os termos para indexação devem estar descritos na forma maiúscula e minúscula, serem expressões que identifiquem o conteúdo do artigo, ser indicadas entre 3 e 5, e se possível, extraídas do vocabulário Thesagro – Thesaurus Agrícola Nacional, desenvolvido pela CENAGRI (indicação da revista “Plant Cell Culture & Micropropagation”para evitar o uso de vários sinônimos como termos de indexação). Se não forem encontrados descritores disponíveis para cobrirem a temática do artigo, poderão ser indicados termos ou expressões de uso conhecido; e) ABSTRACT, incluindo, em seguida, INDEX TERMS; f) INTRODUÇÃO (incluindo a revisão de literatura); g) MATERIAL E MÉTODOS; h) RESULTADOS E DISCUSSÃO (podendo conter tabelas e figuras); i) CONCLUSÕES; e j) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 5. A comunicação deverá conter os seguintes tópicos: a) TÍTULO, suficientemente claro, conciso e completo, evitando palavras supérfluas. Recomenda-se começar pelo termo que represente o aspecto mais importante do trabalho, com os demais termos em ordem decrescente de importância. Deve ser apresentada a versão do título para o idioma inglês; b) TÍTULO EM INGLÊS; c) NOME(s) DO(s) AUTOR(es) no máximo 6 (seis), em letras maiúsculas, um após o outro, centralizados, e no rodapé da primeira página, deverão vir a formação acadêmica e a Instituição onde trabalham; d) RESUMO (de acordo com NBR6028 da ABNT). O resumo não deve ultrapassar a 250 (duzentos cinqüenta) palavras e não possuir parágrafos. Após o Resumo devem-se incluir TERMOS PARA INDEXAÇÃO (palavras-chave), diferentes daqueles constantes do título e separados por vírgula. Os termos para indexação devem estar descritos na forma maiúscula e minúscula, serem expressões que identifiquem o conteúdo do artigo, ser indicadas entre 3 e 5; e); ABSTRACT, incluindo, em seguida, INDEX TERMS; f) TEXTO [sem subdivisão, porém com introdução, material e métodos, resultados e discussão e conclusão subtendidos (podendo conter tabelas ou figuras)] e g) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

6. AGRADECIMENTOS: ao fim do texto e, antes das Referências Bibliográficas, poderão vir os agradecimentos a pessoas ou instituições. O estilo, também aqui, deve ser sóbrio e claro, indicando as razões pelas quais se fazem os agradecimentos. 7. TABELAS E QUADROS: deverão ser inseridos após citação dos mesmos dentro do próprio texto. 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: as referências bibliográficas devem ser citadas conforme a NBR6023/2002 da ABNT. A exatidão das referências constantes da listagem e a correta citação no texto são de responsabilidade do(s) autor(es) do artigo. Orientações gerais: - Deve-se apresentar todos os autores do documento científico (fonte); - O nome do periódico deve ser descrito por extenso, não deve ser abreviado; - Em todas as referências deve-se apresentar o local de publicação (cidade), a ser descrito no lugar adequado para cada tipo de documento; - As referências devem ser ordenadas alfabeticamente.

DISSERTAÇÃO E TESE: GONÇALVES, R. A. Preservação da qualidade tecnológica de trigo (Triticum aestivum L.) e controle de Rhyzopertha dominica (F.) durante o armazenamento em atmosfera controlada com Co2 e N2. 1997. 52 f. Dissertação (Mestrado em Ciência dos Alimentos) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, 1997. MATIOLI, G. P. Influência do leite proveniente de vacas mastíticas no rendimento de queijo frescal. 2000. 55 p. Dissertação (Mestrado em Ciências dos Alimentos) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, 2000. Nota: “A folha é composta de duas páginas: anverso e verso. Alguns trabalhos, como teses e dissertações são impressos apenas no anverso e, neste caso, indica-se f.” (ABNT, NBR6023/2002, p. 18). TRABALHOS DE CONGRESSO E OUTROS EVENTOS: SILVA, J. N. M. Possibilidades de produção sustentada de madeira em floresta densa de terra firme da Amazônia brasileira. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, 6., 1990, Campos do Jordão. Anais... Campos do Jordão: SBS/SBEF, 1990. p. 39-45. DOCUMENTOS ELETRÔNICOS:

EXEMPLIFICAÇÃO (TIPOS MAIS COMUNS): ARTIGO DE PERIÓDICO: VIEIRA, R. F.; RESENDE, M. A. V. de. Épocas de plantio de ervilha em Patos de Minas, Uberaba e Janaúba, Minas Gerais. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 1, p. 74-80, jan./ mar. 2000. LIVRO: a) Livro no todo: STEEL, R. G. D.; TORRIE, J. H. Principles and procedures of statistics. New York: McGraw-Hill Book, l960. 481 p.

As obras consultadas online são referenciadas conforme normas específicas para cada tipo de documento (monografia no todo e em parte, trabalho apresentado em evento, artigo de periódico, artigo de jornal, etc.), acrescidas de informações sobre o endereço eletrônico apresentado entre braquetes (< >), precedido da expressão “Disponível em:” e da data de acesso ao documento, precedida da expressão “Acesso em:”. Nota: “Não se recomenda referenciar material eletrônico de curta duração nas redes” (ABNT, NBR6023/2000, p. 4). Segundo padrões internacionais, a divisão de endereço eletrônico, no fim da linha, deve ocorrer sempre após barra (/). Monografia (acesso online):

b) Parte de livro com autoria específica: FLEURY, J. A. Análise ao nível de empresa dos impactos da automação sobre a organização da produção de trabalho. In: SOARES, R. M. S. M. Gestão da empresa. Brasília: IPEA/ IPLAN, 1980. p. 149-159.

a) Livro no todo TAKAHASHI, T. (Coord.). Tecnologia em foco. Brasília: Socinfo/MCT, 2000. 90 p. Disponível em: . Acesso em: 22 ago. 2000. b) parte de livro

c) Parte de livro sem autoria específica: MARTIM, L. C. T. Nutrição de bovino de corte em confinamento. In: ______. Confinamento de bovino de corte. 2. ed. São Paulo: Nobel, 1986. cap. 3, p. 29-89.

TAKAHASHI, T. Mercado, trabalho e oportunidades. In: ______. Sociedade da informação no Brasil: livro verde. Brasília: Socinfo/MCT, 2000. cap. 2, p. 13-24. Disponível em: . Acesso em: 22 ago. 2000.

c) Parte de congresso, seminário, etc. GIESBRECHT, H. O. Avaliação de desempenho de institutos de pesquisa tecnológica: a experiência de projeto excelência na pesquisa tecnológica. In: CONGRESSO ABIPTI, 2000, Fortaleza. Gestão de institutos de pesquisa tecnológica. Fortaleza: Nutec, 2000. Disponível em: . Acesso em: 01 dez. 2000. d) Tese SILVA, E. M. Arbitrariedade do signo: a língua brasileira de sinais (LIBRAS). 1997. 144 p. Dissertação (Mestrado em Lingüística Aplicada e Estudo de Língua) - Pontifícia Universidade Católica de São Paulo, São Paulo, 1997. Disponível em: . Acesso em: 28 nov. 2000. Artigo de periódico (acesso online): RESENDE, A. M. G. Hipertexto: tramas e trilhas de um conceito contemporâneo. Informação e Sociedade, Recife, v. 10, n. 1, 2000. Seção Educação. Disponível em: . Acesso em: 30 nov. 2000. CITAÇÃO: PELO SISTEMA ALFABÉTICO (AUTOR-DATA) (conforme ABNT, NBR10520/2002) Dois autores - Steel & Torrie (1960) ou (STEEL & TORRIE, 1960). Três ou mais autores - Valle et al. (l945) ou (VALLE et al., 1945). Obs.: Quando forem citados dois autores de uma mesma obra deve-se separá-los pelo sinal & (comercial). 9. CASO O ARTIGO CONTENHA FOTOGRAFIAS, GRÁFICOS, FIGURAS, SÍMBOLOS E FÓRMULAS, ESSAS DEVERÃO OBEDECER ÀS SEGUINTES NORMAS: 9.1. Fotografias deverão ser apresentadas em preto e branco, nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi.

9.2. Figuras deverão ser apresentadas em preto e branco, nítidas e com contraste, inseridas no texto após a citação das mesmas e também em um arquivo à parte, salvas em extensão “TIFF” ou “JPEG” com resolução de 300 dpi. As figuras deverão ser elaboradas com letra Times New Roman, tamanho 10, sem negrito; sem caixa de textos e agrupadas. 9.3. Gráficos deverão ser inseridos após citação dos mesmos, dentro do próprio texto, elaborado preferencialmente em Excel, com letra Times New Roman, tamanho 10, sem negrito. 9.4. Símbolos e Fórmulas Químicas deverão ser feitas em processador que possibilite a formatação para o programa Page Maker (ex: MathType, Equation), sem perda de suas formas originais. 10. O Editor Chefe notificará o autor do recebimento do original e, posteriormente, o informará sobre sua publicação. Os artigos que necessitarem de modificações serão devolvidos ao autor para a devida revisão. 11. Os artigos não aprovados serão devolvidos. 12. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação. 13. O não-cumprimento dessas normas implicará na devolução do artigo ao autor. 14. Os casos omissos serão resolvidos pela Comissão Editorial 15. O artigo deverá ser enviado para: ABCTP Plant Cell Culture & Micropropagation Universidade Federal de Lavras Departamento de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal Caixa Postal: 3037 Lavras – MG CEP 37200-000 E-mail: [email protected]

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS 1. Concepts and affirmations included in articles and communications are of the entire responsibility of the authors. 2. “Plant Cell Culture & Micropropagation”, a semestral journal edited by Editora UFLA of the Universidade Federal de Lavras, publishes scientific articles and communications in the area of plant tissue culture, elaborated by researchers of the national and international scientific community. There are no page charges for publication. Submission of a manuscript implies that it is neither under consideration for publication elsewhere nor has appeared previously in part or in whole. On acceptance for publication, authors assign to the Editors full copyright of the manuscript in all languages and countries. Publications will depend on editorial rules and on the review of experts and ad hoc commission. Reviewer and editorial opinions will be anonymously communicated to authors. 3. The articles and communication submitted for publication must be presented in CD, using the program Microsoft Word for Windows (version 98, 2000, XP or 2003), written in Portuguese, English or Spanish, using only conventional nomenclature. At the time of submission, authors are required to submit together with the CD, 4 (four) hard copies, one original and three copies without the name(s) of the author(s) as well as the footnote on the first page (to be used by the reviewers), printed on A4 white paper (21 cm x 29.7cm) or on continuous form, typewritten only on one side, double spaced using font Times New Roman, size 12, with a 3 cm margin on the left hand side and 2.0 cm margin on the right hand side, 2.5 cm upper and lower margin, 2.5 cm for the heading and 2.,5 cm for the footnote. The manuscript must present a maximum of 14 pages. At the time of submission, a cover letter must be sent with the manuscript copies to the Editor requesting publication of the article. This cover letter must be signed by all authors and also contain the full address, telephone number and e-mail of the authors. Any inclusion, exclusion or alteration in the authors order must be notified and signed by all authors including the one excluded. 4. Each manuscript must be organized in: a) TITLE sufficiently clear; conspicuous and complete, without superfluous words. It is recommended to initiate with the term that represent the most important aspect, with other terms in decreasing of importance; b) TITLE in Portuguese; c) FULL NAME(s) OF THE AUTHOR(s), maximum of 6 (six), in capital letters, one after the other in the center of the page, with the footnote of the first page containing their professional qualification or academic training

and their work institution. d) ABSTRACT written continuously without paragraph. It must not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after the abstract using terms different from those used in the title and separated by comma. The index terms (3 to 5) must be described in capital and small letters, and express the content of the article; e) ABSTRACT and INDEX TERMS in Portuguese; f) INTRODUCTION (including literature review); g) MATERIAL AND METHODS; h) RESULTS AND DISCUSSION (it may include tables and figures); i) CONCLUSIONS and j) REFERENCES. 5. Communication must have the following topics: a) TITLE, sufficiently clear, conspicuous and complete, without superfluous words. It is recommended to initiate with the term that represent the most important aspect, with other terms in decreasing of importance; The PORTUGUESE version of the title has to be presented; b) TITLE in Portuguese; c) FULL NAME(s) OF THE AUTHOR(s), maximum of 6 (six), in capital letters, one after the other in the center of the page with the footnote of the first page containing their professional qualification or academic training and their work institution; d) ABSTRACT written continuously without paragraph. It must not exceed 250 words. Index terms must be enclosed after the abstract using terms different from those used in the title and separated by comma. The index terms (3 to 5) must be described in capital and small letters, and express the content of the article; e) ABSTRACT and INDEX TERMS in Portuguese, f) TEXT (with no division but must include introduction, material and methods, results and discussion and conclusion (it may include tables and figures) and g)REFERENCES. 6. ACKNOWLEDGEMENTS: Acknowledgements to people or institutions might be included at the end of the text prior References. The written style must be serious and clear, indicating the reasons of the acknowledgements made. 7. TABLES AND FIGURES: must be included right after their citation in the text. 8. REFERENCES: references must be cited according to NBR6023/2002 of ABNT. All references and their correct citation in the text are of the entire responsibility of the author(s). - Some important orientations: all authors of the scientific document must be presented (source); the journal must be cited using its full name; all references must present the name of the city where the journal was published; all references must be cited alphabetically.

9. PHOTOGRAPHS, GRAPHS, FIGURES, SYMBOLS OR FORMULA CONTAINED IN THE ARTICLE SHOULD OBEY THE FOLLOWING RULES: 9.1. Photographs must be presented in black and white, clear and with contrast, inserted in the text after their citation and also in a separate file (on the same diskette as the article) saved in extension “TIFF” or “JPEG” with resolution of 300 dpi. 9.2. Figures must be presented in black and white, clear and with contrast, inserted in the text after their citation and also in a separate file (on the same diskette as the article) saved in extension “TIFF” or “JPEG” with resolution of 300 dpi. They must be elaborated using Times New Roman font, size 10, without bold, without text box and arranged. 9.3. Graphs must be inserted in the text after their citation, elaborated preferentially in Excel, using Times New Roman font, size 10, without bold. 9.4. Symbols and Chemical Formula must be presented using a word processor that permits a format for Page Maker (ex: MathType, Equation) without loss of its original form.

10. The Brazilian Association of Plant Tissue Culture (ABCTP) will inform the author the receipt of the original manuscript and eventually it will also send information regarding its publication. Manuscripts that require modifications will be returned to the author for the respective revision andcorrections. 11. Manuscripts not approved will be returned to the author. 12. Articles will be published according to the order of receipt and approval. 13. If any of these rules are not attended the manuscript will be returned to the author. 14. Manuscripts should be sent to the following address: ABCTP Plant Cell Culture & Micropropagation Universidade Federal de Lavras Departamento de Biologia - Setor de Fisiologia Vegetal Caixa Postal: 3037 Lavras – MG CEP 37200-000

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