Idea Transcript
TEZĂ DE DOCTORAT
Studiul electroanalitic al unor β-blocante şi anestezice locale cu electrozi modificaţi cu calixarene Doctorand Gabriela Duţu Conducător știinţific Robert Săndulescu
1
Cuprins ABREVIERI ................................................................................................................................................. 13 INTRODUCERE ........................................................................................................................................... 15 1
Senzori electrochimici ....................................................................................................................... 19 1.1 Senzori potenţiometrici ........................................................................................................................ 20 1.1.1 Electrozi ioni-selectivi .................................................................................................................. 20 1.1.2 Biosenzori potenţiometrici .......................................................................................................... 21 1.2 Senzori voltamperometrici ................................................................................................................... 23 1.2.1. Senzori amperometrici pentru gaze ............................................................................................... 24 1.2.2. Biosenzori amperometrici .............................................................................................................. 25 1.3 Senzori electrochimici modificaţi cu calixarene ................................................................................... 33 1.4 Electrozi planari imprimaţi prin serigrafie (SPE) ................................................................................. 36
2
Metode electrochimice ..................................................................................................................... 39
3
Substanţe farmaceutice investigate .................................................................................................. 45 3.1 Compuşi din seria β-blocantelor .......................................................................................................... 45 3.1.1 Structură chimică ......................................................................................................................... 45 3.1.2 Farmacologie şi indicaţii............................................................................................................... 46 3.1.3 Farmacotoxicologie şi contraindicaţii .......................................................................................... 46 3.1.4 Posologie, forme farmaceutice .................................................................................................... 47 3.1.5 Metode analitice de identificare şi dozare .................................................................................. 47 3.2 Compuşi din seria anestezicelor locale ................................................................................................ 48 3.2.1 Structuri chimice .......................................................................................................................... 48 3.2.2 Farmacologie şi indicaţii............................................................................................................... 48 3.2.3 Farmacotoxicologie şi contraindicaţii .......................................................................................... 49 3.2.4 Posologie şi forme farmaceutice ................................................................................................. 49 3.2.5 Metode analitice de identificare şi dozare .................................................................................. 50
4
Ipoteza de lucru şi obiective ............................................................................................................. 55
5
Metodologia generală....................................................................................................................... 57 5.1 Electrozii............................................................................................................................................... 57 5.2 Calixarenele ......................................................................................................................................... 58 5.3 Alţi reactivi utilizaţi .............................................................................................................................. 61 5.4 Metodele electrochimice utilizate ........................................................................................................ 61
6 Studiul potenţiometric al interacţiunilor medicament - receptor cu electrozi membrană PVC modificaţi cu calixarene ....................................................................................................................................... 63
2
6.1 Introducere .......................................................................................................................................... 63 6.2 Material şi metode ............................................................................................................................... 63 6.3 Obţinerea electrozilor cu membrană PVC modificată cu calixarene .................................................... 64 6.4 Rezultate şi discuţii .............................................................................................................................. 66 6.4.1 Rezultatele obţinute cu membrane cu 1% calixarenă ................................................................ 66 6.4.2 Rezultatele obţinute cu membrane cu 2% calixarenă ................................................................. 67 6.4.3 Rezultatele obţinute cu membrane cu 5% calixarenă ................................................................. 67 6.5 Concluzii ............................................................................................................................................... 70 7 Studiul comportamentulului electrochimic al unor β-blocante şi anestezice locale cu ajutorul voltametriei ciclice............................................................................................................................................... 71 7.1 Influenţa pH-ului şi a materialului electrodic ....................................................................................... 71 7.1.1 Introducere .................................................................................................................................. 71 7.1.2 Material şi metode ....................................................................................................................... 71 7.1.3 Rezultate şi discuţii ...................................................................................................................... 72 7.1.4 Concluzii ....................................................................................................................................... 76 8 Comportamentul electrochimic al β-blocantelor şi anestezicelor locale cu electrozi imprimaţi serigrafic modificaţi cu calixarene........................................................................................................................ 77 8.1 Introducere .......................................................................................................................................... 77 8.2 Material şi metode ............................................................................................................................... 77 8.3 Obţinerea electrozilor planari imprimaţi, modificaţi cu calixarene .................................................... 78 8.4 Obţinerea electrozilor planari imprimaţi de grafit DRP 110 modificaţi cu nanoparticule din aur ....... 78 8.5 Rezultate şi discuţii .............................................................................................................................. 79 8.5.1 Comportamentul electrochimic pe SPE de aur modificaţi cu calixarene ..................................... 79 8.5.2 Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportamentului electrochimic al metoprololului, propranololului si procainei pe SPE de aur .......................................................................................................... 83 8.5.3 Comportamentul electrochimic pe SPE cu nanoparticule din aur modificaţi cu calixarene ........ 84 8.5.4 Comportamentul electrochimic pe SPE cu nanotuburi de carbon modificaţi cu calixarene ....... 89 8.5.5 Comportamentul electrochimic pe SPE cu grafene modificaţi cu calixarene .............................. 90 8.6 Concluzii ............................................................................................................................................... 90 9 Elaborarea unor metode electrochimice de determinare cantitativă a clorhidratului de procaină din forme farmaceutice ............................................................................................................................................. 93 9.1 Introducere .......................................................................................................................................... 93 9.2 Material şi metode ............................................................................................................................... 93 9.3 Curbele de calibrare pentru clorhidratul de procaină pe electrozi de carbon vitros ............................ 95 9.4 Curbele de calibrare pentru clorhidratul procaină pe electrozi planari imprimaţi cu grafit tip C110 .. 96
3
9.5 Curbele de calibrare pentru clorhidratul procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu pe electrozi de carbon vitros ............................................................................................................................................................ 97 9.6 Curbele de calibrare pentru clorhidratul procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu pe electrozi planari imprimaţi cu grafit tip C110 ........................................................................................................................ 99 9.7 Curbele de calibrare pentru clorhidratul de procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu pe electrozi planari imprimaţi cu grafit de tip DRP C110 modificaţi cu calixarena C4Es2 .......................................................... 100 9.8 Influenţa tipului de electrod asupra comportamentului voltametric al clorhidratului de procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu ........................................................................................................................ 103 9.9 Studii de interferenţă ......................................................................................................................... 105 9.10 Concluzii ............................................................................................................................................. 107 ®
10 Aplicaţiile metodelor electrochimice propuse la dozarea clorhidratului de procaină din Gerovital soluţie injectabilă .............................................................................................................................................. 109 10.1 Determinarea clorhidratului de procaină prin voltametrie puls diferenţială şi voltametrie cu undă pătrată cu electrozi de carbon vitros şi electrozi imprimaţi de grafit modificaţi cu p-terţbutil-diester-calix[4]arenă ...........................................................................................................................................................109 ®
10.2 Determinarea gradului de recuperare al clorhidratului de procaină din Gerovital fiole cu metoda de dozare prevăzută în Farmacopeea Română .......................................................................................................... 113 10.3 Concluzii .............................................................................................................................................. 114 11
Concluzii generale ........................................................................................................................... 115
Cuvinte cheie: electrozi planar imprimaţi, calixarene, metoprolol, propranolol, atenolol, benzocaina, procaina, DPV, SWV
4
INTRODUCERE Mimarea proceselor naturale de recunoaştere a moleculelor este una din marile provocări ale cercetării chimice supramoleculare. Senzorii electrochimici, care utilizează receptori artificiali, dar şi cei care folosesc sisteme biologice (biosenzorii) încearcă să reproducă o structură tridimensională a receptorului, astfel încât să producă interacţiuni specifice cu analitul. Teza de doctorat îşi propune obţinerea unor noi senzori electrochimici modificaţi cu calix[4]arene, calix[6]arene şi calix[8]arene, substituite cu diferite grupări funcţionale, care să permită elaborarea unor noi metode electroanalitice de dozare pentru medicamente din clasa β-blocantelor (metoprolol, propranolol, atenolol) şi anestezicelor locale (procaina şi benzocaina). Un alt obiectiv ambiţios îl constituie studiul interacţiunilor medicament-receptor cu ajutorul metodelor electrochimice şi a noilor senzori, care „mimează” un receptor artificial, specific pentru un anumit medicament.
STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII Calixarenele se numără printre macrociclurile foarte utilizate în ultimul timp ca receptori artificiali. Acestea sunt produşi de hidroxialchilare dintre fenoli şi aldehide, având o structură tridimensională în forma unui trunchi de con ce le permite să formeze incluziuni complexe cu numeroase specii chimice. Selectivitatea calixarenelor depinde de natura grupărilor funcţionale polare sau nepolare şi de mărimea cavităţii interne. Datorită potenţialului ştiinţific al calixarenelor s-au utilizat foarte mult în ultimii ani pentru creerea unor senzori electrochimici. Recunoaşterea selectivă a unor cationi este fără îndoială cea mai dezvoltată aplicaţie a calixarenelor, dar recent s-au elaborat senzori cu calixarene şi pentru substanţe organice. Moleculele alese pentru realizarea cercetărilor experimentale au fost: β–blocantele(atenolol, metoprolol şi propranolol) şi anestezicele locale (benzocaina şi procaina). β-blocantele sunt antagonişti ai receptorilor β-adrenergici din terminaţiile nervoase simpatice. Împiedicând stimularea receptorilor de către catecolaminele endogene, aceste medicamente au efect inhibitor asupra proprietăţilor fiziologice ale miocardului, cu scăderea forţei de contracţie, a frecvenţei şi a excitabilităţii. Benzocaina este un anestezic local folosit pentru ameliorarea durerii de la nivelul mucoaselor. Procaina este un anestezic local cu acţiune de scurtă durată, folosit prin injectare pentru reducerea durerii (în nevralgii, mialgii, artralgii), în vederea intervenţiei chirurgicale sau postoperator. Procaina are şi acţiune sistemică: analgezică, vasodilatatoare, antispastică slab şi trofică general.
CONTRIBUłII PERSONALE 1. Materiale şi metode Electrozii utilizaţi au fost diferiţi în funcţie de studiile făcute şi metodele electrochimice utilizate. În studiile potenţiometrice s-au utilizat electrozi de lucru cu membrană din policlorură de vinil, modificată cu diferite calixarene. În cazul studiilor vizând comportamentul electrochimic al β-blocantelor şi anestezicelor locale sub influenţa pH-ului, s-au folosit microelectrozi solizi de aur platină şi carbon vitrs, metoda de lucru fiind voltametria ciclică. Pentru studiile privind interacţiunea β-blocantelor şi anestezicelor cu calixarenele s-au folosit electrozi planari imprimaţi, de provenienţă Dropsens (Spania), de mai multe tipuri DRP-C223AT, DRP-110CNT, DRP110GPH, DRP-110GNP, în funcţie de natura materialului electrodului de lucru: grafit, aur, grafit modificat cu nanotuburi de carbon, grafene sau nanoparticule de aur generate in situ pe electrozi serigrafiaţi de grafit. Metoda de lucru a fost tot voltametria ciclică. 5
Dozarea clorhidratului de procaină din forme farmaceutice s-a făcut atât cu electrodul de carbon vitros cât şi cu SPE modificaţi cu calixarene C4ES2, prin voltametrie cu undă pătrată(SWV) şi voltametrie puls diferenţială(DPV). Calixarenele utilizate în acest studiu au fost în număr de opt: două derivate de calix[4]arena, cinci derivate de calix[6]arena, şi un compus derivat de calix[8]arena. Acestea au fost sintetizate şi caracterizate structural în cadrul Institutului de Chimie din Cluj-Napoca.
p-tert-butil-calix[4]arena
p-tert-butil-calix-[6]arena
2. Studiul potenŃiometric al interacŃiunilor medicament receptor cu electrozi membrană PVC modificaŃi cu calixarene Determinările potenţiometrice s-au făcut măsurându-se diferenţa de potenţial la interfaţa electrod soluţie de analit, la curent zero, cu ajutorul electrozilor cu membrana PVC modificaţi cu fiecare calixarenă în parte, în concentraţii de 1%, 2%, 5%. Pe lângă calixarene în membrana PVC s-au mai adăugat diferite substanţe cu scopul de a favoriza legarea receptorului de analit. Aceşti ioni excluder au fost acidul dodecatungstosilicic (SITA) SiO2·12WO3 ·26H2O, reineckatul de amoniu NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]·H2O, tetrafenilboratul de potasiu (TFBK) şi tetrafenilboratul de sodiu (TFBNa). Pentru a mări suprafaţa de contact a electrodului cu analitul s-a adăugat în membrană şi nanotuburi de carbon de tip aII şi aIII. Iniţial s-a determinat diferenţa de potenţial doar într-o celulă electrochimică, care conţinea 20 ml electrolit KCl 0,001M, iar apoi s-au adăugat treptat substanţă medicamentoasă 10-3 M pentru a obţine în celula electrochimică concentraţii de analit cuprinse între 10-6M şi 10-4M. S-a înregistrat, după fiecare adăugare de analit, diferenţa de potenţial. Rezultatele determinărilor potenţiometrice au arătat că deşi s-au făcut numeroase modificări şi optimizări ale membranei PVC pentru a obţine un senzor potenţiometric de tip receptor artificial şi în ciuda evidentelor interacţiuni medicament-receptor şi a rezultatelor interesante obţinute cu ajutorul metodelor electrochimice, nu s-a înregistrat în nici un caz, un salt semnificativ de potenţial, senzorii dovedindu-se neselectivi. Totuşi s-a observat că prezenţa unui ion excluder de tip SITA şi a concentraţiei calixarenei de 5% este favorabilă pentru obţinerea unei pante mai apropiată de valoarea 0,059, în cazul procainei şi metoprololului. Din punct de vedere al linearităţii, cea mai bună dreaptă de calibrare s-a obţinut tot folosind ca ion excluder SITA, calixarena în concentraţie de 5% pentru metoprolol. Folosirea calixarenei de tip C6Es2 s-a dovedit a fi cea mai favorabilă interacţiunii medicamentului cu receptorul.
3. Studiul comportamentulului electrochimic al unor βblocante şi anestezice locale cu ajutorul voltametriei ciclice Scop acestui studiu a fost determinarea intervalului optim de reducere şi oxidare a substanţelor medicamentoase, a tipului de electrozi cu sensibilitatea cea mai bună şi a pH-ului optim. Metoda de lucru a fost voltametrie ciclică , iar microelectrozi utilizati au fost cel de carbon vitros, aur, platină. Celula electrochimică conţine 10ml soluţie analit 10-2M în NaH2PO4 0,1M la care se adaugă succesiv NaOH 0,1M pentru a obţine pH-ul dorit. Dupa fiecare adaugare se inregistreaza pH si voltamograma. 6
Comportamentul redox al atenololului la diferite valori de pH a dus la obtinerea unor voltamograme cu un pic de reducere mai evident la pH 8,59, pe electrodul de aur. Probabil, reacţia care are loc la suprafaţa electrodului vizează gruparea cetonică, care se reduce la alcool. Metoprololul se comportă diferit la pH acid sau bazic, pe electrodul de aur. Astfel la un pH acid are loc un proces de oxidare ireversibil. Pe măsură ce pH-ul creşte procesul tinde să devină reversibil. Reacţiile care au loc pe electrodul de aur implică gruparea hidroxilică care se oxidează la cetonă. Comportamentul electrochimic al propranololului este în general puţin influenţat de pH, pe electrozii de aur si carbon vitros. Pe electrodul de platină se observă un proces de oxidare, însă pe măsură ce pH-ul creşte curba de oxidare scade. Reacţia este similară cu cea pentru metoprolol când aceeaşi grupare hidroxilică se oxideaza la cetonă. Procesele redox ale benzocainei sunt evidenţiate pe electrodul de platină la un pH bazic. Acest comportament se poate explica prin prezenţa în structura benzocainei a aminei aromatice primare, care se oxidează la nitro-derivat. Procaina clorhidrat, pe electrodul de Au, a înregistrat o voltamogramă cu un proces cvasireversibil la pH slab acid, tot datorat prezenţei aminei aromatice primare în structura procainei. Concluzia acestui studiu a fost că evidenţierea proceselor redox pentru substanţele medicamentoase studiate se face pe electrodul de aur, la un pH neutru.
4. Comportamentul electrochimic al β-blocantelor anestezicelor locale cu SPE modificaŃi cu calixarene
şi
Interacţiunea substanţelor medicamentoase cu calixarenele s-a realizat şi pe electrozii planar imprimaţii din aur şi grafit, observându-se cu ajutorul voltametrie ciclice. S-a lucrat în picatură, depunânduse pe suprafaţa electrodului 50 µl soluţie de analit 0,001M. Metoprololul, propranololul şi procaina au pe electrodul imprimat de aur nemodificat un comportament redox cvasireversibil, similar cu cel înregistrat pe microelectrodul din aur. Dacă suprafaţa electrodului este modificată cu calix[4]arene sau calix[6]arene intensitatea curentului scade pe măsură ce creşte numărul de grupări funcţionale ester grefate de calixarenă. În cazul electrodului de carbon cu nanoparticule de aur nemodificat cu calixarene se observă apariţia unui pic de oxidare la 0,86 V şi un pic de reducere la 0,40 V vs. Ag/AgCl, în cazul metoprololului. Pentru clorhidratului de procaină, se observă un pic specific de oxidare la 0,64 V vs. Ag/AgCl. Dacă se aduc modificări suprafeţei electrodului cu calixarene de tip C4 sau C6, atunci intensitatea curentului scade foarte mult, probabil datorită interacţiunii calixarenei cu substanţa medicamentoasă, care nu mai ajunge la suprafaţa electrodului pentru a se oxida sau reduce. (fig.1) A
B
Figura 1: Comportamentul electrochimic al metoprololului (A) si procainei (B) pe electrozii SPE cu nanoparticule de aur
7
Nanotuburile de carbon şi grafenele, utilizate în structura senzorilor au capacitatea de a crește semnificativ suprafaţa de contact. Totuși s-a dovedit că substanţele medicamentoase studiate nu prezintă pe acești electrozi o activitate electrochimică comparabilă cu cea obţinută pe SPE cu nanoparticule de aur. Concluziile acestor studii au relevat urmatoarele aspecte : Depunerea calixarenelor pe suprafaţa electrodului determina scăderea intensitatii curentului de pic datorită interacţiunii acesteia cu substanţa medicamentoasă; Metoprololul succinat şi clorhidratul de procaină prezintă răspuns electrochimic caracteristic pe electrozii de aur şi pe cei de grafit cu nanoparticule de aur, ceea ce a permis în continuare elaborarea unor metode electrochimice pentru dozarea clorhiodratului de procaină din forme farmaceutice.
5. Elaborarea unor metode electrochimice de determinare cantitativă a clorhidratului de procaină din forme farmaceutice În primul rând a fost necesară trasarea unei drepte de calibrare pentru clorhidratul de procaină, care să evidenţieze creşterea proporţională a intensităţii curentului de pic cu concentraţia analitului. Metode de lucru au fost voltametria cu undă pătrată(SWN) şi voltametria puls diferenţială(DPV), iar electrozi utilizaţii: carbon vitros, DRP C110, DRP C110 modificat cu C4Es2 .Celula electrochimică conţine soluţii de clorhidrat de procaină de concentraţii cuprinse între 10-6M şi 10-3M, la care s-a adăugat metabisulfit în acelaşi raport 20:1 ca în soluţia injectabilă de Gerovital ®, forma farmaceutică din care s-a determinat ulterior procaina. Electrodul de lucru folosit iniţial a fost cel de carbon vitros. Prin voltametria cu undă pătrată şi voltametria puls diferenţială s-au obţinut voltamograme în care clorhidratul de procaină prezintă un pic de oxidare la aproximativ 1,035 V respectiv 0,977 V vs. Ag/AgCl. Intensitatea curentului creşte proporţional cu concentraţia, având un maxim corespunzător soluţiei de 10-3 M clorhidrat de procaină. Dacă electrodul de carbon vitros este înlocuit cu un electrod planar imprimat de grafit, potenţialul picului de oxidare al clorhidratului de procaină îşi păstrează aproximativ aceeaşi valoarea, prin ambele metode. Daca electrodul planar imprimat de tip DRP C110 de grafit este modificat cu calixarena C4Es2, voltamogramele trasate pentru clorhidratul de procaină prezintă un singur pic de oxidare. Intensitatea curentului de pic creşte proporţional cu concentraţia, dar valorile sunt mai mici comparativ cu cele obţinute pe celelalte materiale electrodice utilizate (fig.2). Acest fapt se datorează probabil prezenţei calixarenei, care prin formarea unor legături de hidrogen cu procaina, blochează procesul de oxidare al acesteia.
Figura 2: Voltamogramele cu undă patrată (A) şi puls diferenţiale (B) pentru diferite concentraţii de clorhidrat de procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu în NaCl 0,1 M pe electrod planar imprimat cu grafit modificat cu calixarena C4Es2 (DRP C110+C4E2)
Datele obţinute din curbele de calibrare trasate pentru voltametria cu undă pătrată pe toate tipurile de electrozi considerate sunt prezentate în tabelul urmator.
8
I =a+b·C p
Analit
2
Electrod
R a±S
b±S
a
Procaină HCl + metabisulfit de sodiu
LOD
LOQ
(µM)
(µM)
b
CV
0,281±0,006
0,013±0,002
0,998
1,4
4,6
SPE C110
0,084±0,005
0,037±0,005
0,998
0,4
1,3
SPE C110 + CE
0,192±0,007
0,019±0,002
0,999
1,1
3,7
4 2
Tabelul 1: Ecuatiile dreptelor de calibrare obtinute pentru clorhidratul de procaina prin voltametrie cu unda pătrată
Toate dreptele de calibrare trasate prezintă o linearitate foarte bună, iar dreapta cu coeficientul de corelare cel mai bun s-a obţinut pe electrodul planar imprimat de tip DRP C110 cu grafit modificat cu calixarena C4Es2 (R2 = 0,999), pentru clorhidratul de procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu. Se observă că linearitatea dreptei de calibrare este mai bună la concentraţii mai mici, între 10-6 M şi 10-4 M, domeniul de linearitate fiind cuprins, în general, între 1 şi1000 µM. În ceea ce priveşte limita de detecţie şi limita de cuantificare, acestea au valori mai mici tot pe electrodul planar imprimat, dar nemodificat cu calixarenă. Rezultatele obţinute prin voltametrie puls diferenţială sunt sintetizate în tabelul urmator. Tabelul 2: Ecuatiile dreptelor de calibrare obtinute pentru clorhidratul de procaina prin voltametrie puls diferenţială
I =a+b·C p
Analit
2
Electrod
LOQ
(µM)
(µM)
R a±S
b±S
CV
0,191±0,008
0,016±0,002
0,998
1,6
5,3
SPE C110
0,327±0,008
0,029±0,003
0,999
0,9
3
0,053±0,009
0,024±0,004
0,997
1,175
3,75
a
Procaină HCl + metabisulfit de sodiu
LOD
SPE C110 + C E
4 2
b
Linearitatea dreptelor este foarte bună pentru toate tipurile de electrozi luate în studiu, cu interval larg de concentraţii (1-750 µM). Cele mai bune rezultate s-au obţinut pentru electrodul planar imprimat de tip DRP C110 cu grafit, pentru soluţiile de clorhidrat de procaină în prezenţa metabisulfitului de sodiu, atât în ceea ce priveşte linearitatea cât şi limitele de detecţie şi cuantificare.
5.1. InfluenŃa tipului de electrod voltamperometric al clorhidratului de procaină
asupra
comportamentului
În ceea ce priveşte influenţa diferitelor materiale electrodice, figurile urmatoare prezintă voltamogramele obţinute cu ajutorul DPV pentru soluţii de clorhidrat de procaină 5·10-5 M în NaCl 0,1 M. Se observa ca intensitatea picului este mai mare în cazul utilizării electrozilor DRP110 nemodificaţi faţă de cei modificaţi cu calixarenă sau cei de carbon vitros. 9
Figura 3: Influenţa tipului de electrod asupra comportamentului electrochimic al procainei prin metoda voltametriei puls diferenţiale
Dacă se face o comparaţie a răspunsul electrochimic obţinut pe electrodul planar imprimat cu grafit modificat cu nanoparticule de aur şi cu calixarena C4Es2, atunci se observă că intensitatea curentului de pic este mai mare în cazul acestui electrod comparativ cu electrodul planar imprimat cu grafit nemodificat. Explicaţia constă în faptul că nanoparticulele de aur potenţează reacţiile de oxidare care au loc pe suprafaţa electrodului. Cu toate acestea, acest tip de electrozi nu prezintă un semnal electrochimic reproductibil, motiv pentru care nu au putut fi utilizaţi pentru determinarea clorhidratului de procaină cu ajutorul metodelor electrochimice considerate. Cauza nereproductibilităţii se poate găsi în tehnologia de obţinere a electrozilor. Cu această metodă nu există siguranţa acoperirii uniforme şi regulate a suprafeţei electrodice cu nanoparticule de aur.
5.2. Studii de interferenŃă Produsului farmaceutic Gerovital®, conţine pe lângă clorhidratul de procaină şi substanţele adjuvante: metabisulfit de potasiu şi acid benzoic. Din această cauză trebuie realizat un studiu de interferenţă a clorhidratului de procaină cu aceste substanţe adjuvante din punct de vedere electrochimic. În acest sens trebuie să se stabilească în ce măsură semnalul electrochimic al clorhidratului de procaină pe cei trei electrozi luaţi în studiu este influenţat de prezenţa acestor substanţe adjuvante. S-au înregistrat voltamograme pe electrozii de carbon vitros, electrozii planari imprimaţi cu grafit nemodificaţi şi pe cei modificaţi cu calixarena C4Es2 (fig.4), prin cele două metode voltamperometrice. A
B
Figura 4: Voltamogramele cu undă patrată (A) şi voltamogramele puls diferenţiale (B) prezentate comparativ pentru soluţii de acid benzoic, procaină·HCl, procaină·HCl în prezenţa metabisulfitului de sodiu, procaină·HCl în prezenţa metabisulfitului de sodiu şi acidului benzoic în NaCl 0,1 M, pe electrod planar imprimat cu grafit modificat cu C4Es2.
Cu toate că electrodul SPE modificat cu calixarena C4Es2 prezintă valori ale intensităţii curentului de pic, inferioare celor obţinute pe electrozii imprimaţi nemodificaţi sau de carbon vitros, s-a constatat că 10
semnalul lor electrochimic este mai puţin influenţat de prezenţa celorlalte componente din soluţie (metabisulfit de sodiu şi acid benzoic). Acest fapt se poate explica prin formarea unei legături medicamentreceptor, specifică pentru procaină şi care face ca semnalul pe acest electrod modificat cu calixarena C4Es2 să fie foarte puţin influenţat de eventualii interferenţi și îl recomandă pentru elaborarea unei metode electroanalitice de dozare a clorhidratului de procaină din forme farmaceutice sau produse cosmetice.
5.3. AplicaŃiile metodelor electrochimice propuse clorhidratului de procaină din Gerovital® soluŃie injectabilă
la
dozarea
Forma farmaceutică disponibilă în comerţ Gerovital® soluţie injectabilă conţine clorhidrat de procaină (100 mg/5 ml). Din aceste fiole s-au făcut diluţii obţinându-se o concentraţie teoretică a procainei de 5·10-5 M. Aceste probe au fost supuse analizei cantitative cu ajutorul metodelor electrochimice SWV şi DPV şi a noilor electrozi. Pentru a dovedi că semnalele electrochimice obţinute au fost corect atribuite componentului activ conţinut în forma farmaceutică analizată, s-au adăugat volume de 25 µl şi respectiv 50µl din soluţie 10-2 M de clorhidrat de procaină în soluţiile obţinute din Gerovital® fiole, iar determinările voltametrice au fost repetate în aceleaşi condiţii experimentale. S-a observat că în cazul tuturor electrozilor analizaţi semnalele cresc la adăugarea soluţiilor test, nu are loc o deplasare semnificativă a potenţialului de pic odată cu concentraţia şi voltamogramele nu prezintă picuri suplimentare. Rezultatele obţinute pentru probele reale sunt prezentate în tabelele urmatoare. ®
Tabelul 3: Dozarea clorhidratului de procaină din Gerovital (soluţie injectabilă) pe diferite tipuri de electrozi, utilizând voltametria cu undă pătrată (SWV)
Electrod
Concentraţie (M) Teoretică
GCE
5,00·10
SPE C110
5,00·10
DPE C110 +C Es 4
2
5,00·10
Recuperare (%)
RSD (%)
-5
104,80
2,61
-5
108,60
2,08
-5
101,05
1,41
experimentală
-5
5,24·10
-5
5,43·10
-5
5,05·10
®
Tabelul 4: Dozarea clorhidratului de procaină din Gerovital (soluţie injectabilă) pe diferite tipuri de electrozi, utilizând voltametria puls diferenţială (DPV)
Electrod
Concentraţie (M) teoretică
GCE
5,00·10
SPE C110
5,00·10
SPE C110 +C Es 4
2
5,00·10
-5
-5
-5
Recuperare (%)
RSD (%)
-5
106,10
2,61
-5
104,60
3,11
-5
106,00
0,49
experimentală 5,37·10 5,23·10 5,30·10
Din ecuaţia dreptei corespunzătoare fiecărei metode şi electrod de lucru în parte s-a calculat concentraţia practică găsită pentru clorhidratul de procaină din fiolele de Gerovital®. Se observă că gradul de recuperare are valori mai mari de 100%, dar apropiate ca valoare pentru fiecare electrod de lucru luat în considerare, ceea ce duce la concluzia că procaina clorhidrat este uşor supradozată în fiolele de Gerovital®. 11
Calculul deviaţiei relative standard a intensităţii curentului de pic prezintă valori mici ale acesteia ceea ce evidentiază exactitatea şi precizia analizelor, cu erori într-o limită acceptabilă. Cele mai bune rezultate s-au înregistrat tot pe electrozii imprimaţi modificaţi cu calixarena C4Es2 prin ambele metode voltamperometrice de analiză, întărind concluzia că se formează o legătură specifică între clorhidratul de procaină şi receptorul reprezentat de calixarenă. ®
5.4. Dozarea clorhidratului de procaină din Gerovital oficinală
fiole prin metoda
Datorită faptului că gradul de recuperare al clorhidratului de procaină determinat electrochimic, pe probe reale din fiolele de Gerovital® au evidenţiat concentraţii uşor mai mari decât cele declarate de producător, s-a trecut la determinarea procainei clorhidrat şi prin metoda oficială utilizată până în prezent de către firma producătoare. Metoda de dozare a clorhidratului de procaină prevăzută în Farmacopeea Română se bazează pe titrarea cu nitrit de sodiu în prezenţa tropeolinei. Datele obţinute cu ajutorul metodei nitritometrice sunt prezentate în tabel. Tabel 5: Dozarea clorhidratului de procaină prin metoda nitritometrică
Analit
Teoretic (g)
Practic (g)
Regăsire (%)
RSD(%)
0,100000
0,106386
106,40
1,28
0,100000
0,100363
100,40
0,86
Clorhidrat de ®
procaină(Gerovital ) Clorhidrat de procaină
Se observă că şi în acest caz gradul de recuperare este peste 100% evidenţiind faptul că substanţa activă, clorhidratul de procaină este uşor supradozat în fiolele de Gerovital®. Concluzii care se pot desprinde din studiile privind dozarea procainei din forme farmaceutice sunt : Gradul de recuperare este apropiat ca valoare în cazul metotei oficinale nitritometrica faţă de metodele electrochimice propuse; Electrozii DRP-C110 şi DRP-C110 modificaţi cu calixarena C4Es2 au fost utilizaţi cu succes la dozarea clorhidratului de procaină din fiolele de Gerovital, obţinându-se o valoare a abaterii concentraţiei substanţei active sub ±5% faţă de cea declarată de producător; SPE modificaţi cu calixarene C4Es2 au dus la obţinere unei dozări mai exacte a clorhidratului de procaină, mai puţin influenţată de substanţele din soluţie.
CONCLUZII GENERALE Teza de doctorat a dus la elaborarea unor noi senzori electrochimici modificati cu calixarene care au permis dozare a clorhidratului de procaina din forme farmaceutice existente pe piata si a studierii interactiunii medicamentului cu receptorul artificial. Acestea prezinta o limita de detectie de ordin micromolecular, sunt mai rapide si prezinta o sensibilitate ridicata. Electrozii planar imprimati utilizati in aceste studii sau dovedit a avea o selectivitate buna, datorita modificarii suprafetei lor cu calixarene. La aceasta se adauga costul redus, posibilitatea de producere în masă cu reproductibilitate ridicată, posibilitatea de a-i utiliza ca senzori de unică folosinţă, ce evită contaminarea. La aceste avantaje se mai adaugă şi cele legate de fabricaţie: flexibilitatea design-ului şi în alegerea 12
materialelor, posibilitatea de automatizare a fabricaţiei, posibilitatea de miniaturizare utilă în sistemele portabile de măsură.
13
DOCTORAL THESIS
The electroanalytical study of various beta-blockers and local anasthetics with electrodes modified with calixarene PhD Student Gabriela Duţu Thesis Coordinator Robert Săndulescu
14
Contents ABBREVIATIONS ........................................................................................................................................ 13 INTRODUCTION ......................................................................................................................................... 15 1
Electrochemical sensors .................................................................................................................... 19 1.1 Potentiometric sensors ........................................................................................................................ 20 1.1.1 Ion-selective electrodes ............................................................................................................... 20 1.1.2 Potentiometric biosensors ........................................................................................................... 21 1.2 Voltamperometric sensors ................................................................................................................... 23 1.2.1. Amperometric gas sensors ............................................................................................................. 24 1.2.2. Amperometric biosensors .............................................................................................................. 25 1.3 Electrochemical sensors modified with calixarene .............................................................................. 33 1.4 Screen printed electrodes (SPE) ........................................................................................................... 36
2
Electrochemical methods.................................................................................................................. 39
3
Investigated pharmaceutical substances .......................................................................................... 45 3.1 Beta-blocker compounds ..................................................................................................................... 45 3.1.1 Chemical structure ....................................................................................................................... 45 3.1.2 Pharmacology and indications ..................................................................................................... 46 3.1.3 Pharmacotoxicology and contraindications................................................................................. 46 3.1.4 Posology and pharmaceutical forms............................................................................................ 47 3.1.5 Analytical methods of identification and dosing ......................................................................... 47 3.2 Local anaesthetics compounds ............................................................................................................ 48 3.2.1 Chemical structures ..................................................................................................................... 48 3.2.2 Pharmacology and indications ..................................................................................................... 48 3.2.3 Pharmatoxicology and contraindications .................................................................................... 49 3.2.4 Posology and pharmaceutical forms ........................................................................................... 49 3.2.5 Analytical methods of identification and dosing ......................................................................... 50
4
Working hypothesis and objectives .................................................................................................. 55
5
General methodology ....................................................................................................................... 57 5.1 Electrodes............................................................................................................................................. 57 5.2 Calixarenes ........................................................................................................................................... 58 5.3 Other reactives used ............................................................................................................................ 61 5.4 Electrochemical methods used ............................................................................................................ 61
6 The potentiometric study of the interactions medicine – receptor with PVC membrane electrodes modified with calixarene ..................................................................................................................................... 63
15
6.1 Introduction ......................................................................................................................................... 63 6.2 Material and methods ......................................................................................................................... 63 6.3 Obtainment of electrodes with PVC membrane modified with calixarene .......................................... 63 6.4 Outcomes and discussions ................................................................................................................... 66 6.4.1 Results obtained with membranes with 1% calixarene ............................................................... 66 6.4.2 Results obtained with membranes with 2% calixarene ............................................................... 67 6.4.3 Results obtained with membranes with 5% calixarene ............................................................... 67 6.5 Conclusions .......................................................................................................................................... 70 7 Study of the electrochemical behaviour of various beta-blockers and local anaesthetics with the help of cyclic voltammetry.......................................................................................................................................... 71 7.1 Influence of the pH and the electrode material ................................................................................... 71 7.1.1 Introduction ................................................................................................................................. 71 7.1.2 Material and methods ................................................................................................................. 71 7.1.3 Outcomes and discussions ........................................................................................................... 72 7.1.4 Conclusions .................................................................................................................................. 76 8 Electrochemical behaviour of beta-blockers and local anaesthetics with screen printed electrodes modified with calixarene ..................................................................................................................................... 77 8.1 Introduction ......................................................................................................................................... 77 8.2 Material and methods ......................................................................................................................... 77 8.3 Obtainment of screen printed electrodes, modified with calixarene ................................................... 78 8.4 Obtainment of screen printed graphite electrodes DRP 110, modified with gold nanopatricles......... 78 8.5 Outcomes and discussions ................................................................................................................... 79 8.5.1 The electrochemical behaviour of gold SPEs modified with calixarene ...................................... 79 8.5.2 The influence of the scanning speed on the electrochemical behaviour of metoprolol, propranolol and procaine on gold SPE ................................................................................................................ 83 8.5.3 The electrochemical behaviour on SPE with nanoparticles of gold modified with calixarene .... 84 8.5.4 The electrochemical behaviour on SPE with carbon nanotubes modified with calixarene ......... 89 8.5.5 The electrochemical behaviour on SPE with graphene modified with calixarene....................... 90 8.6 Conclusions .......................................................................................................................................... 90 9 Developing electrochemical methods to determine the quantity of procaine hydrochloride in pharmaceutical forms .......................................................................................................................................... 93 9.1 Introduction ......................................................................................................................................... 93 9.2 Material and methods ......................................................................................................................... 93 9.3 Calibration curves for procaine hydrochloride on glassy carbon electrodes........................................ 95 9.4 Calibration curves for procaine hydrochloride on screen printed graphite electrodes C110 ............... 96
16
9.5 Calibration curves for procaine hydrochloride in the presence of sodium metabisulphite on glassy carbon electrodes .................................................................................................................................................... 97 9.6 Calibration curves for procaine hydrochloride in the presence of sodium metabisulphite on screen printed graphite electrodes type C110 .................................................................................................................... 99 9.7 Calibrtation curves for procaine hydrochloride in the presence of sodium metabisulphite on screen printed graphite electrodes type DRP C110 modified with calixarene C4Es2 ......................................................... 100 9.8 The influence of the type of electrode on the voltammetric behaviour of procaine hydrochloride in the presence of sodium metabisulphite ................................................................................................................. 103 9.9 Interference testing............................................................................................................................ 105 9.10 Conclusions ........................................................................................................................................ 107 10 Applications of the electrochemical methods put forward for the dosing of procaine hydrochloride in ® Gerovital injectable solution ............................................................................................................................ 109 10.1 Determination of procaine hydrochloride through differential pulse voltammetry and square wave voltammetry with glassy carbon electrodes and screen printed graphite electrodes modified with p-tertbuyildiester-calix[4]arenă .............................................................................................................................................. 109 ®
10.2 Determination of recovery level of procaine hydrochloride in Gerovital phials with the dosing method provided by the Romanian Pharmacopoeia ............................................................................................. 113 10.3 Conclusions ......................................................................................................................................... 114 11
General conclusions ........................................................................................................................ 115
Key-words: screen printed electrodes, calixarene, metoprolol, propranolol, atenolol, benzocaine, procaine, DPV, SWV
17
INTRODUCTION Imitating the natural processes of molecular recognition is one of the great challenges of supramolecular chemical research. Electrochemical sensors, which use artificial receptors, as well as those which use biological systems (biosensors) try to reproduce a three dimensional structure of the receptor, so as to produce specific interactions with the analyte. This doctoral thesis sets out to obtain electrochemical sensors modified with calix[4]arene, calix[6]arene şi calix[8]arene replaced with various functional groups, to allow the development of new electroanalytical dosing methods for beta-blocker drugs (metoprolol, propranolol, atenolol) and local anaesthetics (procaine and benzocaine). Another ambitious objective is to study the interactions between medicine and receptor through electrochemical methods and new sensors that “imitate” an artificial sensor, specific to a certain medicine.
CURRENT STAGE OF KNOWLEDGE Calixarenes are among the macrocycles frequently used lately as artificial receptors. These are hydroxyalkylation products between phenols and aldehydes, with a three dimensional structure shaped like the frustum of a cone, which allows them to form complex inclusions with numerous chemical species. The selectivity of calixarenes depends on the nature of the polar or non-polar functional groups and on the size of the internal cavity. Due to their scientific potential, calixarenes have been used heavily in the past years to create electrochemical sensors. The selective recognition of some cations is undoubtedly the most advanced application of calixarenes, but recently sensors have been developed with calixarene for organic substances as well. The molecules chosen for the experimental research were: beta-blockers (atenolol, metoprolol and propranolol) and local anaesthetics (benzocaine and procaine). Beta-blockers are antagonists of beta-adrenergic receptors found in the sympathetic nerve terminals. Blocking receptor stimulation by endogenous catecholamines, these drugs have an inhibition impact on the physiological properties of the myocardium, reducing the force of contraction, frequency and excitability. Benzocaine is a local anaesthetic used to reduce pain at mucosa level. Procaine is a local anaesthetic with short action, used through injection to reduce pain (in the case of neuralgia, myalgia, arthralgia), in the view of surgery or after surgery. Procaine also has a systemic action: analgesic, vasodilatation, weak anticonvulsant, general trophic.
PERSONAL CONTRIBUTIONS 1. Materials and methods The electrodes used differed depending on the studies carried out and the electrochemical methods used.
18
The potentiometric studies used working electrodes with vinyl polychloride membrane, modified with various calixarenes The studies focusing on the electrochemical behaviour of beta-blockers and local anaesthetics under the influence of pH used solid microelectrodes of gold and platinum and glassy carbon. The method used was cyclic voltammetry. The studies focusing on the interaction between beta-blockers and anaesthetics with calixarene used several types of screen printed electrodes of Dropsens origin (Spain) – DRP-C223AT, DRP-110CNT, DRP110GPH, DRP-110GNP, according to the nature of the working electrode material: graphite, gold, graphite modified with carbon nanotubes, graphenes or gold nanoparticles generated in situ on screen printed graphite electrodes. The working method was cyclic voltammetry. The dosing of procaine hydrochloride present in pharmaceutical forms was done with the glassy carbon electrode as well as with SPEs modified with calixarene C4ES2, through square wave voltammetry (SWV) and differential pulse voltammetry (DPV). Eight calixarenes were used in this study: two derivative of calix[4]arene, five derivative of calix[6]arene, and une compound derivative of calix[8]arene. These were synthesized and structurally characterized at the Chemistry Institute in Cluj-Napoca.
p-tert-butyl-calix-[6]arene
p-tert-butyl-calix[4]arene
2. The potentiometric study of the interactions medicinereceptor with PVC membrane electrodes modified with calixarene The potentiometric determinations were done by measuring the difference of potential on the electrode-analyte solution interface, with zero current, using PVC membrane electrodes modified with each calixarene in part, in concentrations of 1%, 2%, 5%. Besides calixarene in PVC membrane, various other substances were added to foster the attachment of the receptor to the analyte. These excluder ions were dodeca-tungstosilicic acid (SITA) SiO2·12WO3 ·26H2O, ammonium reineckate NH4[Cr(NH3)2(SCN)4]·H2O, potassium tetraphenylborate (TFBK) and sodium tetraphenylborate. In order to increase the contact surface of the electrode with the analyte carbon nanotubes types aII and aIII were added to the membrane. Firts, the difference of potential was determined in only one electrochemical cell, which contained 20ml of electrolyte KCl 0.001M, and then, gradually, drug substance 10-3 M was added to obtain in the elctrochemical cell analyte concentrations bewteen 10-6M and 10-4M. The difference in potential was registered after adding each analyte. The results of the potentiometric determinations showed that although numerous modifications and improvements were brought to the PVC membrane to obtain an artificial receptor sort of potentiometric sensor and in spite of the obvious interactions between medicine and receptor and the interesting results
19
obtained through electrochemical methods, in no case did we notice a significant leap of potential, the sensors proving to be non-selective. Nevertheless, it has been noticed that the presence of a ion excluder type SITA and of a calixarene concentration of 5% are favourable to the obtainment of a slope closer to 0.059 in the case of procaine and metoprolol. In what concerns linearity, the best calibration line was achieved using as a SITA ion excluder calixarene in concentration of 5% for metoprolol. The use of calixarene type C6Es2 proved to be the most favourable to the interaction between medicine and receptor.
3. The study of the electrochemical behaviour of various betablockers and local anaesthetics using cyclic voltammetry The purpose of this study was to determine the optimal reduction and oxidation interval for drug substances, the type of electrodes with the best sensitivity and the optimal pH. The method used was cyclic voltammetry and the microelectrodes used were made of glassy carbon, gold, platinum. The electrochemical cell contains 10ml analyte solution 10-2M in NaH2PO4 0.1M, to which we added successively NaOH 0.1M to obtain the desired pH. After each addition the pH is recorded and the voltammogram drawn up. The redox behaviour of atenolol with different pH levels led to the obtainment of volammograms with a reduction peak more obvious with pH8.59, on the gold electrode. Probably, the reaction that takes place on the surface of the electrode targets the ketonic group, which reduces to alcohol. Metoprolol behaves differently with an acid or basic pH, on the gold electrode. Thus, with an acid pH, there is an irreversible oxidation process. As the pH increases the process tends to become reversible. The reactions that take place on the gold electrode involve the hydroxyl group which oxidises in contact with ketone. The electrochemical behaviour of propranol is generally little influenced by the pH, on the gold and glassy carbon electrodes. On the platinum electrode we can see an oxidation process, but as the pH increases, the oxidation curve decreases. The reaction is similar with the one for metroprolol when the same hydroxyl group oxidises when in contact with ketone. The redox processes of benzocaine are highlighted on the platinum electrode with a basic pH. This behaviour can be explained by the presence in the benzocaine structure of primary aromatic amines, which oxidise in contact with nitro derivative. Procaine hydrochloride, on the Au electrode, registered a voltammogram with a semi-reversible process at weak acid pH, also due to the presence of primary aromatic amines in the procaine structure. The conclusion of this study was that the redox processes for the studied drug substances are brought out on the gold electrode, at a neutral pH.
4. The electrochemical behaviour of beta-blockers and local anaesthetics with SPEs modified with calixarene The interaction of drug substances with calixarenes was also carried out on gold and graphite screen printed electrodes and was monitored with the help of cyclic voltammetry. The work was performed drop by drop, dropping on the surface of the electrode 50µl analyte solution 0.001M. Metoprolol, propranolol and procaine have on the unmodified, gold screen printed electrode a semireversible redox behaviour, similar to that registered on the gold microelectrode. If the electrode surface is modified with calix[4]arene sau calix[6]arene, the intensity of the current drops as the number of ester functional groups are grafted with calixarene. In the case of the carbon electrode with gold nanoparticles not modified with calixarene we notice the occurance of oxidation peak at 0.86 V and a reduction peak at 0.40 V vs. Ag/AgCl, in the case of metoprolol. 20
For the procaine hydrochloride, we notice a specific oxidation peak at 0.64 V vs. Ag/AgCl. If changes are brought to the electrode surface with type C4 or C6 calixarenes, then the intensity of the current drops dramatically, probably due to the interaction between calixarene an the drug substance, which no longer reaches the electrode surface to oxidise or reduce itself. (fig. 1) A B
Figure 1: The electrochemical behaviour of metoprolol (A) and procaine (B) on SPE electrodes with gold nanoparticles
Carbon nanotubes and grapheme, used in the sensor structure have the capacity to significantly increase the contact surface. However, it has been proved that the drug substances studied do not have on these electrodes an electrochemical activity comparable to that in SPE with gold nanoparticles. The conclusions of these studies have yielded the following aspects: The calixarene deposits on the electrode surface lead to a drop in peak current intensity due to its interaction with the drug substance; Metoprolol succinate and procaine hydrochloride have a characteristic electrochemical response on gold electrodes and on electrodes with gold nanoparticles, which allowed the development of some electrochemical methods for dosing the procaine hydrochloride in pharmaceutical forms.
5. The development of elecrochemical methods to determine the quantity of procaine hydrochloride in pharmaceutical forms First, we needed to draw up a calibration line for the procaine hydrochloride, to highlight the proportional increase of peak current intensity with the analyte concentration. The methods used were the square wave voltammetry and the differential pulse voltammetry and the electrodes used: glassy carbon, DRP C110, DRP C110 modified with C4Es2. The electrochemical cell contains procaine hydrochloride solutions of concentrations 10-6M to 10-3M, to which we added metabisulphite in the same ratio 20:1 as in Gerovital ® injectable solution, the pharmaceutical form where procaine was later determined. The working electrode used initially was of glassy carbon. Through square wave voltammetry and differential pulse voltammetry voltammograms were obtained where the procaine hydrochloride has an oxidation peak at about 1.035 V, respectively 0.977V vs. Ag/AgCl. The intensity of the current increases proportionally to concentration, with a maximum corresponding to the solution of 10-3 M procaine hydrochloride. If the glassy carbon electrode is replaced with a screen printed graphite electrode, the potential of the oxidation peak of the procaine hydrochloride maintains virtually the same value, through both methods. If the screen printed graphite electrode type DRP C110 is modified with calixarene C4Es2, teh voltammograms for the procaine hydrochloride only have one oxidation peak. The intensity of the peak current increases proportionally to concentration, but the values are lower compaerd to other electrodic materials used (fig. 2). This is probably due to the presence of calixarene, which, by forming hydrogen bonds with procaine, blocks its oxidation process.
21
Figure 2: Voltammograms with square wave (A) and differential pulse (B) for different concentrations of procaine hydrochloride in the presence of sodium metabisulphite in NaCl 0,1 M on screen printed graphite electrode modified with calixarene C4Es2 (DRP C110+C4E2)
The data obtained from the calibration curves drawn up for the square wave voltammetry on all types of electrodes considered are presented in the following table. Table 1: The equations of the calibration lines obtained for procaine hydrochloride through square wave voltammetry
I =a+b·C p
Analyte
Electrode
LOD
LOQ
(µM)
(µM)
a±S
b±S
CV
0,281±0,006
0,013±0,002
0,998
1,4
4,6
SPE C110
0,084±0,005
0,037±0,005
0,998
0,4
1,3
SPE C110 + CE
0,192±0,007
0,019±0,002
0,999
1,1
3,7
a
Procaine HCl + sodium metabisulphite
R
2
b
4 2
All calibration lines have a very good linearity, and the line with the best correlation coefficient was obtained on the screen printed electrode type DRP C110 with graphite modified with calixarene C4Es2 (R2 = 0,999), for the procaine hydrochloride in the presence of sodium metabisulphite. We notice that the linearity of the calibration line is better at lower concentrations, between 10-6 M and 10-4 M, the linearity scope being generally between 1 and 1000 µM. Regarding the limit of detection and the limit of quantification, these have lower values on the screen printed electrode, but not modified with calixarene. The results obtained through differential pulse voltammetry are sinthesised in the following table.
Table 2: The equations of the calibration lines obtained for procaine hydrochloride through differential pulse voltammetry
I =a+b·C p
Analyte
Electrode a±S
Procaine HCl + sodium metabisulphite
b±S
a
R
2
b
LOD
LOQ
(µM)
(µM)
CV
0,191±0,008
0,016±0,002
0,998
1,6
5,3
SPE C110
0,327±0,008
0,029±0,003
0,999
0,9
3
0,053±0,009
0,024±0,004
0,997
1,175
3,75
SPE C110 + C E
4 2
22
The linearity of the lines is very good for all the types of electrodes studied, with a large concentration interval (1-750 µM). The best results were obtained for the screen printed electrode type DRP C110 with graphite, for the procaine hydrochloride solutions in the presence of sodium metabisulphite, in what concerns linearity as well as the limits of detection and quantification.
5.1. The influence of the type of electrode on the voltamperommetric behavior of procaine hydrochloride In what concerns the influence of various electrode materials, the following charts illustrate the voltammograms obtained with DPV for procaine hydrochloride solutions 5·10-5 M in NaCl 0,1 M. We notice that the intensity of the peak is higher with the use of electrodes DRP110 unmodified than with the ones modified with calixarene or the glassy carbon ones.
Figure 3: The influence of the type of electrode on the electrochemical behaviour of procaine through DPV
If a parallel is drawn, we notice that in the case of the screen printed graphite electrode modified with gold nanoparticles and with calixarene C4Es2 the peak current intensity is higher than in the case of the screen printed electrode which has not been modified. The explanation lies in the fact that gold nanoparticles foster the oxidation reactions that take place on the electrode surface. Nevertheless, this type of electrode does not have a reproducible electrochemical signal, which is why it could not be used to determine the procaine hydrochloride through the considered electrochemical methods. The cause of irreproducibility may be found in the technology of electrode obtainment. This method does not ensure an even and steady coverage of the electrode surface with gold nanoparticles.
5.2. Interference testings The pharmaceutical product Gerovital® contains, besides the procaine hydrochloride, adjuvants: potassium metabisulphite and benzoic acid. This is why a study must be carried out on the interference between the procaine hydrochloride and these adjuvants from an electrochemical point of view. We must establish to what extent the electrochemical signal of the procaine hydrochloride on the three electrodes considered in the study is influenced by the presence of these adjuvants. Voltammograms were drawn up for the glassy carbon electrodes, the screen printed graphite electrodes which were not modified with calixarene C4Es2 (fig.4), throught the two voltamperometric methods.
23
A
B
Figure 4: Square wave voltammograms (A) and differential pulse voltammograms (B) presented in parallel for benzoic acid solutions, procaine ·HCl, procaine ·HCl in the presence of sodium metabisulphite, procaine ·HCl in the presence of sodium metabisulphite and benzoic acid in NaCl 0,1 M, on the screen printed hraphite electrode modified with C4Es2.
Even though the SPE modified with calixarene C4Es2 shows values of the peak current lower than the ones obtained on the unmodified screen printed electrodes or glassy carbon electrodes, it has been noticed that their electrochemical signal is less influenced by the presence of the other components of the solution (sodium metabisulphite and benzoic acid). This can be explained by the creation of a bond between medicine and receptor, specific of procaine, which makes the signal on this electrode modified with calixarene C4Es2 be very little influenced by the possible interferences and recommends it for the development of an electroanalytical dosing method for the procaine hydrochloride found in pharmaceutical forms or cosmetic products.
5.3. Application of the electrochemical methods put forward for the dosing of procaine hydrochloride found in Gerovital ® injectable solution The pharmaceutical form found in shops, Gerovital® injectable solution, contains procaine hydrochloride (100 mg/5 ml). Dilutions were made out of these phials and a theoretical concentration of procaine 5·10-5 M was obtained. These samples were quantitatively analysed through electrochemical methods SWV and DPV and the new electrodes. In order to prove that the electrochemical signals obtained were correctlyattributed to the active component contained in analysed pharmaceutical form, 25 µl, respectively 50µl of 10-2 M procaine hydrochloride were added to the solutions obtained from Gerovital® phials, and the voltammetric determinations were repeated in the same testing conditions. It has been noticed that in the case of all electrodes analysed the signals increase when the solutions are added to the test, that there is no significant drift in the peak potential with concentration and that voltammograms do not have additional peaks. The results obtained for the real tests are presented in the following charts. ®
Table 3: Dosing of the procaine hydrochloride in Gerovital (injectable solution) on different types of electrodes using SWV
Electrode
Concentration (M) theoretical experimental
GCE
5,00·10
SPE C110
5,00·10
DPE C110 +C Es 4
2
5,00·10
-5
-5
-5
5,24·10 5,43·10 5,05·10
24
Recovery (%)
RSD (%)
-5
104,80
2,61
-5
108,60
2,08
-5
101,05
1,41
®
Table 4: Dosing of the procaine hydrochloride in Gerovital (injectable solution) on different types of electrodes using DPV
Electrode
Concentration (M) theoretical experimental
GCE
5,00·10
SPE C110
5,00·10
SPE C110 +C Es 4
2
5,00·10
-5
5,37·10 -5
-5
5,23·10 5,30·10
Recovery (%)
RSD (%)
-5
106,10
2,61
-5
104,60
3,11
-5
106,00
0,49
From the equation of the line corresponding to each method and electrode we have calculated the actual concentration found for the procaine hydrochloride in the Gerovital® phials. We notice that the degree of recovery has values higher than 100%, but close as value for each electrode considered, which brings us to the conclusion that procaine hydrochloride is slightly overdosed in Gerovital® phials. The calculation of relative standard deviation of the peak current intensity indicates low values, which highlights the exactness and accuracy of the tests, with errors occurring within acceptable limits. The best results have also been registered on the screen printed electrodes modified with calixarene C4Es2 through both voltamperometric methods of analysis, bearing out the conclusion that there is a special bond between procaine hydrochloride and the calixarene receptor. ®
5.4. Dosing the procaine hydrochloride in Gerovital officinal method
phials through the
Due to the fact that the degree of recovery of the procaine hydrochloride determined electrochemically on real samples of Gerovital® phials have highlighted concentrations slightly higher than those declared by the producer, we went on to also determine the procaine hydrochloride using the official method used up to now by the producer. The procaine hydrochloride dosing method provided by the Romanian Pharmacopoeia is based on sodium nitrite titration in the presence of tropeolin. The data obtained through the nitritometric method are shown in the table. Table 5: Dosing of procaine hydrochloride through the nitritometric method
Analyte Procaine ®
hydrochloride(Gerovital ) Procaine hydrochloride
Theoretical (g)
Practical (g)
Recovery (%)
RSD(%)
0,100000
0,106386
106,40
1,28
0,100000
0,100363
100,40
0,86
In this case as well we notice that the degree of recovery surpasses 100%, highlighting the fact that the active substance, procaine hydrochloride, is slightly overdosed in Gerovital® phials. Here are some conclusions that can be drawn from the studies regarding the dosing of procaine in pharmaceutical forms:
25
The degree of recovery is close value-wise in the case of the officinal nitriometric method and the proposed electrochemical methods; Electrodes DRP-C110 and DRP-C11o modified with calixarene C4Es2 were used successfully to dose the procaine hydrochloride in the Gerovital® phials, thus obtaining a concentration deviation of the active substance under ±5% compared to the one declared by the producer; SPEs modified with calixarene C4Es2 have lead to the obtainment of a more accurate dosing of procaine hydrochloride, less influenced by the substances in the solution.
GENERAL CONCLUSIONS This doctoral thesis has lead to the development of new electrochemical sensors modified with calixarene that have allowed for the dosing of procaine hydrochloride in pharmaceutical forms sold in the market and for the study of the interaction between the medicine and the artificial receptor. These represent a micromolecular detection limit, are faster and have an increased sensitivity. The screen printed electrodes used in these studies have proved to have a good selectivity due to the modification of their surface with calixarene. Moreover, there are also the reduced cost, the possibility to mass produce them with high reproducibility, the possibility to use them as disposable sensors, which avoids contamination. Besides these advantages, there are also production-related ones: design and material flexibility, the possibility to automate production, the possibility to miniaturise them in portable measurement systems.
26