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Université de Sherbrooke
Spécificité enzym atique et régulation fonctionnelle de la m atriptase-2, une protéase à sérine transm em branaire de type II essentielle à l’hom éostasie du fer
Par François Béliveau D ép artem en t de p harm acologie
Thèse présentée à la Faculté de m édecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention d u grade de philosophies doctor (Ph.D.) en pharm acologie
Sherbrooke, Q uébec, C anada Juillet 2012
M em bres d u jury d ’évaluation : Dr Richard Leduc D épartem ent de pharm acologie, U niversité de Sherbrooke Dr Jean-B ernard D enault D épartem ent de pharm acologie, U niversité de Sherbrooke Dr Sim on Labbé D épartem ent de biochim ie, Université de Sherbrooke Dr M anuela M. Santos D épartem ent de m édecine, Faculté de m édecine, Université de M ontréal
© F rançois Béliveau, 2012
1+1
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Canada
R ésum é
Spécificité enzym atique et régulation fonctionnelle de la m atriptase-2, u n e protéase à sérine transmembranaire de type II essentielle à l’hom éostasie du fer p ar François Béliveau D ép artem en t de pharm acologie Thèse présentée à la Faculté de m édecine et des sciences de la santé en vue de l’obtention du diplôm e de philosophiez doctor (Ph.D.) en pharm acologie, Faculté d e m édecine et des sciences de la santé, U niversité de Sherbrooke, Q uébec, C anada, J1H 5N4 Les protéases à sérine tran sm em b ran aires d e type II (TTSP) fo rm en t u n e fam ille d ’enzym es protéolytiques nou v ellem en t identifiée d o n t les rôles physiologiques resten t encore peu connus. Ces enzymes seraient, entre autres, im pliqués dans la form ation des tissus et leur dérégulation est reliée à d e n o m b reu x types de cancers. R écem m ent, u n e fo n ctio n essentielle dans la régulation de l’hom éostasie du fer a été attribuée à l’u n de ses m em bres, la m atriptase-2 (TMPRSS6). Cet enzym e exerce ce rôle en contrôlant l’expression de l’hepcidine, une horm one im portante dans la régulation du fer. Afin de m ieux com prendre cette fonction de la m atriptase-2, dans ce travail nous avons com paré ses propriétés enzym atiques à celles de trois autres TTSP ainsi q u ’analyser son m écanism e de régulation fonctionnel. Nous dém ontrons que la m atriptase-2 possède des préférences de substrats distinctes. Sa spécificité a été com parée à celles de la m atriptase, de l’h epsine et d e DESC1 en utilisant des p ep tid es-su b strats à fluorescence séquestrée. La séq u en ce des p e p tid e s utilisés est basée sur la région P4 à P4’ de la séq u en ce d ’activation de la m a trip ta se (RQARTWGG). Les positions P4, P3, P2 et P I ’ ont été substituées par des acides am inés de natures différentes (non-polaire, arom atique, acide e t basique) alors q u e la p o sitio n P I a été fixée à Arg. Des quatre TTSP étudiées, la m atrip tase-2 est la plus perm issive alors q u e la m a trip ta se est la plus discrim inante. DESC1 possèd e u n e préférence sim ilaire à celle de la m atrip tase, m ais avec u n e te n d an c e p o u r les petits acides am inés n o n -p o laires (Ala) e n PI'. En p résen ce d e serpines, seulem ent AT III dém ontre u n e activité d ’inhibition robuste. La m atriptase-2 ainsi que l’hepsine et DESC1 so n t aussi fo rtem en t in h ib ées en p résen ce d e PAI-1 et de oç-AP. La m atriptase-2 est aussi la seule à présen ter un e inhibition p a r certains des substrats. Nous dém ontrons aussi l’im portance de la régulation de la m atriptase-2 à la m em brane plasm ique dans le contrôle de l’expression de l’hepcidine. Nous rapportons que la m atriptase2 subit u n e internalisation constitutive dans les cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires h épatiq u es h um aines, les HepG2 e t les hépatocytes prim aires, tous les deux exprim ant la m atriptase-2 en d o g èn em en t. La m atrip tase-2 m a rq u é e à la surface cellulaire est internalisée puis d étectée d an s des vésicules c o n te n a n t d e la clath rin e et la p rotéine AP-2 p o u r ensuite se retro u v er d an s les e n d o so m es précoces p u is les lysosom es. L 'internalisation de la m atriptase-2 d é p e n d d e résidus spécifiques situés d a n s la p o rtio n am ino-term inale de sa queue cytoplasm ique, com m e le dém ontre les résultats de la m utagénèse dirigée de ces résidus. Les cellules qui exprim ent ces m u ta n ts p ro d u ise n t des niveaux significativem ent dim inués d ’hepeidine com parées à celles exprim ant la form e sauvage car les form es m utantes s’accum ulent à la surface cellulaire et clivent davantage l’hém ojuvéline. M ots-clés : TTSR protéase, m atriptase-2, TMPRSS6, spécificité enzym atique, internalisation.
Ta b l e
d e s m a t iè r e s
Résumé
II
Liste d e s tableaux
vi
L iste d e s f ig u r e s
viii
L iste d e s a b r é v ia t io n s 1
ix
In t r o d u c t i o n
1
1.1 Les enzym es.......................................................................................................................
1
1.1.1
La réaction e n z y m a tiq u e ..................................................................................
1
La cinétique de M ich a e lis-M e n te n ..............................................
1
1.1.2 M odulation de l’activité e n z y m a tiq u e ..........................................................
2
1.1.1.1 1.1.2.1
E nvironnem ent de l’e n z y m e ........................................................
3
1.1.2.2
M odulation allo stériq u e...................................................................
3
1.1.2.3
In h ib ite u rs ..........................................................................................
4
1.1.3 C la ss ific a tio n ......................................................................................................
5
1.2 L e s p r o té a s e s ....................................................................................................................
5
1.2.1
1.3
N om enclature de Schechter et B e r g e r ..........................................................
6
1.2.2 Les protéases à s é rin e .........................................................................................
6
1.2.2.1
M écanism e c a ta ly tiq u e ...................................................................
8
1.2.2.2
Spécificité e n z y m a tiq u e ...................................................................
9
1.2.2.3
Les protéases à sérine d e la famille S I ........................................
11
1.2.2.4
Les protéases à sérine ancrées à la m em b ran e cellu laire. . . .
12
Les protéases à sérine transm em branaires de type I I ............................................
12
1.3.1
C la ss ific a tio n ......................................................................................................
12
1.3.2 Propriétés b io c h im iq u e s ..................................................................................
16
1.3.3 Fonctions physiologiques..................................................................................
17
1.3.4 Im plications p ath o lo g iq u es..............................................................................
19
1.3.4.1
Progression de la tu m o rig en è se .....................................................
19
1.3.4.2
Activation des virus de 1’i n f l u e n z a ..............................................
20
1.3.4.3
S u r d ité .................................................................................................
21
1.3.4.4
A n ém ie.................................................................................................
21
1.4 La régulation du fer p a r la m a trip ta s e - 2 .....................................................................
21
1.4.1
La m a trip ta s e -2 ...................................................................................................
21
1.4.2 Le fer chez les organism es v iv a n ts .................................................................
23
1.4.3 Régulation d u fer dans l’organism e.................................................................
23
iv
Contrôle de la libération d u f e r ......................................................................
26
1.4.4.1
L’h ep cid in e ...........................................................................................
26
1.4.4.2
Expression de l’h e p c id in e ................................................................
26
1.4.4.3
C ontrôle de l’expression de l’h epcidine par la m atriptase-2 . .
29
1.5 Projet de re c h e rc h e ..........................................................................................................
30
1.4.4
2
3
4
1.5.1
P r o b lé m a tiq u e .................................................................................................
30
1.5.2
H ypothèse de r e c h e r c h e ................................................................................
31
1.5.3
Objectifs de r e c h e r c h e ....................................................................................
31
O bjectif 1 : D éterm in er la spécificité d u d o m ain e catalytique de la m a trip ta s e -2 ........................................................................................
31
O bjectif 2 : D éterm in er la fo n ctio n de la q u e u e cy to p lasm iq u e de la m a trip ta s e -2 ........................................................................................
31
A rticle I
33
2.1 A b s tra c t..............................................................................................................................
35
2.2 Intro d u ctio n.......................................................................................................................
35
2.3 R esults.................................................................................................................................
37
2.4 D iscussion...........................................................................................................................
46
2.5 Experim ental p ro c e d u re s................................................................................................
50
2.6 A cknow ledgem ents..........................................................................................................
54
2.7 R eferences...........................................................................................................................
54
A r t i c l e II
59
3.1 A b s tra c t..............................................................................................................................
62
3.2 Intro d u ctio n .......................................................................................................................
62
3.3 Experim ental p ro c e d u re s................................................................................................
64
3.4 R esults.................................................................................................................................
67
3.5 D iscussion...........................................................................................................................
75
3.6 A cknow ledgem ents..........................................................................................................
78
3.7 R eferences...........................................................................................................................
78
3.8 Supplem ental fig u re s.......................................................................................................
82
D iscussion
84
4.1 Spécificité enzym atique de la m atriptase-2 p ar rap p o rt à d ’au tres TTSP . . . .
84
4.1.1
Spécificité envers les s u b s tr a ts ......................................................................
85
4.1.2
Profils d ’i n h i b i t i o n ..........................................................................................
86
4.2 Régulation fonctionnelle de la m a trip ta se -2 ...............................................................
88
4.2.1
Internalisation de la m atriptase-2 à p artir de la surface cellulaire. . . .
88
4.2.2
C aractérisation de la voie d ’internalisation de la m a tr ip ta s e - 2 ..............
89
4.2.3
D éterm inants im pliqués dans l’in te r n a lis a tio n ........................................
90
4.2.4 4.3
Im pact de la perte d ’internalisation de la m atriptase-2 su r sa fo n c tio n .
Spécificité enzym atique et internalisation de la m atriptase-2 dans la régulation de sa fo n c tio n ...................................................................................................................
5
C o nclusio n
6
R em erciem ents
B iblio g raph ie A n n e x e A - R ésultats su p p l é m e n t a ir e s
A .l
Internalisation de la m atriptase-2 h u m ain e et m u r i n e .........................................
A.2
Phosphorylation de la m a tr ip ta s e - 2 ...........................................................................
A n n e x e B - Liste d e s p u b l ic a t io n s et c o m m u n i c a t i o n s
B. 1
Liste des p u b licatio n s......................................................................................................
B.2
Liste des c o m m u n ic a tio n s ...........................................................................................
L is t e
d es tableaux
1.1
Ensem ble des différents clans de p ro té a s e s .................................................................
7
1.2
Liste des TTSP h u m a in e s...................................................................................................
14
2.1
Effects ofprotease inhibitors on purified recom binant m atriptase, m atriptase-2, hepsin an d DESC1 a c tiv itie s ............................................................................................
40
Effects ofserpins on purified recom binant matriptase, m atriptase-2, hepsin a n d DESC1....................................................................................................................................
41
2.3
IQ Fpeptide hydrolysis by matriptase, matriptase-2, hepsin a n d D E S C 1 ...............
44
2.4
Hydrolysis o f IQF peptides w ith physiological substrate processing sites by m a triptase, matriptase-2, hepsin a n d D E SC 1....................................................................
47
2.2
L is t e
d e s fig u r e s
1.1
C inétique de M ichaelis-M en ten ......................................................................................
2
1.2
Effet du potentiel hydrogène (pH) su r l’activité e n z y m a tiq u e ................................
3
1.3
R épartition des protéases en fonction de leur type c a t a l y t i q u e ............................
6
1.4
N om enclature de Schechter et B erg er............................................................................
8
1.5
M écanism e catalytique des p ro téases à s é r i n e ...........................................................
10
1.6
R eprésentation schém atique des 17 TTSP h u m a in e s ................................................
13
1.7
Biosynthèse des T T S P .......................................................................................................
18
1.8
Expression de la m atriptase-2 dans différents tissus h u m a i n s .................................
22
1.9
R eprésentation schém atique de la m a tr ip ta s e - 2 .......................................................
22
1.10
Régulation du fer dans l’o r g a n is m e ...............................................................................
25
1.11
D égradation de la ferroportine p ar l’h e p c id in e ...........................................................
27
1.12
Régulation de l’expression de l’h epcidine
.................................................................
28
1.13
M utations de la m atriptase-2 im pliquées d an s l’aném ie de type IR ID A ...............
30
1.14
Motifs identifiés dans la queue cytoplasm ique de la m a trip ta s e -2 ..........................
31
2.1
TTSP expression an d p u r ific a tio n ...................................................................................
38
2.2
TTSP pH p r o f i l e .................................................................................................................
39
2.3
TTSP substrate p r e fe r e n c e ................................................................................................
42
2.4
IQF peptides do n o t exhibit M ichaelis-M enten kinetics with m atriptase-2 . . . .
43
3.1
TMPRSS6 undergoes in te r n a liz a tio n ............................................................................
68
3.2
Characterization ofTM PRSS6 internalization p a t h w a y ..........................................
70
3.3
TMPRSS6 cytoplasmic tail is involved in in te r n a liz a tio n ..........................................
72
3.4
TMPRSS6 internalization depends on specific am in o acid w ithin 2-11 region o f the cytoplasmic t a i l .........................................................................................................
74
In h ib itin g TMPRSS6 internalization affects cell surface cleavage o f HJV a n d hepcidin p r o d u c tio n .........................................................................................................
76
3.SF1 Specificity o f TMPRSS6 antibody a n d siRNA p o o l s ....................................................
82
3.SF2 TMPRSS6 does not colocalize w ith caveolin-1 ..............................................................
83
4.1
Principales voies d ’e n d o c y to s e ......................................................................................
90
4.2
Form ation des vésicules d ’internalisation de la m a tr ip ta s e - 2 ................................
91
4.3
Différentes étapes du processus d ’internalisation d e la m a tr ip ta s e - 2 ..................
92
4.4
M odulation de la m atriptase-2 dans le contrôle des niveaux d ’h ep cid in e . . . .
94
A .l
La m atriptase-2 m urine n’est pas in t e r n a l i s é e ...............................................................109
3.5
La m atriptase-2 est constitutivem ent phosphorylée
L is t e
d e s a b r é v ia t io n s
ex!-ACT
ai -antichym otrypsine
ai-AT
ai-antitrypsin e
«2 -AP
a 2 -antiplasm ine
ANP
Atrial natriuretic peptide
ATIII
A ntithrom bine III
BMP
Bone morphogenetic protein
BMPRI-II
R écepteur de type I et II du BMP
CUB
Cls/Clr, urchin em bryonic growth factor, bone m orphogenetic protein-1
Dcytb
D uodenal cytochrom e B
DESC1
Differentially expressed in squam ous cell carcinom a-1
DMT1
D ivalent m etal transporter-1
EEA1
Early endosom e antigen 1
GPI
Glycosylphosphatidylinositol
HA
H ém agglutinine
HAT
H um an airway trypsin-like protease
I IATL
HAT-like
HDL
H igh-density lipoprotein
HGF
Hepatocyte growth factor
HJV
H ém ojuvéline
IQF
Internally quenched fluorogenic
IRIDA
Iron-refractory iron deficiency anem ia
LAMP2
Lysosomal-associated m em brane protein 2
LDLRA
Low-density lipoprotein receptor class A
MAM
Meprin/A5 antigen/receptor protein phosphatase m u
MesNa
Sodium 2-m ercaptoéthanesulfonate
MSPL
Mosaic serine protease large-form
MT1-MMP
M em brane type 1 m atrix m etalloproteinase
PAI-1
Plasminogen activator inhibitor-1
PAR-2
Protease activated receptor 2
PCI
Protein C inhibitor
PKC
Protéine kinase C
PS-SCL
Positional scanning synthetic com binatorial peptide libraries
RCPG
R écepteur couplé aux protéines G
SEA
Sea urchin sperm protein/enteropeptidase/agrin
SH2
Src hom ology 2
SMAD
Son o f m others against decapentaplegic
SRCR
Scavenger receptor cysteine-rich
Tf
Transferrine
TfR
R écepteur de la transferrine
TTSP
Type II transm em brane serine protease
uPA
Urokinase-type plasm inogen activator
uPAR
Urokinase-type plasm inogen activator receptor
In t r o d u c t io n
1.1 Les enzym es Les enzym es sont les entités resp o n sab les d e l’accélération des réactio n s chim iques, la catalyse, nécessaire à la survie des cellules. Ceux-ci so n t p rin c ip a le m en t des p ro téin es bien q u ’il en existe certains constitués d ’ARN, les ribozym es (Talini, B ranciam ore e t Gallori, 2011). Au cours d ’u n e réaction enzym atique, des m olécules initiales, ap p elées substrats, sont converties p a r l’enzym e en différentes m olécules, appelées p ro d u its. La fonction et la spécificité de l’enzym e d é p e n d e n t de sa co n fo rm atio n tridim ensionnelle, stru ctu re qui est octroyée p ar la séquence en acides am in és de la p ro téin e (structure prim aire) (Anfinsen, 1973). Sa fonction catalytique est assurée seulem ent que p ar u n e petite portion de la protéine (3^1 acides am inés) nom m é site actif, qui p erm et de lier le substrat et d ’effectuer la réaction enzym atique (Alberts etal., 1994). Lorsque le substrat entre dans le site actif, celui-ci forme u n com plexe enzym e-substrat de courte durée (Alberts etal., 1994). Lors de cette com binaison, le site actif p e u t être m odifié lorsque le su b strat interagit avec l’enzym e, c ré an t ainsi u n aju stem en t induit. É tant d o n n é q u e les enzym es so n t des stru ctu res flexibles, le site actif est continuellem ent rem anié par l’in teractio n avec le su b strat lorsque celui-ci interagit avec l’enzym e (Alberts e ta l, 1994).
1.1.1 La réaction enzym atique Au cours de la réaction enzymatique, u n enzyme (E) se lie à un substrat (S) pour form er u n com plexe en zym e-substrat (ES), com plexe qui p e rm e ttra de co n v ertir le su b strat e n produit (P) tout en libérant l’enzym e. C ette réactio n p eu t être représenté p ar l’éq u atio n 1.1.
E +S ^ E S ^ E +P
( 1 . 1)
k -1
où k\, k - i et kcat sont les constantes de vitesse des réactions et la double flèche entre S et ES représente le fait que le com plexe enzym e-substrat est u n processus réversible.
1.1.1.1 La cinétique de M ichaelis-M enten La cinétique de M ichaelis-M enten (équation 1.2) p erm et de décrire la cinétique d ’une réaction catalysée p ar u n enzym e agissant su r u n su b strat u n iq u e p o u r d o n n e r u n p ro d u it (Pelm ont, 1995). D ans ce m odèle, lorsque la co n ce n tra tio n e n enzym e est très faible p ar rapport à la concentration en substrat, la vitesse de form ation du p ro d u it est la suivante :
v = vmax K m[5]+ [5]
kcai [retliK m[s]+
[5]
( 1.2 )
2
où Vi est la vitesse initiale (vitesse en absence de produit) de la réactio n enzym atique p o u r u n e co n cen tratio n de su b strat [5] ; Vmax est la vitesse initiale m axim ale m esu rée p o u r u n e co n cen tratio n satu ran te de su b strat ; [5] est la c o n cen tratio n en su b strat ; K m est la c o n stan te de M ichaelis. La valeur de Vmax p e u t aussi être exprim ée p a r Vmax = kcat [Et] où kCat est la c o n stan te catalytique qui c o rresp o n d au n o m b re m axim al d e m ole de su b strat converti en produit p a r m ole d ’enzym e p a r seconde et \Et) la co n cen tratio n d ’enzym e total. La valeur de K m est spécifique à l’enzym e et correspond à la concentration en su b strat po u r laquelle la vitesse initiale de la réactio n est égale à la m o itié de la vitesse initiale m axim ale (Vmax/2) (Pelmont, 1995). Elle reflète l’inverse de l’affinité de l’enzym e p o u r son substrat. Plus elle est grande, m oins b ie n le su b strat se fixe à l’enzym e, d o n c l’affinité de l’enzym e p o u r le substrat est faible. À l’inverse, plus la c o n stan te de M ichaelis est petite, le su b strat se fixe davantage à l’enzym e, donc l’affinité de l’enzym e p o u r le su b strat est élevée, ce qui signifie que la vitesse de réactio n a p p ro ch era Vmax plus ra p id e m en t. Le ra p p o rt kcat / K M est u n e m esure de l’efficacité catalytique (Pelmont, 1995). La figure 1.1 représente graphiquem ent ce m odèle enzym atique. 6 5 4
< 0 V) tn 3 2
1
1
2
3
4
5
6
7
8
[Substrat]
Figure 1.1 C inétique de M ichaelis-M enten Exemple de la cinétique de Michaelis-Menten montrant la vitesse de réaction initiale en fonction de la concentration en substrat pour une quantité fixe d’enzyme. Vmax correspond à la vitesse initiale maximale mesurée pour une concentration saturante de substrat et K correspond à la concentration en substrat pour laquelle la vitesse initiale de la réaction est égale à la moitié de la vitesse initiale maximale (Vmax). m
1.1.2 M odulation de l’activité enzym atique L’activité catalytique des enzym es p e u t être m o d u lée à la h au sse o u à la baisse afin de réguler leur fonction. À cette fin, différents m écan ism es existent, co m m e p a r exem ple l’influence du milieu, la présence de m odulateurs allostériques ainsi que d ’inhibiteurs.
3
1.1.2.1 Environnem ent de l’enzym e Le m ilieu dans lequel se situe les enzym es a un e influence im p o rtan te sur leur activité catalytique. Par exem ple, u n e m odification d u p o ten tiel hydrogène (pH) d e so n e n v iro n n e m en t p e u t influencer co n sid érab lem en t so n efficacité catalytique, c o m m e le d é m o n tre la figure 1.2. C ette figure m e t aussi e n évidence q u e ch aq u e enzym e p o ssèd e u n p o ten tiel hydrogène qui est optim al à sa fonction catalytique (Pelm ont, 1995). U ne v ariatio n d u pH a p o u r co n séq u en ce de m odifier la charge d es résidus basiq u es et acides des p ro téin es, ce qui causera u n c h an g em en t im p o rta n t de l’é ta t d e p ro to n a tio n des résid u s n u cléo p h iles im pliqués dans la catalyse. De telles m odifications de charges p e u v e n t aussi affecter la structure tridim entionnelle de l’enzym e et p a r conséquent, em p êch er le su b strat à accéder correctem ent au site catalytique (Pelmont, 1995). 100-
§
75-
nj 50-
> < t5
25-
pH
Figure 1.2 Effet du potentiel hydrogène (pH) su r l’activité enzym atique Une modification du potentiel hydrogène (pH) de l’environnement d’un enzyme influence son activité catalytique. 1.1.2.2 M odulation allostérique L’allostérie est u n e p ro p riété d ’u n enzym e qu i p e rm e t la m o d u la tio n de son action catalytique. Elle se pro d u it lorsque sa stru ctu re tertiaire ou quaternaire est tran sfo rm ée par une molécule qui se fixe à un site différent de son site actif (Hacker, Sisay et Gütschow, 2011). Elle im plique au m oins deux liaisons à l’enzym e, celle d u su b strat au niv eau d u site actif ainsi que celle d ’u n effecteur à u n site dit allo stériq u e ou à u n exosite (Drag et Salvesen, 2010). Le site allostérique constitue u n e région de l’enzym e qui participe in d irectem en t à la reconnaissance et au clivage d u su b strat alors que l’exosite est resp o n sab le d ’in teractio n s su b strat-en zy m e spécifiques. Le site allostérique a u g m en te ou d im in u e la co n v ersio n d u substrat e n p ro d u it p ar u n ch an g em en t c o n fo rm atio n n el d e l’enzym e alors q u e l’exosite influence la vitesse de catalyse et parfois la spécificité de su b strat d ’u n e p ro té a se d o n n é e (Drag et Salvesen, 2010). L’effecteur, ta n t q u ’à lui, p e u t être une p e tite m o lécu le o u u ne protéine qui se lie à l’enzym e ou alors u n e p h o sp h o ry latio n de l’enzym e p a r u n e kinase (Laskowski, Gerick et T hornton, 2009).
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1.1.2.3 Inhibiteurs Les in h ib iteu rs so n t des su b stan ces q u i d im in u e n t l’activité d ’u n enzym e e n se liant à celui-ci. Ils exercent leur fonction p rin c ip a le m en t en o ccu p an t la p lace d u su b strat au niveau de la po ch ette catalytique ou en la d é fo rm a n t en se liant à u n e région différente de l’enzyme (inhibiteur allostérique) (M arangoni, 2003). La liaison d ’un in h ib iteu r sur l’enzym e p e u t se faire d ’u n e façon réversible ou irréversible. Les in h ib iteu rs réversibles se lien t de façon non covalente par des liaisons hydrogènes, des interactions hydrophobes et des liaisons ioniques alors que les irréversibles se fixent en établissant u ne liaison covalente avec l’enzym e (M arangoni, 2003). Il existe différents types d ’in h ib iteu rs réversibles d o n t les in h ib ite u rs com pétitifs, incompétitifs, non-com pétitifs et mixtes. Parm i ceux-ci, les inhibiteurs com pétitifs possèdent la capacité d 'entrer en com pétition avec le su b strat au niveau de la pochette catalytique. Ces inhibiteurs possèdent généralem ent une structure com parable à celle du substrat (Marangoni, 2003). C ertains n e so n t p as des analogues d u su b strat et d a n s ce cas, ils n e se fixent pas a u site actif, m ais sur u n site différent de l’enzym e (in h ib iteu r allostérique). D ans le cas des inhibiteurs incom pétitifs, ceux-ci ne se fixent jam ais à l’enzym e libre m ais seu le m e n t à l’enzyme associée avec le substrat (ES), ce qui em pêche la form ation de produits (Marangoni, 2003). C ette liaison devient donc possible lo rsq u e le su b strat se lie su r l’enzym e, ce qui provoque une m odification de sa structure qui perm et de révéler un nouveau site de fixation p o u r l’inhibiteur. L’inhibiteur, en se liant, m odifie la conform ation d u site actif et em p êch e ainsi la réaction. Il existe aussi un cas particulier d ’inhibition incom pétitive, l’inhibition par le substrat. Dans ce cas, deux molécules de substrat peuvent se lier à l’enzyme, m ais ne peuvent pas être transform ées en p ro d u it (C opeland, 2000). Pour ce qui est des in h ib ite u rs noncompétitifs, ceux-ci peuvent au tan t se lier à l’enzym e libre q u ’au complexe enzym e-substrat, e t cela avec u n e m êm e affinité (M arangoni, 2003). Par contre, d an s ce type d ’inh ib itio n , l’inhibiteur et le su b strat n ’e n tre n t jam ais e n co m p étitio n p o u r se fixer a u m êm e site, le substrat se lie au site actif alors q u e l’in h ib ite u r se fixe à u n site d istinct. La fixation d e l’inhibiteur cause u n e m odification de la co n fo rm atio n d u site actif e t e m p êc h e ainsi la transform ation du substrat en p roduit sans toutefois influencer sur la reconnaissance entre l’enzyme et le substrat. Finalem ent, les inhibiteurs mixtes peuvent se lier à l’enzym e au m êm e m om ent que le substrat. Dans ce cas, la liaison de l’inhibiteur affecte la liaison d u substrat et vice versa (M arangoni, 2003). Bien que les in h ib iteu rs de ce type peuvent se lier au site actif, ils causent généralem ent u n effet allostérique en se liant à u n site différent. Pour ce qui est des inhibiteurs irréversibles, aussi appelés inhibiteurs suicides, ceux-ci form ent u n com plexe stable avec l’enzym e et l’inactive de façon p e rm a n en te . L’in h ib ite u r est reconnu p ar l’enzym e com m e u n su b stra t et e n tam e so n clivage. D u ran t cette étape, l’inhibiteur se lie de façon stable à l’enzym e p a r u n lien covalent. D ans ce type d ’inhibition, l’inhibiteur p e u t soit agir sur le site catalytique de l’enzym e o u soit à u n en d ro it distan t. De
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ces inhibiteurs irréversibles, les serpines c o n stitu en t la plus grande et la plus d istribuée des familles d ’in h ibiteurs de protéases (Law e ta l., 2006). Des gènes c o d a n t p o u r des serp in es o n t été identifié chez tous les eucaryotes m ulticellulaires (Law etal., 2006). La m ajorité des serpines inhibent les protéases à sérine, m ais certaines in h ib en t aussi les caspases ainsi que protéases à cystéine similaires à la p apaïne (Law etal., 2006).
1.1.3 Classification En fonction d u type de réactio n q u ’ils catalysent, les enzym es so n t classés en six principaux groupes : les oxydo-réductases (E.C.l), les transférases (E.C.2), les hydrolases (E.C.3), les lyases (E.C.4), les isom érases (E.C.5) et les ligases ou sy n th étases (E.C.6) (Webb, 1992). Parmi ces différents groupes, les hydrolases co n stitu en t une classe d ’enzym es qui c ata lysent les réactions d ’hydrolyse de molécules en utilisant une molécule d ’eau. Elles effectuent des réactions du type A-B + H20 -» A-OH + B-H. On y retrouve, entre autres, les estérases qui hydrolysent les esters (R -C O -O l-R ’), les p rotéases q u i hydrolysent les liaisons p ep tid iq u es (AA1-C04NH-AA2), les glucosidases qu i hydrolysent les oligo- ou polysaccharides (sucrei0 |s u c r e 2) et les phosphatases qui hydrolysent les produits phosphorés (ATP + H 20 —>ADP + P). Les hydrolases se retrouvent notam m ent en abondance dans les lysosom es (Alberts et a l, 1994). Les enzym es protéolytiques (protéases), so n t les effecteurs d ’u n grand n o m b re d ’évé nem ents biologiques au tan t dans la catalyse non-spécifique de la dégradation des protéines que dans celle très sélective responsable du contrôle d ’événem ents physiologiques finem ent régulés (Lôpez-Otin et Bond, 2008).
1.2 Les protéases À ce jour, 3 923 protéases distinctes ont été identifiées et séparées en différentes classes en fonction de leur m écanism e catalytique (Rawlings, M orton et Barrett, 2006). Le m écanism e catalytique de ces protéases im plique la p résen ce au niveau d u site actif d ’u n acide am in é spécifique essentiel à l’hydrolyse d u peptide. En fonction de la classe, c et acide am iné p e u t être u n e sérine, u n e cystéine, u n acide aspartique, u n acide g lutam ique ou u n e th ré o n in e (Neurath, 1984). Il existe aussi u n cas p articulier où la catalyse nécessite la p résen ce au site actif d ’un ion métallique, les m étalloprotéases (Neurath, 1984). De tous les types catalytiques, les p rotéases à sérine c o n stitu en t le type le p lu s ré p a n d u (43 %) suivi des m étallo p ro téases (24 %), des protéases à cystéine (21 %) et des protéases à aspartate (8 %) (figure 1.3) (Rawlings, M orton et B arrett, 2006). Avec l’arrivée d u séq u en çag e co m p let du génom e, ce systèm e d e classification s’est éten d u p a r la nécessité d’englober to u t le répertoire catalytique retrouvé
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dans la n atu re (Page et Cera, 2008). U ne nouvelle classification b asée sur les sim ilarités statistiq u em en t significatives d an s la séq u en ce et la s tru c tu re de l’en sem b le des enzym es protéolytiques a été établie p ar Rawlings, M orton e t B arrett (2006), u n e base de d o n n ées n o m m ée MEROPS. Ce systèm e de classification divise les p rotéases en clans (tableau 1.1), su r la base de leur m écanism e catalytique, et en familles, s u r la base d ’an cêtres co m m u n s (Rawlings, M orton et Barrett, 2006). Présentem ent, les protéases sont classées à l’intérieur de 59 clans se divisant en 230 familles différentes (MEROPS 9.6). C ystéine (21 %)
Métallo (24% )
A sp artate (8 %)
Inconnu (1 %) T hréonine (2 %) A sp arag in e (1 %)
S érin e (43 %)
Figure 1.3 R épartition des p rotéases en fonction de leur type catalytique Les protéases se répartissent en sept différents types catalytiques en fonction de la présence au niveau du site actif d’un acide aminé spécifique essentiel à leur action hydrolytique (Rawlings, Morton et Barrett, 2006). 1.2.1 Nomenclature de Schechter et Berger Les protéases p o ssèd en t u n e spécificité v ariable envers leur su b strat en fo n ctio n de la capacité de l’enzym e à acco m m o d er les ch aîn es latérales d u su b strat au niveau de son site actif. C ette capacité est octroyée p a r des sous-sites de spécificité qu i so n t capables d ’accom m oder la chaîne latérale d ’u n seul acide a m in é d u su b strat (Schechter et Berger, 1967). Afin de décrire la spécificité des protéases, Schechter et Berger (1967) o n t proposé un modèle conceptuel (figure 1.4) dans lequel les résidus du substrat sont n um érotés à partir du site de clivage, PI, P2...Pn en direction de la région N -term inale et P I ’, P2’...Pn’ en direction C-terminale. Les sous-sites de la protéase qui les accom m odent sont num érotés SI, S2...Sn et SI', S2’...Sn’ respectivem ent. 1.2.2 Les protéases à sérine Les protéases à sérine co n stitu en t le type catalytique le plus ré p a n d u avec 43 % de toutes les protéases (Rawlings, M orton et Barrett, 2006) et sont retrouvées de façon ubiquitaire
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Tableau 1.1 Ensemble des différents clans de protéases Clan
Protéase type
Clan
Protéase type
AE AF
Peptidase gpr (Bacillus megaterium) Om ptine (E. coli)
CL CM CN co
Sortase A (Staphylococcus aureus) Hépatite C peptidase 2 (B. megaterium) Peptidase nsP2 du virus sindbis Dpp VI (B. sphaericus)
GB
Protéine GP12 (bactériophage phi-29)
Clans des protéases à aspartate AA AC AD
Pepsine A (Homo sapiens) Peptidase signale II (E. coli) Préséniline 1 (Homo sapiens)
Clans des protéases à cystéine CA CD CE CF
Papaïne (Carica papaya) Caspase-1 (Homo sapiens) Adénaïne (Adénovirus hum ain de type 2) PGP-I (B. amyloliquefaciens)
Clans des protéases à glutamate GA
Peptidase scytalidoglutamique (S. lignicolum)
Clans des métalloprotéases MA MC
Thermolysine (B. thermoproteolyticus) Carboxypeptidase Al (Homo sapiens)
MI MK
MD ME MF MG MH
Zn DD-peptidase (S. albus) Pitrilysine (E. coli) Leucyle aminopeptidase (Bos taurus) Méthionyle am inopeptidase 1 (E. coli) Aminopeptidase Api ( Vibrio proteolyticus)
MM MN MO MP MQ
Dipeptidase m em branaire (Homo sapiens) O-sialoglycoprotéine peptidase (M haemolytica) S2P peptidase (Homo sapiens) D-aminopeptidase DppA (Bacillus subtilis) Béta-lytic m étallopeptidase (A. lyticus) Pohl peptidase (Saccharomyces cerevisiae) Aminopeptidase T (Thermus aquaticus)
ND NE
Précurseur de Tsh (E. coli) Picobirnavirus peptidase (Picobirnavirus)
Clans des lyases à asparagine NA NB NC
Nodavirus peptidase (Nodavirus) Protéine YscU ( Y. pseudotuberculosis) Réovirus peptidase 1 (Orthoréovirus)
Clans des protéases de type catalytique mixte (cystéine, sérine, thréonine) PA PB
Chymotrypsine A (Bos taurus) Amidophosphoribosyltransférase (H. sa piens)
PC PD
Dipeptidase E (Salmonella enterica) Protéine hedgehog (D. melanogaster)
SK SP SQ SR SS ST
Peptidase Clp (type 1) (E. coli) Nucléoporine 145 (Homo sapiens) DmpA am inopeptidase (O. anthropi) Lactoferrine (Homo sapiens) Muréine carboxypeptidase (P aeruginosa) Rhom boïde-1 (Drosophila melanogaster)
Clans des protéases à sérine SB SC SE SF SH SJ
Subtilisine Carlsberg (B. licheniformis) Sérine carboxypeptidase D ( T. aestivum) DD-carboxypeptidase B (S. lividans) Protéine UmuD (E. coli) Cytomégalovirus assembline (Herpesvirus) Lon-A peptidase (E. coli)
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Clivage Substrat
Figure 1.4 N om enclature de S chechter et Berger Un substrat est clivé par la rupture d ’un lien peptidique par l’enzyme. À partir du site de clivage, les acides aminés du substrat sont identifiés PI, P2...Pn en direction N-terminale et ceux en direction C-terminale, P I’, P2’,...Pn’. Les sous-sites de la protéase qui accommodent les chaînes latérales des acides aminés du substrat sont numérotés SI, S2...Sn et SI’, S2’...Sn’ en suivant la même nomenclature. autant chez les procaryotes que chez les eucaryotes (Hedstrom, 2002). Elles sont caractérisées p a r leur capacité à cliver des liens p e p tid iq u e s à l’in té rie u r de p ro téin es en u tilisan t u ne sérine com m e acide am iné n u cléo p h iliq u e au niveau de le u r site actif. En fonction de leur structure tridim ensionnelle, elles se divisent en deux grandes catégories : celles ressem blant à la chym otrypsine et celles ressem blant à la subtilisine (M adala e ta l, 2010). Chez l'hum ain, elles so n t responsables de plusieurs fonctions physiologiques tels la digestion, la réponse im m unitaire, la coagulation du sang et la reproduction (Hedstrom, 2002). D ans la classification MEROPS, elles so n t groupées e n 15 clans se divisant e n 49 familles distinctes (Rawlings, M orton et Barrett, 2006). C ependant, il existe des différences significatives dans la distribution de ch acu n des clans à travers les espèces. Par exemple, les protéases du clan PA sont très a b o n d a n t chez les eucaryotes, m ais rare d an s le génom e des procaryotes et des plantes. Chez les vertébrés, de n o m b reu ses p rotéases d u clan PA y sont retrouvées et celles-ci sont responsables d ’une variété de processus extracellulaires.
1.2.2.1 M écanisme catalytique Le m écanism e catalytique des protéases à sérine est assuré par u n e triade catalytique. Celle-ci se situe à l’intérieur du site actif de l’enzym e, en d ro it où la catalyse se p ro d u it. À quelques exceptions près, cette triade est conservée chez l’ensem ble des protéases à sérine. Elle est constituée d ’u n e histidine (His), d ’u n e sérine (Ser) et d 'u n acide asp artiq u e (Asp). Bien que ces trois résidus soit éloignés les uns des autres au niveau de la séquence en acides am inés de l’enzyme, le repliem ent de la protéine fait en sorte q u ’ils se retrouvent à proximité au sein du site actif. Chacun de ces résidus se retrouve à jo u er u n rôle essentiel dans l’action catalytique de l’enzyme (Neitzel, 2010).
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Lors de la protéolyse, u n e série de m écan ism es o rd o n n és se p ro d u it et provoque la génération de plusieurs interm édiaires. D ’abord, le su b strat polypeptidique se lie au niveau du site actif de la pro téase de façon à ce que le carb o n e d u g ro u p e m e n t carbonyle d u lien scissile soit p o sitio n n é à proxim ité d e la sérine n u cléo p h iliq u e (figure 1.5-1). L’azote de l’histidine accepte l’hydrogène p ro v en an t du g roupe -O H de la sérine, ce qui p e rm e t la création d’u n lien en tre l’oxygène de la ch aîn e latérale de la sérin e et le carb o n e du groupem ent carbonyle. Cette nouvelle liaison provoque le déplacem ent de la paire d ’électrons provenant du double lien entre le carb o n e et l’oxygène d u g ro u p e m e n t carbonyle vers l’oxygène d u groupem ent, ce qu i form e l’interm éd iaire té tra éd riq u e (figure 1.5-2). Ensuite, afin de rétablir la charge neutre de 1’histidine, il y a transfert d ’u n proton de l’histidine à l’azote de la liaison peptidique (figure 1.5-3). Les électrons qui s’é taien t déplacés vers l’oxygène d u g ro u p e m e n t carbonyle se red ép lo ien t p o u r recréer la d o u b le liaison (figure 1.5-4), ce qui perm et le clivage du lien peptidique et la libération d u pro d u it en po sitio n am ino-term inale (figure 1.5-5). À ce point, u n e m olécule d ’eau attaq u e le carb o n e d u g ro u p em en t carbonyle, ce qui cause u n déplacem ent des électrons du double lien vers l’oxygène, ce qui lui procure une charge négative (figure 1.5-6). L’ensem ble de cette réaction est c o ordonné p ar l’azote de l’histidine, qui accepte un proton provenant de la molécule d ’eau et p erm et la form ation d’u n seco nd interm édiaire tétraédrique. D ans la réactio n finale, le lien créé lors de la prem ière étap e entre la sérine de la triade catalytique et le carb o n e du g ro u p e m e n t carbonyle se déplace p o u r a tta q u e r l’hydrogène q u e l’histid in e vient to u t juste d ’acq u érir (figure 1.5-7). Le carbone du g ro u p em en t carbonyle, m a in te n a n t déficient en électron, reform e u n lien double avec l’oxygène, ce qui a p o u r c o n séq u en ce d ’expulser la p a rtie carboxy-term inale du peptide (figure 1.5-8) (Neitzel, 2010). Au cours de cette réaction, l’acide a sp artiq u e de la triade catalytique perm et d ’orienter adéquatem ent l’histidine relativem ent à la sérine (Polgâr, 2005).
1.2.2.2 Spécificité enzym atique Les protéases à sérine qui p o ssè d e n t u n e stru ctu re sem blable à la chym otrypsine so n t caractérisées par u n e con form ation trid im en sio n n elle distinctive co n sista n t en deux dom aines barils-béta qui convergent au niveau du site actif. Ces enzymes peuvent ensuite être classés par leur spécificité envers leurs substrats en trois types distincts : ceux ressem blant à la trypsine, à la chym otrypsine ou à l’élastase (Ovaere e ta l, 2009). Les protéases sem blables à la trypsine clivent des liaisons peptidiques après un acide am iné chargé positivem ent (Lys ou Arg) (Evnin, V âsquez et Craik, 1990). Le résidu situé à la b ase de la p o c h ette SI de l’enzym e, généralem ent u n acide asp artiq u e ou g lutam ique chargé négativem ent, est resp o n sab le de cette spécificité (Evnin, V âsquez et Craik, 1990). Pour les p ro téases sem blables à la chym otrypsine, leur spécificité est davantage p o u r des résidus hydrophobiques de grandeur m oyenne ou large com m e la tyrosine, la p h én y lalan in e et la leucine car leur p o c h e tte SI est davantage hydrophobique q u e celle des p ro téases sem blables à la trypsine (H ung et
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4-c*
Liaison du substrat
.A s p
NH
A sp] Hisj
S e r,
H isj
©
S er
© Formation de l'intermédiaire tétraédrique
Transfert de proton de l'histidine Aspj
A s| Hisj
NH
S er
H is |
©
S er
NH
©
Clivage de la liaison C-N
■ nh2
Relarguage du produit N-terminale A si
A spj Hisf
S er
NH
H is
©
S er
NH
© Attaque nucléophile par l'eau . Relarguage du produit C-terminale
A s|
As S e r/
H isl
©
Ser,
NH
© Figure 1.5 M écanism e catalytique des protéases à sérine
(1) Un substrat entre dans le site actif à proximité de la sérine de la triade catalytique. (2) L’azote de l’histidine accepte l’hydrogène du groupe -OH de la sérine et favorise la création d’un lien entre l’oxygène de la sérine et le carbone du groupement carbonyle. Cette action conduit au déplacement vers l’oxygène de la paire d’électrons provenant du double lien du groupement carbonyle. (3) Un proton est ensuite transféré de l’histidine à l’azote de la liaison peptidique afin de rétablir la change neutre de l’histidine. (4) Les électrons de l’oxygène du groupement carbonyle se redéploient pour recréer la double liaison, ce qui permet le clivage du lien peptidique et la libération du produit en position amino-terminale (5). (6) Une molécule d’eau attaque le carbone du groupement carbonyle et provoque le déplacement des électrons du double lien vers l’oxygène, réaction coordonnée par l’azote de l’histidine qui accepte un proton provenant de la molécule d’eau. (7) Le lien entre la sérine de la triade catalytique et le carbone du groupement carbonyle se déplace pour attaquer l’hydrogène que l’histidine vient tout juste d’acquérir. Le carbone du groupement carbonyle, m aintenant déficient en électron, reforme un lien double avec l’oxygène, ce qui a pour conséquence d ’expulser la partie carboxy-terminale du peptide (8).
11
H edstrom , 1998). Finalem ent, les protéases sem blables à l’élastase p o ssè d e n t une p o ch ette SI plus p etite que les protéases ressem b lan t à la trypsine o u à la ch y m o try p sin e, ce qui favorise u n e préférence p o u r des acides am in és d e p etite d im en sio n co m m e l’alanine, la glycine et la valine (Hung et H edstrom , 1998). Les protéases à sérine qui p o ssè d e n t u n e stru ctu re sem blable à la subtilisine so n t retrouvées uniquem ent chez les procaryotes (Bryant etal., 2009). Elles sont structurellem ent no n reliés à celles sem blables à la chym otrypsine, m ais elles utilisent le m êm e type de triade catalytique au niveau de leur site catalytique. Cependant, ces protéases ne possèdent aucune spécificité enzym atique, elles sont davantage des enzym es spécialisées d an s la dégradation des protéines (Bryant etal., 2009).
1.2.2.3 Les protéases à sérine de la fam ille S1 Les protéases à sérine a p p a rte n a n t au clan PA font p arties de l’u n des g ro u p es d 'e n zym es les m ieux décrits (Page et Cera, 2008). Ce clan c o n tien t des p ro té a se s à sérin e et à cystéine p o sséd an t u n iq u e m e n t u n e activité en d o p ep tid ase. La m ajo rité des p ro téases d e ce clan sont c ep e n d a n t des protéases à sérine et font p arties de la fam ille SI. C ette famille, qui regroupe des protéases ressem b lan t à la chym otrypsine, est la p lu s large de to u tes les fam illes de protéases, a u ta n t p a r le n o m b re de p ro téin es ay an t été séq u e n c ée s q u e p a r la diversité de leur activité catalytique (Rawlings et Barrett, 1993). Les enzym es de cette famille possèdent la triade catalytique His, Asp et Ser. Trois principaux types d ’activité existent dans cette famille : celle ressem blant à la trypsine, à la chym otrypsine et à l’élastase. La fam ille SI se divise en six sous-fam illes de p ro téases à sérin e (S1A-S1F) q u i sont p h ylogénétiquem ent distinctes, m ais qui p a rta g e n t u n e stru ctu re c o m m u n e. C h acu n e d e ces sous-fam illes possède u n e p ro téase m odèle : la chym otrypsine A p o u r SIA, la glutam yle pep tid ase p o u r S1B, la DegP p ep tid ase p o u r SIC, la lysyle p e p tid a se p o u r S1D, la streptogrisine A p o u r S1E et la protéase à sérine de l’astrovirus pour SI F. De to u tes ces sousfamilles, SIA est celle la plus représentée, elle inclut plus de 67 % des p ro téases de la famille SI. Les protéases de SIA sont im pliquées d an s u n e variété d e processus extracellulaires et présen ten t u ne distribution qui est restreinte d ans les plantes, les procaryotes et les archées (Page et Cera, 2008). Ces protéases contrôlent u n e variété de processus cellulaires en clivant sélectivem ent différents substrats afin d ’influencer le c o m p o rtem en t de la cellule (Ramsay etal., 2009). Par exemple, elles so n t im pliquées d an s les p rocessus d e co ag u latio n d u sang (throm bine), de la digestion (trypsine) et de la cicatrisation (plasmine) (Ramsay etal., 2009). Elles ont été principalem ent identifiées en ta n t q u ’enzym es sécrétés, m ais l’identification et la caractérisation de l’un de ses m em bres qui possède un dom aine transm em branaire, l’hepsine (Leytus e ta l., 1988), a provoqué l’ém ergence d ’u n groupe d e p ro téases stru ctu rellem en t distinctes, les protéases à sérine ancrées à la m em b ran e cellulaire (Ramsay et al., 2009).
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1.2.2.4 Les protéases à sérine ancrées à la m em brane cellulaire Les protéases à sérine an crées à la surface cellulaire diffèrent des enzym es sécrétés au niveau de leurs fonctions biologiques. En effet, au lieu d ’exercer le u r rôle catalytique dans une région distante dans le m ilieu extracellulaire, ces enzym es catalysent des réactions directem ent à la m em brane plasm ique (Netzel-Arnett e ta l, 2003). La présen ce de protéases à cet endroit a été identifiée co m m e jo u a n t u n rôle essentiel dans l’in teractio n des cellules avec leur e n v iro n n em en t (Ramsay e t a l, 2009) en rég u lan t différents p ro cessu s d o n t la tra n sd u ctio n des stim uli extracellulaires à travers la m em b ran e, la relâche de facteurs de croissance ainsi que l’interaction avec les cellules avoisinantes et les p ro téin es d e la m atrice extracellulaire (N etzel-Arnett et a l, 2003). Ces enzym es o n t la p ro p rié té d ’être an crés à la surface cellulaire à l’aide d ’u n e exten sio n h y d ro p h o b e située d a n s leu r région carboxy(transm em branaire de type I) ou am ino-term inale (transm em branaire de type II) qui perm et un e o rientation extracellulaire d u d o m ain e catalytique (Ramsay eta l., 2009). U n au tre type d ’ancrage à la surface cellulaire, qu i n e nécessite au cu n e région tran sm em b ran aire, se fait p a r u n lien glycosylphosphatidylinositol (GPI). De ces différents types d e p ro téases transm em branaires, celles de type II so n t les p lus ré p a n d u e s avec 17 m em b res identifiées chez l’h u m ain (Szabo et Bugge, 2011).
1.3 Les protéases à sérine transm em branaires de type II L’analyse au d é b u t d u no u v eau m illénaire des bases d e d o n n é es d u gén o m e et des séquences exprim ées a perm is d ’id en tifier u n e nouvelle fam ille de p ro téases à sérine transm em branaires de type II (TTSF) type II transm em brane serine proteases) (H ooper etal., 2001). Les principales caractéristiques de ces enzym es sont la présence d ’u n e co u rte région cytoplasm ique et d ’u n do m ain e tran sm em b ran aire d an s le u r région am in o -term in ale et d ’un ectodom aine complexe qui p eu t contenir u n assortim ent de u n à dix dom aines de neuf types différents do n t u n dom aine protéase à sérine de type chym otrypsine (SIA) en position carboxy-term inale (figure 1.6) (Szabo e ta l, 2003). 1.3.1 Classification Chez l’hum ain, les 17 TTSP identifiées se divisent en quatre sous-fam illes en fonction de l’analyse phylogénétique de leur d o m ain e p ro téase à sérine, de la c o m p o sitio n d e leur ecto d o m ain e et de la localisation ch ro m o so m iq u e de leur gène (figure 1.6 et tab le au 1.2) (Szabo et al., 2003). Ces sous-fam illes so n t celles des HAT/DESC, hepsine/TM PR SS, des m atriptases et de la corine. Outre d ’un dom aine catalytique protéase à sérine, leur ectodom aine est com posé d ’u n agencem ent de six dom aines différents : SEA (sea urchin sperm protein/enteropeptidase/agrin), SRCR {scavenger receptor cysteine-rich), LDLRA (low-density lipoprotein receptor class A), CUB {Cls/Clr, urchin em bryonic grow th factor, bone m orphogenetic p ro tein -1), MAM ( m eprin/A5
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Sous-famille HAT/DESC HAT
HATL4
DESC1
HATL5
« ?
HATL1
Sous-famille Hepsine/TMPRSS TMPRSS2
sIS ?2
N
S8 HI
S ÏK ? ?
TMPRSS3
H
as
8 s
Spinesine
N
Hi
ses sï
23 H|
TMPRSS4
n
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.- n i
Hepsme
Sci RSQ Entéropeptidase
«ss sa ■JH*
MSP
Si IS 6î 4M -i-J
3à
■-ffl
Sous-famille Matriptase
S3
S3 §5 3$ §3
Matriptase
4HHM
gpi
Matriptase-2
NHi!
4HMf
Si I
3s
4>—il
Matriptase-3
2 2s -f H
Polysérase-1
Sous-famille Corine 1 38 Si SS ï
5 is ü H
HMHHH
Corine
Liste des domaines Domaine transm em branaire
Domaine CUB
Domaine IMAM
Domaine SRCR
Dom aine SEA
Domaine protéase à sérine (actif)
Domaine LDLRA
Domaine Frizzled
Domaine protéase à sérine (inactif)
Figure 1.6 R eprésentation sch ém atiq u e des 17 TTSP hum aines Représentation schématique des domaines des 17 TTSP humaines. Les protéases sont divisées en sousfamilles en se basant sur l’analyse phylogénétique de leur domaine protéase à sérine, de la composition de leur ectodomaine et de la localisation chromosomique de leur gène. L’identification des domaines est basée sur les prédictions de la base de données UniProtKB/Swiss-Prot (http ://www.uniprot.org) ainsi que sur la littérature publiée. Les nombres représentent les limites des différents domaines.
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Tableau 1.2 Liste des TTSP hum aines TTSP
Noms alternatifs0
Nom gène
Distribution cellulaire6
cer, bro, oes, pro, pe, ig, me, es, tes, la, tr, ves epd, pro, pe, gs, tes, la n.d. n.d. n.d.
Sous-famille HAT/DESC HAT
TMPRSS11D
TMPRSS11D
DESC1 HATL1 HATL4 HATL5
TMPRSS11E TMPRSS11A, HESP, ECRG1 TMPRSS11F TMPRSS11B
TMPRSS11E TMPRSS11A TMPRSS11F TMPRSS11B
Sous-famille Hepsin/TMPRSS TMPRSS2 TMPRSS3
PRSS10 TADG-12
TMPRSS2 TMPRSS3
TMPRSS4 Entéropeptidase MSPL Spinesine Hepsine
MT-SP2, CAPH2 TMPRSS15, entérokinase, PRSS7 TMPRSS13 TMPRSS5 TMPRSS1
TMPRSS4 TMPRSS15 TMPRSS13 TMPRSS5 TMPRSS1
co, rn, fo, pou, pa, pro, tr co, coc, coe, rn, fo, pou, ova, pa, pl, pro, ig, rat, tes, thm ves, co, oes, rn, ig, es duo pou, pa, pl, pro cer, m e rn, fo, pou, pa, hyp, pro, thm, thr
Sous-famille Matriptase M atriptase
MT-SP1, TADG-15
prostamine,
PRSS14,
ST14
Matriptase-2 Matriptase-3
TMPRSS6 TMPRSS7
TMPRSS6 TMPRSS7
Polysérase-1
TMPRSS9
TMPRSS9
bro, co, epd, oes, veb, ori, fjp, m, gmm, mon, en, tpf, pl, pro, gs, ig, pe, es, vs, de, la, tr, thm , ves, ur, ut rn, fo, en, ut cer, epd, yeu, ova, pro, gs, pe, tes, ut cer, coe, rn, fo, pl, msq
TMPRSS10
os, coe
Sous-famille Corme Corine
TMPRSS10, Heart-specific serine proteinase ATC2, Pro-ANPconverting enzyme
° Selon UniProt (Consortium, 2012). h Niveaux d’ARNm confirmés expérimentalement dans différents tissus. Les expressions les plus fortes sont m arquées en gras, bro, bronchioles ; cer, cerveau ; en, cavité nasale ; co, côlon ; coc, cochlée ; coe, cœ ur ; de, dents ; duo, duodénum ; epd, épididyme ; es, estomac ; fo, foie ; fp, follicules pileux ; gmm, glandes m am m aires ; gs, glandes salivaires ; hyp, hypophyse ; ig, intestin grêle ; la, langue ; me, moelle épinière ; mon, monocytes ; msq, muscles squelettiques ; oes, œsophage ; ori, oreille interne ; os, os ; ova, ovaires ; pa, pancréas ; pe, peau ; pl, placenta ; pou, poum on ; pro, prostate ; rat, rate ; m , reins ; tes, testicules ; thm, thymus ; thr, thyroïde ; tpf, trom pes de Fallope ; tr, trachée ; ur, urètre ; ut, utérus ; veb, vésicule biliaire ; ves, vessie ; vs, vésicules séminales ; yeu, yeux ; n.d., non disponible. Adapté de Szabo et Bugge (2008).
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antigen/receptor protein phosphatase mu) et frizzled (figure 1.6). Bien que le rôle du dom aine SEA p ré sen t chez les TTSP n e soit p as co n n u , ce d o m a in e est g én érale m e n t associé à des p ro téin es h a u te m e n t glycosylées qu i c o n tie n n e n t des glucides liés p a r des liaisons Oglycosidiques tel le sulfate d ’h ép aran e (Bork et Patthy, 1995). Ceux-ci p o u rraie n t réguler o u assister à la liaison avec les groupes fo n ctio n n els d e glucides p ré sen ts su r des p ro téin es de leu r voisinage (Bork et Patthy, 1995). Ces d o m ain es so n t aussi retrouvés clivés chez de n o m b reu ses protéines tran sm em b ran aires (Abe, Fukuzaw a et H irose, 2002) p o u v an t générer u n e alliance ligand-récep teu r lo rsq u e les so u s-u n ités clivées se réasso cien t p o u r conduire à u n e cascade signalétique (W reschner et a l, 2002). Dans le cas d u d o m ain e SRCR, sa fonction biologique précise reste à être d éterm in ée, m ais des évidences su ggèrent q u ’il pourrait perm ettre des interactions p ro téin e-p ro téin e, h o m o - ou hétérotypiques, ainsi que la reconnaissance des m otifs m oléculaires associés aux pathogènes (PAMP) dans la défense im m unitaire (M artinez et a l, 2011). Pour ce qui est des do m ain es LDLRA, ce so n t des dom aines riches en cystéines d ’environ 40 acides am inés et qui possèdent u n m otif conservé D/NXSDE d an s lequel les résidus acide a sp a rtiq u e et acid e glutam ique so n t im pliqués d ans la liaison du calcium . Ces d o m ain es sem b leraien t jo u e r des rôles d an s la liaison, l’intern alisatio n et la m a tu ra tio n des p ro téin es qu i p o ssè d e n t ces d o m a in e s (H orn et a l, 1998; Cam et Bu, 2006; Parkyn et a l, 2008). Les do m ain es CUB sont p resq u e exclusivem ent retrouvés chez des protéines extracellulaires ou associées à la m em b ran e cellulaire (Bork et B eckm ann, 1993). Ces dom aines so n t im pliqués d an s l’ad h ésio n in term o lécu laire (Bork et Beckm ann, 1993). Par exemple, il a été d ém o n tré que la cubuline, qui co n tien t 27 dom aines CUB, p e u t se lier à la transferrine, à l’hém oglobine, au facteu r in trin sè q u e d e la vitam ine Bi2 , à l’apolipoprotéine Ai et à l’HDL (high-density lipoprotein) (Amsellem et a l, 2010). Les dom aines MAM sont retrouvés dans la région extracellulaire de diverses protéines (Beckmann et Bork, 1993) et sem bleraient posséder une fonction adhésive en p erm ettan t la form ation de com plexes hom om ériques (Ishm ael et a l, 2001). Les d om aines frizzled, eux, so n t retrouvés chez des protéines qui fo n ctio n n en t co m m e ré c e p te u r de surface cellulaire p o u r les W nt, des protéines qui activent diverses voies de signalisation im pliquées d an s le développem ent em bryogénique, la différenciation et la polarité cellulaire (Logan et Nusse, 2004). Ce dom aine riche en cystéines est présent dans la région extracellulaire d e ces p ro téin es et est im pliqué dans la liaison avec W nt (Bhanot et a l, 1996; Lin et a l, 1997). La plus grande sous-fam ille de TTSP est celle des HAT/DESC. Celle-ci co m p ren d HAT (h u m a n airw ay trypsin-like protease), DESC1 (differentially expressed in sq u a m o u s cell carcinoma-1), HATL (HAT-like) -1, -4 et -5. De to u tes les TTSP, les m em b res d e cette sous-fam ille p ré sen te n t le plus sim ple e cto d o m ain e e n p o sséd an t se u le m e n t u n d o m ain e SEA unique. Tous les gènes qui c o d en t p o u r les m em b res de cette sous-fam ille so n t situés dans u n m êm e regroupem ent de gènes, a u ta n t chez la so u ris que chez l’h u m a in , ce qui suggère q u ’ils originent de la duplication d ’u n gène ancestral com m un (H obson etal., 2004).
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La sous-fam ille hepsine/TMPRSS se com pose de sept m em bres co m p ren an t l’hepsine, TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4, la spinesine, MSPL et l’entéropeptidase. Tous possèdent dans leur ectodom aine u n dom aine SRCR seul (spinesine et hepsine) ou précédé p a r u n dom aine LDLRA p o u r TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4 et MSPL. L’en téro p ep tid ase fait exception, elle possède u n ensem ble de dom aine SEA, LDLRA, CUB et MAM. La sous-fam ille des m atriptases possède q uatre m em bres très similaires, la m atriptase, la m atriptase-2, la m atriptase-3 ainsi q u ’u n e p ro té in e ayant une configuration de l’ecto d o m aine différente, la polysérase-1. Les m a trip ta ses p o ssè d e n t un d o m ain e SEA, d eu x CUB et deux (m atriptase-3), trois (m atriptase-2) o u q u atre (m atriptase) d o m ain es LDLRA dans leur ectodom aine. La polysérase-1 est co n stitu ée d ’u n d o m ain e LDLRA, deux d o m ain es catalytiques actifs et u n inactif. La sous-famille de la corine est la seule à posséder q u ’u n seul m em bre. La corine diffère des autres TTSP p a r son ectodo m ain e co m p o sé de deux dom aines frizzled, sep t d o m ain es LDLRA et u n dom aine SRCR ainsi que par son dom aine catalytique, qui est davantage relié à des protéases à sérine sécrétées (Netzel-Arnett etal., 2003), ce qui laisse croire q ue les TTSP peuvent avoir évoluer à p a rtir d ’au m oins d eu x gènes ancestraux différents p a r évolution convergente (Szabo et Bugge, 2008).
1.3.2 Propriétés biochim iques Les TTSP sont synthétisés d ’abord sous la form e d ’u n e chaîne sim ple catalytiquem ent inactive (zymogène). Cette form e nécessite u n e activation p a r un clivage suivant u n résidu b asique (Arg ou Lys) p résen t dans u n m o tif d ’activation p ré c éd a n t im m é d ia te m e n t le dom aine catalytique (figure 1.7). Le d o m ain e catalytique reste associé à la m e m b ra n e suite à l’activation à l’aide d ’un p o n t disulfure qui relie le p ro d o m ain e et le d o m ain e catalytique (Hooper et al., 2001). Plusieurs TTSP, dont la m atriptase (Takeuchi etal., 2000), la m atriptase2 (Velasco e t a l , 2002), l’h ep sin e (Qiu e t a l , 2007), TMPRSS2 (Afar e t a l, 2001), TMPRSS3 (Guipponi e ta l, 2002), TMPRSS4 (Andreasen e ta l, 2006) et la neurobine (souris) (Stallmach et Gloor, 2008) possèdent la caractéristique de s’autoactiver in vitro. Cela suggère que plusieurs TTSP peu v en t fo n ctio n n er com m e in itiateu r de cascades protéolytiques. Ce m écan ism e d ’autoactivation n’est pas identifié, mais im pliquerait potentiellem ent l’oligom érisation (Lee etal., 2007; Bugge, Antalis et Wu, 2009). Les différents dom aines des TTSPs p euvent aussi être im pliqués dans leur biosynthèse. En effet, la p résen ce de la qu eu e cytoplasm ique p o u rrait c o n trib u er au routage des TTSP à la m em b ran e plasm ique. En effet, certain es TTSP co n tie n n en t des sites c o n se n su s de p hosphorylation d an s leur région cytoplasm ique qu i p o u rraien t avoir u n im p act su r leur régulation. Pour ce qui est des dom aines extracellulaires, ceux-ci sem blent être critiques pour la localisation cellulaire, l’activation, l’inhibition et la spécificité de substrat (Szabo et Bugge,
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2008). Par exemple, la capacité de la corine à convertir le pro-ANP en ANP est d ép en d an te du dom aine frizzled et des dom aines LDLRA 1 à 4 (Knappe e t a l , 2003). La m atrip tase ainsi q ue l’en téro p ep tid ase su b issen t aussi u n clivage p ro téo ly tiq u e au niveau de le u r d o m a in e SEA. Ce clivage se produirait p ar u n e hydrolyse sp o n tan ée causée par u n stress conform ationnel, ce qui suggère la présence de ce processus chez tous les TTSP possédant ce dom aine (Szabo et Bugge, 2008). De plus, le relargage de l’ecto d o m ain e des TTSP de la surface cellulaire est fréquent, ce qui co n stitu e un m écan ism e p a r lequel les TTSP p euvent exercer leu r activité protéolytique dans l’espace péricellulaire (Szabo et Bugge, 2008). L’activité catalytique des TTSP est régulée p a r des inhibiteurs de protéases endogènes, plus spécifiquem ent les inhibiteurs co n ten an t u n dom aine Kunitz et les serpines. Par exemple, HAI-1, u n inhibiteur transm em b ran aire de type Kunitz, est im pliqué d an s l’in h ib itio n de la m atriptase (Lin et al., 1999) et de l’hepsine (Kirchhofer etal., 2005) et la m atrip tase est aussi retrouvée dans le lait hum ain en com plexe avec des serpines sécrétées d o n t l'an tith ro m b in e III, l'ai-antitrypsine et l’a2-antiplasm ine (Tseng eta l., 2008). 1.3.3 Fonctions physiologiques Bien que très p eu de fonctions aient été identifiées p o u r les TTSP, certain es évidences suggèrent qu’elles joueraient des rôles im portants dans une variété de fonctions biologiques. La toute prem ière fonction identifiée pour u n e TTSP a été attribuée à l’entéropeptidase. Cet enzym e est u n élém en t essentiel au p ro cessu s de digestion (Kunitz, 1939). Elle est exprimée dans la m em brane de la bordure en brosse du duodénum , endroit où elle convertit le trypsinogène p a n créa tiq u e en trypsine. C ette fo n ctio n est essentielle à l’in itiatio n des réactions protéolytiques des enzym es digestives d a n s l’in testin grêle (Bugge, Antalis et Wu, 2009). Les tissus épithéliaux exprim ent une grande variété de TTSP d o n t la HAT, TMPRSS2 et la m atriptase. La présence de ces enzym es sem ble assurer l’hom éostasie de ces tissus. HAT est exprim ée dans l’épithélium de la voie respiratoire et p e rm e ttra it d ’acco m p lir p lusieurs fonctions dont la fibrigénolyse, la réponse inflam m atoire via l’activation d u récepteur couplé aux p rotéines G (RCPG) PAR-2 (protease activated receptor 2) et l’a d h éren c e et m otilité cellulaire p a r le clivage du récep teu r de l’u ro k in ase (uPAR, urokinase-type plasm inogen activator receptor) (Chokki etal., 2005; Szabo eta l., 2008; Kato etal., 2012). TMPRSS2 a été identifié com m e régulateur du co u ran t sodique épithélial a u niveau d u p o u m o n e n clivant le canal sodique épithélial (Kim et a l, 2006) e t au niveau de la réponse in flam m ato ire de la prostate via le clivage de PAR-2 (D onaldson etal., 2002). Finalem ent, la m a trip tase jo u erait u n rôle im p o rtan t dans la différenciation ép id erm ale term inale, la fo rm atio n de la barrière épiderm ale e t le développem en t des follicules pileux (Bugge, Antalis e t Wu, 2009; D ésilets etal., 2008).
18
Forme zymogène
Form e clivée
Clivage au dom aine SEA
«fi|T
o
il
•(HHH
Extracellulaire Cytoplasme A utoactivationj
o>
Form e activée
Forme extracellulaire R elargage de la su rface cellulaire
■ f 4MMM^
4X
If
Domaine CUB 2222
Domaine SEA
Domaipe protéase à senne
HP' ^
p
Domaine LDLRA
Figure 1.7 Biosynthèse des TTSP Représentation schématique de la biosynthèse de la matriptase. La matriptase est synthétisée sous une forme zymogène inactive. Un clivage au niveau du domaine SEA (Gly149) se produit dans la voie de sécrétion (1). L’enzyme est par la suite activée par un clivage autocatalytique (Arg614) (2). La matriptase est finalement relarguée de la surface cellulaire (4).
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La corine est aussi un élém ent im portant d ans la régulation du volum e et de la pression sanguine (Jiang et a l, 2011). En effet, la corine est responsable de la conversion du proANP en sa form e active, l’ANP (Atrial natriuretic peptide) (Yan etal., 2000). C ette horm one, sécrétée par les cardiom yocytes atriaux, favorise la p ro d u c tio n d ’urine, l’excrétion d u so d iu m ainsi que la dilatation des vaisseaux sanguins (Yan etal., 2000). La m atriptase-2, q u an t à elle, a to u t récem m en t été associée à u n rôle im p o rtan t dans la régulation du fer. La section 1.4 traitera de ce rôle.
1.3.4 Im plications pathologiques Certaines TTSP jouent des rôles im portants dans le développem ent de certaines p ath o logies. Ces dernières incluent, en tre autres, la pro g ressio n d e la tu m o rig én èse, l’activ atio n des virus de l’influenza, la surdité et l’aném ie.
1.3.4.1 Progression de la tum origenèse La croissance tum orale p u is la fo rm atio n d e m é ta sta ses sont initiées et m a in te n u es par différentes voies de signalisation qui co n trô len t la dynam ique d u cytosquelette dans les cellules tum orales ainsi que par la dégradation des jon ctio n s intercellulaires et de la m atrice extracellulaire (Friedl et Alexander, 2011). La capacité dégradative de ces cellules est favorisée par l’exploitation de l’activité de protéases dérégulées. Plusieurs TTSP d o n t la m atriptase, la m atriptase-2, l’hepsine, TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4 et DESC1 so n t dérégulées d an s de nom breuses cellules tum orales (Choi etal., 2009; W ebb etal., 2011). La m atriptase est retrouvée en surexpression d an s différents types de tu m eu rs é p ith é liales, com m e ceux du sein, du côlon, d u foie, d u p o u m o n , d u m ésothélium , des ovaires et de la pro tate et est considérée com m e u n b io m a rq u e u r p o ten tiel p o u r le d iag n o stiq u e et le prognostique (Uhland, 2006; Szabo et Bugge, 2008; List, 2009; Jin eta l., 2006a; Tanim oto etal., 2005; Kôbel etal., 2008; Tsai etal., 2008). La m atriptase serait capable de prom ouvoir le développem ent et la progression du cancer en activant le précurseur de l’uPA (urokinase-type plasminogen activator) et de l’HGF {hepatocyte growth factor), tous les deux im pliqués dans la prom otion de la croissance tum orale invasive (Takeuchi etal., 2000; Lee, Dickson et Lin, 2000; U hland, 2006). De plus, la m atrip tase p o u rrait favoriser l’invasion tissulaire en m o d u la n t l’adhésion cellulaire p a r la d ég rad atio n d e co m p o san tes de la m atrice extracellulaire (Jin etal., 2006b) et en activant PAR-2, u n régulateur de l’inflam m ation et de l’adhésion cellulaire (Bocheva e ta l, 2009). U ne altération de l’expression de la m atrip tase-2 d an s le cancer a été re p o rté e dans plusieurs études. C ertaines o n t d é m o n tré que les niveaux d ’expression de la m atrip tase-2 étaient augm entés chez des cellules tum orales (Odet, Verot et M agueresse-B attistoni, 2006)
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et dans le carcinom e des cellules canalaires du sein (Overall e t a l , 2004). Par contre, d ’autres étu d es o n t d é m o n tré q u 'u n e au g m en tatio n de l’expression de la m atrip tase-2 ré d u it le pouvoir invasif ainsi que la m otilité des cellules tum orales (Sanders et a l, 2008) et est associée à u n pronostic favorable chez les p atien ts (Parr e t a l , 2007). Il y a peu d ’inform ations sur les voies de signalisation par lesquelles la m atriptase-2 exerce ses fonctions dans la progression de la tum origénèse, mais il est suggéré que l’interaction entre la m atriptase-2, l’hém ojuvéline et la signalisation par BMP p eut constituer un m écanism e potentiel p ar lequel la m atriptase-2 pourrait exercer ses effets sur les cellules cancéreuses (Sanders etal., 2010). L’hepsine est retrouvée en surexpression dans les cancers de la prostate, de l’ovaire, de l’endom ètre et du rein (Webb e t a l , 2011). Elle est aussi considérée com m e u n bio m arq u eu r p o tentiel p o u r la détectio n d u cancer de la p ro sta te et est associée à u n p ro n o stiq u e défavorable pour les patients (Webb et a l, 2011). Dans la progression d u cancer, elle jouerait un rôle dans la m igration et l’invasion des cellules cancéreuses (Holt e t a l , 2010) en cau san t une désorganisation de la m em brane basale p ar l’activation des précurseurs d u HGF (Herter e ta l, 2005) et de l’uPA (Moran e ta l, 2006) ainsi que p ar le clivage de la lam inine-332 (Tripathi e t a l , 2008). Plusieurs études ont aussi soulignées l’im plication potentielles de TMPRSS2, TMPRSS3, TMPRSS4 et DESC1 dans la progression tum orale. TMPRSS2 a été identifié en surexpression au niveau de la p ro sta te et po sséd erait la capacité d e cliver PAR-2 et ainsi c o n trib u e r à la progression tum orale (Wilson e t a l , 2005). TMPRSS3 est retrouvé en surexpression d an s les stades cliniques avancés du can cer de l’ovaire et po u rrait servir com m e cible p o ten tiel p o u r la thérapie ou en ta n t que m arq u eu r p o u r le diagnostique (Sawasaki e t a l , 2004). TMPRSS4 est im pliqué au niveau des cellules cancéreuses du pancréas d ans la form ation de m étastases et dans l’invasion tum orale. Son niveau d ’expression corrèle avec son potentiel m étastatique (Wallrapp e t a l , 2000). Finalem ent, u n e d im in u tio n de l’expression de DESCl est observée dans les cancers épiderm oïdes de la tête et du cou (Lang et Schuller, 2001; Sedghizadeh et a l, 2006).
1.3.4.2 Activation des virus de l’influenza La capacité de l’hém agglutinine (HA) des virus de l’influenza à m édier la fusion entre la m em b ran e virale et cellulaire lors de l’en trée d u virus d an s la cellule d é p e n d du clivage d e HA (HA0) en deux sous-unités HAÏ et HA2 qui restent reliées p ar un p o n t disulfure (Bôttcher e t a l , 2006). Ce clivage se produit, chez les m am m ifères, p ar u n e protéase de l’h ô te présen te dans les voies respiratoires, m ais chez l’hum ain, cette protéase n’a pas encore été identifiée à ce jour (Bôttcher et a l, 2006). Chez l’hum ain, plusieurs TTSP so n t exprim ées au niveau des voies respiratoires (HAT, TMPRSS2, TMPRSS4 e t MSPL) e t il a été d ém o n tré q u e ces différentes p ro téases étaien t en
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m esure de cliver l’hém agglutinine (Choi etal., 2009; Bertram etal., 2010). Ces TTSP pourraient donc jouer u n rôle im p o rtan t dans l’infection p ar les virus de l’influenza.
1.3.4.3 Surdité Deux TTSP on t été reliées à la surdité, TMPRSS3 et l’hepsine. Des m u tatio n s au niveau du gène de TMPRSS3 causent u n e surdité congénitale autosom ale récessive (Scott etal., 2001) qui provoque la dégénérescence des cellules ciliées de la cochlée (Fasquelle etal., 2011). Dans le cas de l’hepsine, la surdité provoquée p a r son ab sen ce sem ble liée à u n d év elo p p em en t ab erran t de la m em brane tectoriale de la cochlée et à u n e d im in u tio n d e la m yélination d u n erf auditif (Szabo et Bugge, 2011).
1.3.4.4 Anémie Des m utations au niveau d u gène TMPRSS6 c o d an t p o u r la m atriptase-2 so n t re sp o n sables d ’u n e form e d ’aném ie déficiente en fer et réfractaire à la th érap ie de prise d e fer p a r voie orale (IRIDA, iron-refractory iron deficiency anemia) (Finberg etal., 2008). Le lien entre ce type d ’aném ie et la m atriptase-2 a perm is d ’identifier son rôle im p o rtan t d ans la régulation du fer d ont il sera question à la section suivante.
1.4 La régulation du fer par la m atriptase-2 1.4.1 La m atriptase-2 La m atriptase-2 a été identifiée chez l’h u m ain et la souris en utilisant u n e approche in silico qui perm ettait de rechercher d an s des b ases de d o n n ées du g énom e des régions avec des sim ilarités avec les TTSP déjà co n n u es (Velasco e t a l , 2002). D ans les tissus h u m a in , la m atriptase-2 possède une expression très lim itée et est seu lem en t d étectée à des q u an tités significatives q u ’au niveau du foie (figure 1.8) (Velasco etal., 2002; Su e t a l , 2004). Chez l’hum ain, la m atriptase-2 est com posée de 811 acides am inés et com prend dans sa région am ino-term inale un e queue cytoplasm ique suivie d ’u n dom aine transm em branaire, d ’u n dom aine SEA, de deux d o m ain es CUB, de trois d o m ain es LDLRA et d ’u n d o m ain e catalytique protéase à sérine e n carboxy-term inal (figure 1.9). A ucun rôle précis n ’a été identifié pour ces différents dom aines, sauf pour le dom aine catalytique, qui perm et de cliver l’hém ojuvéline (voir 1.4.4.3). À la surface cellulaire, la m atrip tase-2 est p rin c ip a le m en t retrouvée sous sa form e zym ogène inactive (chaîne unique) (Stirnberg et al., 2010). À cet en d ro it, elle su b it u n clivage en aval du résidu Arg576 qui p e rm e t so n activation (figure 1.9). Cet év én e m e n t est m édié par un m écanism e d ’activation en trans de l’enzym e qu i nécessite la p résen ce d ’u n e
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Adipocyte Complexe amygdalien Appendice Cerveau Cervelet Coeur Côlon FoieGanglion lymphatique Glande salivaire Glande surrénale Glande surrénale (cortex) Hypophyse Hypothalamus Intestin grêle Langue Moelle épinière Moelle osseuse Muscle lisse Muscle squelettique Ovaire Pancréas Peau Placenta Poumon Prostate Rein Rétine Sang Testicule Thalamus Thymus Thyroïde Tonsille Trachée Utérus
E x p re ssio n n o rm a lisé e
Figure 1.8 Expression de la m atriptase-2 dans différents tissus hu m ain s Niveau d’expression normalisé d’ARNm de la matriptase-2 dans différents tissus humains. Une puce contenant des oligonucléotides couvrant 44 775 séquences cibles humaines distinctes a été criblée par un ensemble d’ARNm provenant de 79 tissus humains différents (Su et a l, 2004). R 446
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Figure 1.13 M utations de la m atriptase-2 im pliquées dans l’aném ie de type IRIDA Localisation des différentes mutations de la matriptase-2 impliquées dans l’anémie de type IRIDA. Les mutations de l’ADN de la matriptase-2 provoquent des mutations faux-sens qui modifient un acide aminé spécifique par un autre, non-sens (X) qui insèrent un codon de terminaison ou décalentes (fs) qui provoquent un changement du cadre de lecture du code génétique. 1.5 Projet de recherche 1.5.1 Problématique L’im portance de la m atriptase-2 dans la régulation du fer a récem m ent été révélée par l’identification de m u tatio n s au niveau de son gène. Ces m u tatio n s so n t im pliquées dans u n type d ’aném ie m icrocytaire résistan t au traitem en t p a r le fer oral (IRIDA) (Finberg etal., 2008). Les différentes études publiées (Du etal., 2008; F inberg etal., 2008; Folgueras etal., 2008; Silvestri et al., 2008) sur la m atrip tase-2 o n t d é m o n tré que son activité catalytique apparaît essentielle à sa fonction de régulation d u fer (Silvestri et al., 2009). Des m u tatio n s identifiées d an s les dom aines autres q u e catalytique (SEA, CUB et LDLRA) se so n t aussi avérées à abolir sa fonction de régulation sur l’hepcidine (Finberg etal., 2008). Ces m utations sem blent su p p rim er l’activité d u d o m ain e protéase. Les différents d o m ain es m osaïques de l’ectodom aine sem blent donc essentiels à la fonction de l’enzym e. L’im p o rtan c e des dom aines de l’ectodom aine se retrouve aussi chez d ’autres TTSR En effet, TMPRSS3 possède égalem ent des m u tatio n s identifiées d an s les différents d om aines au tres q u e catalytiques et ces m utatio n s en g en d ren t u n e surdité récessive au to so m ale (G uipponi, A ntonarakis et Scott, 2008). La région cytoplasm ique est aussi une candidate ayant u n grand potentiel pour la régulation de l’enzyme. En effet, la queue cytoplasm ique de la m atriptase-2 com porte une variété de motifs potentiels tels des motifs de phosphorylation et d ’autres ayant un rôle dans le routage des p rotéines (figure 1.14). En effet, les sérines e n position 7 et 43 d u dom aine cytoplasm ique de la m atriptase-2 font p artis de p o ten tiels m otifs de p h o sp h o ry latio n par la p rotéine kinase C (PKC) et la région 7-12 co n stitu e u n e région à laquelle des protéines
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ayant un dom aine SH2 (Src homology 2) peuvent se lier (Hwang etal., 2002). La m atriptase-2 possède aussi à proxim ité de sa région tra n sm em b ran a ire deux m otifs d ’ex p o rtatio n du réticulum en d o p lasm iq u e de p ro téin e tra n sm em b ran a ire d e type II p o u v a n t se lier à Sari (Giraudo et Maccioni, 2003). Aucun rôle n ’a à ce jo u r été assigné à ces différents motifs pour la m atriptase-2. De plus, peu de substrats on t été identifiés ju sq u ’à m aintenant, l’hém ojuvéline étan t le premier. PKC
SH 2
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Figure 1.14 Motifs identifiés dans la qu eu e cytoplasm ique de la m atriptase-2 Motifs identifiées dans le domaine cytoplasmique de la matriptase par l’analyse de Minimotif Miner (Mi et al, 2012). PKC : motif de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC) ; SH2 : motif de liaison à SH2 ; Sari : motif d’exportation du réticulum endoplasmique de protéine transmembranaire de type II se liant à Sari. En ta n t que su p p resseu r de l’expression de l’hepcidine, la m atrip tase-2 est u n e candidate possible p o u r u n e in terv en tio n th é ra p eu tiq u e afin de tra ite r les désordres d u m étabolism e du fer. U ne co nn aissan ce ap p ro fo n d ie de sa régulation, de ses p ro p riétés catalytiques et de sa b iosynthèse est d o n c souhaitable. Il s’agit de l’o b jet de cette th èse de doctorat.
1.5.2 Hypothèse de recherche La m atriptase-2 est u n enzym e p o ssé d a n t u n e m u ltitu d e de dom aines, c ep e n d a n t au cu n rôle n ’a encore été associé à ceux-ci. N otre h y p o th èse de recherche stipule q u e les différents dom ain es de la m atrip tase-2 jo u e n t des rôles essentiels d a n s la régulation et l’activité de l’enzyme.
1.5.3 Objectifs de recherche Objectif 1 : Déterm iner la spécificité du dom aine catalytique de la m atriptase-2 Le d om aine catalytique de la m atrip tase-2 est san s a u c u n doute son d o m ain e ayant la plus grande im portance. L’action de l’enzym e est d irectem en t associée à la p résen ce de l’activité de ce dom aine. Le p résen t objectif vise à identifier la spécificité de la m atriptase-2 ainsi que son profil d ’inhibition. L’étu d e se fera en co m p aran t la m atriptase-2 à trois autres TTSP (matriptase, DESC1, hepsine) pour ainsi couvrir trois sous-familles de TTSP différentes.
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Objectif 2 : Déterm iner la fonction de la queue cytoplasm ique de la m atriptase-2 La m atriptase-2 est constituée de pas m oins d e n eu f d om aines de six types différents. Jusqu’à m a in ten an t, très p e u d ’in fo rm atio n est d isp o n ib le sur le rôle de ces différents dom aines. Par le présence de nom breux m otifs susceptibles de jouer u n rôle essentiel dans sa biosynthèse et sa régulation, le dom aine cytoplasm ique de la m atriptase-2 est d ’u n intérêt im portant. L’im portance de ce dom aine sur la fonction de clivage de l’hém ojuvéline et de la régulation de l’expression de l’hepcidine sera analysée.
A rticle I
Probing the substrate specificities of matriptase, matriptase-2, hepsin and DESC1 with internally quenchedfluorescent peptides Auteurs de l’article : François Béliveau, A ntoine D ésilets et Richard Leduc. Statut de l’article : Publié d ans FEBS Journal (2009), vol. 276, no 8, p. 2213-2226. Avant-propos : L’article « Probing the substrate specificities o f m atriptase, m atriptase-2, hepsin a n d DESC1 with internally quenched fluorescent peptides » p a ru d a n s FEBS Journal p ré sen te les diffé rences au niveau des p ro p riétés enzym atiques de la m atrip tase-2 envers trois au tres TTSP, la m atriptase, l’hep sin e et DESC1. J’ai co n trib u é à l’élab o ratio n et à l’exécution d u travail expérim ental présenté dans cet article ainsi q u ’à l’écriture d u m anuscrit. Résumé : Les sérines protéases tran sm em b ran aires de type II (TTSP) sont u n e classe ém erg ean te d ’enzymes protéolytiques im pliquées dans l’hom éostasie des tissus et dans un grand nom bre de désordres physiologiques tel le cancer. Pour m ieux définir les fo nctions b io ch im iq u es d ’u n sous-ensem ble de ces protéases, n o u s avons co m p aré les p ro p riété s en zy m atiq u es de la m atriptase, la m atriptase-2 , l’h ep sin e et DESC1 e n u tilisan t u n e série de su b strats peptid iq u es à fluorescence confinée in tram o lécu lairem en t q u i p o ssè d e n t u n g ro u p e m e n t am ino-term inal o-am inobenzoyle (fluorophore) et u n groupem ent carboxy-term inal 3-nitrotyrosine (confineur). Nous avons établi la séq u en ce des p ep tid es (P4 à P4’) su r la b ase d e la séq u en ce d ’activation de la m a trip tase (RQAR-WGG). Les p o sitio n s P4, P3, P2 et P I ’ o n t été substituées p a r des acides am inés n o n -p o laires (Ala, Leu), a ro m a tiq u e (Tyr), acide (Glu) et basique (Arg) et où PI a été fixé à Arg. Des q u atre TTSP étudiées, la m atrip tase-2 est la plus perm issives e t la m atrip tase la plus discrim inante, avec u n e spécificité d istin cte p o u r les résidues Arg e n P4, P3 et P2. DESC1 p o ssèd e u n e p référence sim ilaire à celle d e la m atriptase, m ais avec u n e p ro p e n sio n p o u r les p etits acides am inés n o n -p o laires (Ala) e n P I ’. L’hepsine partage des sim ilarités avec la m atrip tase et DESC1, m ais est n e tte m e n t plus perm isive en P2. La m atriptase-2 m anifeste une spécificité plus large ainsi q u ’u n e inhibition p a r le su b strat p o u r certains des su b strats utilisés. F inalem ent, n o u s avons d éco u v ert que l’a n tith ro m b in e III possède des p ro p riétés d ’in h ib itio n ro b u stes envers la m atrip tase, la m atriptase-2, l’hepsine et DESC1 alors que PAI-I (plasminogen activator inhibitor-1) e t l’a2an tiplasm ine in h ib en t la m atriptase-2, l’hep sin e et DESC1 ainsi q u e la m a trip ta se à u n m oindre niveau. En résum é, notre étude a révélé que ces enzym es p ossèdent des préférences distinctes pour leurs substrats.
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PROBING THE SUBSTRATE SPECIFICITIES OF MATRIPTASE, MATRIPTASE-2, HEPSIN, AND DESC1 WITH INTERNALLY QUENCHED FLUORESCENT PEPTIDES François Béliveau, Antoine D ésilets, and Richard Leduc* D epartm ent of Pharmacology, Faculty of M edicine a nd H ealth Sciences, U niversité de Sherbrooke, Sherbrooke, Q uébec, CANADA, J1H 5N4 Running title: D istinct substrate specificities o f TTSPs ‘Corresponding author: Richard Leduc, Ph.D.; e-m ail: Richard.Leduc@ USherbrooke.ca
2.1 Abstract Type II transm em brane serine proteases are a n em erging class of proteolytic enzym es involved in tissue hom eostasis and a n u m b e r of h u m a n disorders su ch as cancer. To b etter define the biochem ical functions of a subset of these proteases, we com pared the enzym atic properties of m atriptase, m atriptase-2, h ep sin a n d DESC1 using a series of in tern ally q u en ch ed fluorogenic pep tid e su b strates co n tain in g o-am inobenzoyl a n d 3-nitro-tyrosine. We based the seq u en ce of th e p ep tid es o n th e P4 to P4’ activation seq u en ce of m a trip tase (RQAR-WGG). Positions P4, P3, P2 an d P I ’ w ere su b stitu ted w ith n o n p o la r (Ala, Leu), arom atic (Tyr), acid (Glu) and basic (Arg) am ino acids, w hereas PI was fixed to Arg. Of th e four type II tra n sm em b ran e serine p roteases studied, m atrip tase-2 was th e m o st p rom iscu o u s, an d m atriptase w as the m ost discrim inating, w ith a d istin ct specificity for Arg residues at P4, P3 an d P2. DESC1 h a d a p reference sim ilar to th a t of m atrip tase, b u t w ith a pro p en sity for sm all n o n p o la r am ino acids (Ala) at P I ’. H epsin sh ared sim ilarities w ith m a trip ta se an d DESC1, b u t was m arkedly m ore perm issive a t P2. M atriptase-2 m an ifested b ro a d e r specificities, as well as su b strate inhibition, for selective internally q u e n c h e d fluorescent substrates. Lastly, we fo u n d th a t a n tith ro m b in III h as ro b u st inhibitory pro p erties tow ard m atriptase, m atriptase-2, h ep sin a n d DESC1, w hereas p lasm in o g en activator in h ib ito r-1 an d ot2 -antiplasm in inhibited m atriptase-2, h epsin a n d DESC1, and to a m u ch lesser extent, m atriptase. In sum m ary, o u r studies revealed th a t th ese enzym es have d istin ct su b strate preferences.
2.2 Introduction Type II tra n sm em b ran e serine p ro teases (TTSPs) are a newly recognized fam ily of SI class proteolytic enzym es, w ith 20 distinct m e m b e rs know n in m ice an d h u m an s. TTSPs are divided into four subfam ilies b ased o n th eir m o d u la r stru ctu re (Szabo an d Bugge,
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2008). The HAT/DESC subfam ily is th e largest a n d is co m p rised of HAT, DESC1-4 an d HAT-like HATL3-5. It exhibits th e sim plest m o d u la r stru ctu re of th e stem region, w hich consists of a single sea u rc h in sp erm p ro tein , a n e n tero p ep tid ase an d a n agrin d o m ain (SEA). The m atrip tase subfam ily co n tain s th ree highly hom ologous proteases: m atrip tase, m atriptase-2 and m atriptase-3. All m atriptases have sim ilar stem regions, w ith one SEA, two C lr/C ls , urchin em bryonic grow th factor, b o n e m o rp h o g e n ic protein-1 (CUB), a n d three (m atriptase-2 an d m atriptase-3) or four (m atriptase) low -density lip o p ro tein re c ep to r class A dom ains (LDLRA). M em bers of th e hep sin /T M P R S S /en tero p ep tid ase subfam ily (hepsin, MSPL, TMPRSS2-5) possess a sh o rt stem region co n tain in g a single scavenger C ys-rich dom ain (SR) (hepsin, TMPRSS5), preceded by a single LDLRA dom ain (MSPL, TMPRSS2-4). Over the past few years, accum ulating evidence has revealed th e distinct and im p o rtan t roles these enzym es play in h o m eo stasis a n d pathological co n d itio n s (Szabo a n d Bugge, 2008). The m ost extensively studied TTSP, m atriptase, is involved in epithelial developm ent by its ability to cleave cell-surface an d extracellular m atrix proteins, th ereb y regulating cellular adhesion and growth. N um erous potential m atriptase substrates have b een identified, including protease-activated receptor-2 (Takeuchi etal., 2000), pro-urokinase plasm inogen activator (Takeuchi e t a l , 2000; Lee, D ickson an d Lin, 2000), p ro -h ep ato cy te grow th factor (Lee, Dickson and Lin, 2000), pro-prostasin (Netzel-Arnett etal., 2006), pro-filaggrin (List etal., 2003), tran sm em b ran e a n d associated w ith src kinases (Trask/CD318/SIM A135/CDCP-1) (Bhatt etal., 2005) an d m acrophage-stim ulating p ro tein 1 precursor (proMSP-1) (Bhatt e ta l, 2007). Elevated levels of m atriptase have been found in epithelial tum ors (Benaud etal., 2002), an d overexpression of th e enzym e in transgenic m ice in d u ces sq u am o u s cell carcin o m as (List e t a l , 2005). A direct link b etw een m atrip tase a n d a skin disease (autosom al recessive ichthyosis w ith hypotrichosis) h as b een established (Avrahami etal., 2008; Basel-Vanagaite e t a l , 2007) and is the result of a genetic m u tatio n w hich lead s to loss of proteolytic activity (Désilets e ta l , 2008; List e t a l , 2007). The roles of other TTSPs have no t been investigated in as m uch detail as m atriptase. The expression of m atriptase-2 (Ramsay e t a l , 2008), w hich cleaves type I collagen, fibronectin and fibrinogen in vitro (Velasco etal., 2002), correlates w ith suppression of the invasiveness an d m igration of p ro state an d b reast c an cer cells (Parr e t a l , 2007; Sanders e t a l , 2008). In addition, a recent rep o rt d em o n strated th a t m u ta tio n s in th e gene en co d in g m atrip tase-2 are associated w ith iron-refractory, iron-deficiency a n em ia (Finberg etal., 2008). H epsin,
37
w hich activates factor VII (Kazama etal., 1995), p ro -h ep ato cy te grow th factor (K irchhofer etal., 2005) an d pro-urokinase-ty p e p lasm in o g en activ ato r (M oran etal., 2006) m ay play an im p o rtan t role in hearing (G uipponi etal., 2008). This TTSP is also actively involved in pro state cancer progression a n d m etastasis (Klezovitch e t a l , 2004; S rikantan e t a l , 2002), an d is used as a m arker for th e detectio n of early pro state cancer (Kelly etal., 2008). DESC1 confers tum origenic pro p erties on MDCK cells an d is u p reg u lated in tu m o rs of different origin (Viloria e ta l, 2007). The deregulation o f TTSPs is thus linked to m ultiple pathological states. To b e tte r u n d e rsta n d the role of these enzym es, we purified a n d enzym atically c h a r acterized four TTSPs from three different subfam ilies: m atriptase, m atrip tase-2 , h ep sin a n d DESC1. We d e term in e d their pH o p tim u m , th eir fccat. K m and k catI K m values tow ard a n u m b e r o f internally q u e n ch e d fluorescent (IQF) p e p tid e s an d th e ir sensitivity to various chemical and physiological inhibitors. In a side-by-side com parison, we find that these TTSPs exhibit specific and distinct biochem ical an d enzym atic properties.
2.3 Results Expression, purification and characterization o f hum an m atriptase, m atriptase-2, hep sin and DESC1 To study TTSP specificity, we first expressed and purified soluble recom binant forms of the enzymes. The m atriptase construct (am ino acids 596-855, 29kD a theoretical m olecular mass) was expressed in Escherichia coli and purified as previously describ ed (Désilets e t a l , 2006). The m atriptase-2, hepsin and DESC1 constructs (84,45 and 45 kDa, respectively) (Fig. 2.1A) expressed in D rosophila S2 cells as C -term inally V5-His tagged fusion p ro te in s h ad their N -term inal cytoplasm ic an d tran sm em b ran e do m ain s rem oved. The secreted soluble enzym es w ere purified from the m edia su p ern ata n ts by im m obilized m etal-chelate affinity chromatography. Typically, 50-100 pg of purified recom binant enzyme is obtained from 11 of cell m edia. As shown in Fig. 2.IB, two forms o f hepsin were detected th a t m igrated as 45 kDa (zymogen form consisting of am ino acids 45-417) an d 30 kDa (autocatalytically pro cessed form consisting of am ino acids 163-417). The ab sen ce of hig h er m o lecu lar m ass form s of DESC1 and m atriptase-2 suggests that, under these conditions, the zymogen forms were more efficiently converted to their 32 kDa (amino acids 192-423) and 28 kDa (am ino acids 577-811) form s, respectively. Each enzym e p re p a ratio n w as enzym atically p ure. No activity using
38
A
HAT/DESC subfam ily 0ESC1
■hTm
— T.
Hepsin/TMPRSS subfamily L417
h
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M atriptase subfam ily M atriptt*»
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Transmambrane Romain i
O
SR Romain LDLRAdomain
Sanos profana Roman
B kDa
5037 -
25
Figure 2.1 TTSP expression an d purification (A) Schematic representations of matriptase, matriptase-2, hepsin and DESC1. Arrows and numbers indicate the first and last amino acids of the constructs. Recombinant matriptase has a His6 epitope at the N-terminus, whereas matriptase-2, hepsin and DESC1 have a V5-His epitope at the C-terminus. (B) Purification of TTSPs from S2 cell medium. TTSP expression was induced in S2 cell medium by adding copper sulfate. The HiS6-tagged TTSPs were then purified from the medium by FPLC using a nickel-charged resin. Purified enzymes were loaded on 12 % SDS/PAGE gels under reducing conditions and analyzed by western blotting using an antibody directed against the V5 tag located on the C-terminus. Gln-Ala-Arg trip ep tid e conjugated to th e fluorophore 7-am in o -4 -m eth y lco u m arin (AMC) as a substrate was d etected in su p ern ata n ts from u n tran sfected S2 cells th a t u n d erw en t the sam e purification procedure as th e su p e rn a ta n t from stably tran sfected cells. The enzym e p reparations w ere titrated using th e irreversible inhibitor 4-m ethylum belliferyl p-guanidinobenzoate to determ ine th e precise active site concentration of each preparation w hich was adjusted to a final concentration of 100 nM. To examine the influence of various physiological environm ents on enzyme activity, we analyzed the pH profile of each purified TTSP. We assayed for proteolytic activity using Boc-
39
Matriptase
g
Matriptase-2
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Hepsin
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p
DESC1
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2 cc
or pH
pH
Figure 2.2 TTSP pH profile (A) Matriptase, (B) matriptase-2, (C) hepsin and (D) DESCl were incubated with MES (pH 5-7), Tris (pH 7-9) and CAPS (pH 9-11) at various pH values. Enzymatic activities were determined by monitoring the fluorescence signal of 50 pM Boc-Gln-Ala-Arg-AMC and are presented as the relative activities at each pH. Measurements were performed in duplicate and represent the means ± SD of at least three independent experiments. The results were plotted with least squares regression analysis. Gln-Ala-Arg-AMC as a substrate in MES (pH 5-7), Tris (pH 7-9) and CAPS (pH 9-11) buffers (Fig. 2.2). M atriptase activity (Fig. 2.2A) was optim al in m ore basic conditions. M atriptase-2 activity (Fig. 2.2B) was optim al n ear physiological pH (pH 7.5), w hereas h e p sin an d DESCl activities (Fig. 2.2C,D) w ere optim al at pH 8.5. In th e en su in g experim ents, TTSP activities were m easured at pH 8.5. O f note, all enzym es were stable u n d e r th e conditions u sed up to 40 min. To further analyze th e enzym atic pro p erties o f th e enzym es, w e d e term in e d th e in hibitory profiles of the purified TTSPs. The effects of various protease inhibitors on m atriptase, m atriptase-2, h ep sin an d DESCl activities are show n in Table 2.1. The serin e p ro tease inhibitors 4-(2-am inoethyl)-benzenesulfonylfluoride hydrochloride (AEBSF; irreversible) and aprotinin (reversible) significantly in h ib ited proteolytic activity. AEBSF (4 mM) com pletely abolished the activity of all four TTSPs. A protinin (0.3 pM) h a d a p o te n t in h ib ito ry effect on m atriptase, m atriptase-2 an d hepsin, b u t less so o n DESCl (29% residual activity). The serine/cysteine p rotease in h ib ito r leu p ep tin (1 pM) h a d a variable in h ib ito ry effect. It significantly in h ib ited m atrip tase (29% residual activity), bu t w as less p o te n t against m atriptase-2 (63 % residual activity) an d DESCl (55 % residual activity). Cysteine, asp artic and m etalloproteinase inhibitors had no effect on th e activities of th e TTSPs tested.
40
Table 2.1 Effects of protease inhibitors on purified recom binant m atriptase, m atriptase-2, hepsin and DESCl activities. Inhibitors and 2 nM TTSP were mixed, and the proteolytic activity toward 50 pM Boc-Gln-Ala-Arg-AMC was m onitored for up to 20 min. Proteolytic activity is expressed as a percentage of the activity of an inhibitor-free control (residual activity). Inhibitions m easurem ents were perform ed in duplicate and represent the m eans ± SD of at least three independent experiments. AEBSF, 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonylfluoride hydrochloride. Target protease Ser
Cys Asp Métallo
Inhibitor Aprotinin Leupeptin AEBSF Trypsin inhibitor E-64 Pepstatin EDTA Bestatin O-phenanthroline
Residual activity (%) --------------------------------------------------------------------------Concentration M atriptase Matriptase-2 Hepsin DESCl 0.3 pM lp M 4m M 5 pM 28 pM lp M 1 mM 74 pM 1 mM
29 58 78 78 78 78 78
0 ± 0 ± ± ± ± ± ±
11 32 23 23 23 23 23
2 63 1 5 11 11 11 11 11
± ± ± ± ± ± ± ± ±
2 15 1 7 4 4 4 4 4
1 4
1 1 1 1 1
± ± 0 0 ± ± ± ± ±
1 0.2
1 1 1 1 1
29 55 1 8 2 2 2 2 2
it ± ± ± ± ± _L ± ±
8 7 1 8 1 1 1 1 1
Physiological serine p ro tease in h ib ito r serpins [aj-antitrypsin (ai-AT), ai-an tich y m o trypsin (oci-ACT), antithrom bin III (AT III), plasm inogen activator in h ib ito r-1 (PAI-1) and ct2antiplasm in (ot2-AP)] were also used to com plete the inhibitory profile (Table 2.2). Inhibition assays w ith serpins were p e rfo rm ed a t pH 7.4 b ecau se th e se inhibitors p re sen t a higher dissociation rate w ith an increase in pH (Calugaru, Sw anson an d Olson, 2001). ai-AT (SerpinAl) h a d no inhibitory effect o n m atrip tase, m atrip tase-2 or D ESCl, b u t slightly inhibited h ep sin (67 % residual activity). cci-ACT (SerpinA3) h ad no significant in h ib ito ry effects on any of the TTSPs. AT III (SerpinCl) w ith h ep arin exhibited the strongest inhibitory effects on TTSPs, totally inhibiting m atriptase, m atriptase-2 and hepsin, an d leaving DESCl w ith 8 % residual activity. Interestingly, AT III w as th e only serpin th a t com pletely in h ib ited m atriptase. PAI-1 (SerpinEl) h a d a stro n g in h ib ito ry effect o n m atrip tase-2 (5% residual activity), hepsin (0 % residual activity) and DESCl (8 % residual activity), b u t was less p o te n t against m atriptase (58 % residual activity). a2-AP (SerpinF2) had a strong inhibitory effect on m atriptase-2 (11 % residual activity), h ep sin (1 % residual activity) a n d DESCl (2 % residual activity), but was less potent against m atriptase (78 % residual activity). Moreover, we did not d etect cleavage of any of the serpins used w hen in cu b ated w ith m atriptase.
41
Table 2.2 Effects of serpins on purified recom binant m atriptase, m atriptase-2, hepsin and DESCl. Serpins were mixed with 2.5 nM m atriptase, m atriptase-2, hepsin and DESCl. The m ixtures were incubated for 10 min and proteolysis of 50 pM Boc-Gln-Arg-Arg-AMC was m onitored for 30m in. Proteolytic activity is expressed as a percentage of the activity of an inhibitor-free control (residual activ ity). Inhibitions m easurem ents were perform ed in duplicate and represent the m eans ± SD of at least three independent experiments. RCL, reactive-center loop; an-AT, an-antitrypsin; on-ACT, cnantichymotrypsin; AT III, antithrom bin III; PAI-1, palsm inogen activator inhibitor I; ot2 -AP, a2-antiplasm in. Residual activity (%)
k
ft
Inhibitor a i-ACT AT III PAI-1 0(2-AP
RCLP4-P4’
Concentration
AIPM-SIPP ITLL-SALV IAGR-SLNP VSAR-MAPE AMSR-MSLS
250 nM 250 nM 250 nM 250 nM 250 nM
M atriptase 96 88 58 78
± ± 0 ± ±
Matriptase-2
9 18
96 93
32 23
5 11
± ± 0 ± ±
5 11 7 4
Hepsin 67 88
1
± ± 0 0 ±
DESCl 23 19
1
91 89 8 8 2
± ± ± ±
8 5 1 8 1
Enzymatic specificity using IQF peptides based on the autoactivation sequence o f m atrip tase To study the su b strate specificity o f TTSPs, w e initially used IQF su b strates w hose sequences w ere based on th e au to activ atio n seq u en ce o f m a trip ta se (RQARj-WGG; Table 2.3, substrate 1). Utilization of IQF su b strates allowed us to p ro b e th e p rim e p o sitio n of th e substrate th a t is critical to m any enzym e families. The p ep tid es used to assay TTSP activities were designed by individually replacing each position (P4, P3, P2 and P I ’) w ith residues with different physico-chem ical p ro p erties such as sm all alip h atic (Ala), larger alip h atic (Leu), polar arom atic (Tyr), basic (Arg) or acidic (Glu) am ino acids. Position PI was always occupied by Arg b ecause TTSPs have an exclusive preference for su b strates th a t c o n tain th is am in o acid (or Lys) (Takeuchi et al., 2000). Amino acids at P4, to w hich the Abz group is linked, have no effect on the q uantum yield of IQF peptides (Ito et al., 1998). To gain a n overall picture of th e relative activities of m atrip tase, m atrip tase-2 , h ep sin a n d DESCl tow ards the fluorogenic p ep tid es, 18 IQF p e p tid e s w ere in c u b a te d at a fixed co n cen tratio n (50 pM) w ith the various enzym es (Fig. 2.3A-D). We also u sed try p sin as a positive control of th e ’cleavability’ of th e su b strates and as a n exam ple o f a p ro tease w ith poor discrim ination for positions o th e r th an PI (Fig. 2.3E). Figure 2.3 shows th a t TTSPs had clear preferences for distinct IQF p ep tid es w h en co m p ared w ith trypsin, w hich cleaved all IQF p eptides w ithout significant d iscrim ination. F urtherm ore, TTSPs cleaved 11 o f th e 18 substrates with different efficiency (Table 2.3), indicating that they had no exquisite substrate specificity, b u t rath er had preferred motifs.
42
B
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1
Figure 2.3 TTSP substrate preference Substrate preferences for positions P4, P3, P2 and P I’ of (A) matriptase, (B) matriptase-2, (C) hepsin, (D) DESCl and (E) trypsin were analyzed using IQF peptides. Relative activities were measured using 50 pM substrate. Release of fluorescence from the substrates by the enzymes is given as the maximum velocity observed (relative activity). All cleaved IQF peptides had their cleavage sites confirmed by MS analysis. Measurements were performed in duplicate and represent the mean ± SD of at least three independent experiments. To confirm th at cleavage occurs at the predicted position (between suggested PI and P I ’ positions), we analyzed the cleavage products of the reaction with m atriptase by MS of the 11 IQF cleaved peptides (results no t shown). All expected cleavage products were identified for the 11 peptides analyzed. Surprisingly, the peptide containing Arg in the PI and P2 positions [Abz-RQRRWGG-Y(3-N02); substrate 13] produced fragm ents corresponding to the cleavage b etw een positions P I an d P I ’, as expected, b u t also fragm ents co rresp o n d in g to cleavage betw een positions PI and P2 (see D iscussion). To b etter evaluate TTSP specificity, we d eterm in ed kinetic p a ram eters for m atriptase, m atriptase-2, h ep sin an d DESCl by using stan d a rd M ichaelis-M enten kinetics (Fig. 2.4A). Interestingly, we found th at m atriptase-2 did not m anifest standard M ichaelis-M enten kinet ics for 4 of 18 IQF peptides. Use of these peptides significantly inhibited m atriptase-2 activity a n d therefore, fit th e su bstrate in h ib itio n eq u atio n (Fig. 2.4B). Only Abz-RQAR|W GG-Y(3-
43
A
B 15000'
600'
10000-
400-
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50
100
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[Abz-RQRRWGG-Y(3-N02)]((jM)
100
150
200
[Abz-RQRRWGG-Y(3-N02)](|JM)
Figure 2.4 IQF peptides do not exhibit M ichaelis-M enten kinetics w ith m atriptase-2 The kinetic parameters of matriptase for the substrate Abz-RQRRWGG-Y(3-N02) were determined using the standard Michaelis-Menten equation. (B) For matriptase-2, an increasing concentration of substrate caused increased inhibition. Results are shown for Abz-RQRRWGG-Y(3-N02) and were fit to an equation describing substrate inhibition (Eqn 2.1). Measurements were performed in duplicate and represent the mean ± SD of at least three independent experiments. N 0 2), Abz-RRAR|W GG-Y(3-N02) and Abz-RQAR4AVGG-Y(3-N02) did n o t exhibit su b strate inhibition for m atriptase-2. Table 2.3 p resents all calculated kinetics p aram eters (fccat, K m a n d fccat/ K m) for th e TTSPs studied. Interestingly, u n d e r o u r conditions, all TTSPs required a basic a m in o acid (Arg) at the P4 position of the su b strates to establish k cat/ K m values. The p resen ce o f o th e r types of am ino acids a t this position (Ala, Glu, Leu an d Tyr; substrates 2-5, respectively) did n o t enable us to evaluate kcat/ K m values because of a lack o f detectab le enzym atic activity. In addition, th e k cat / K m values of the substrates with Glu at P4, P3, P2 or P I ’ (substrates 3, 7, 11 an d 16) could n o t b e determ ined, indicating th a t negatively charged am ino acids in th e substrate-binding pockets of TTSPs have a d etrim ental effect. Of all th e TTSPs studied, m atrip tase show ed th e m o st specificity for Abz-RQRRWGGY (3-N02) p ep tid e (substrate 13) w hich yielded a kcax/ K m value (5.2 x 105 M '1 ■s '1) 36-fold higher than th e reference substrate (RQARjWGG, substrate 1). The sub stitu tio n o f Gin w ith a basic am ino acid (Arg, substrate 9) at position P3 resulted in a fivefold increase in k cat/ K m, suggesting th at P3 plays an im portant role in substrate recognition. P I ’ was m ore permissive, a n d Gin a n d Tyr residues at this p o sitio n p e rm itte d th e cleavage of su b strates 17 a n d 18. Interestingly, substituting an am ino acid smaller than Val at P I ’ (Ala, substrate 15) resulted in a threefold increase in k cat/ K m. W ith m atriptase-2, we n o te d th a t specific p ep tid es cau sed
Table 2.3 IQF peptide hydrolysis by matriptase, matriptase-2, hepsin and DESCl. The hydrolysis of the IQF peptides (0-200 pM) was monitored and the constants were calculated from non-linear regressions of hyperbolic Michaelis-Menten rate equations. Relative activities (Rel.fcca,/iC,„) of the IQF peptides are the kcat/Km values of the IQF peptides relative to that of the reference peptide (substrate I). Enzymatic measurements were performed in duplicate and represent the means of at least three independent experiments. All errors are < 20 %. s.i., substrate inhibition. Matriptase-2
Matriptase
Hepsin
DESCl
kcal!Km
kca l s'
Km pM
fccat
pM
fc c a J K n M 's'1
Rel.
Sequence
fccat s"'
fccat/Kni
Substrate
M 'V 1
kcat/Km
S*
Km pM
fccaJK m M 's1
fccallKm
fccat s '1
Km pM
fccat/K m M 's '
kcat/km
1
RQAR-WGG
1.5
104
1.5 x 104
1.0
1.0
126
7.7 x 103
1
1.4
369
3.8 x 103
1.0
2.5
113
2.2 x 104
1.0
Km
Rel.
Rel.
Rel.
P4 2
AQAR-W GG
< 103
< 103
< 103
s: 10'
3
EQAR-W GG
< 103
< 103
< 103
< 103
4
LQAR-W GG
< 103
< 103
< 103
< 10:i
5
YQAR-WGG
< 103
< 103
< 103
< 103
P3 6
RAAR-WGG
7
REAR-WGG
0.3
159
2.1 x 103
0.2
< 103
0.5
220
< 103
< 103 0.3
88
3.6 x 103
0.3
RRAR-W GG
0.9
12
7.7 x 104
5.3
10
RYAR-WGG
0.6
137
4.5 x 103
0.3
< 103 0.3
3.3
9.6 x 104 V
RLAR-WGG
9
0.7
0.7
25
< 103 12
3.0 x 104
1.3
< 103
0.6
290
2.2 x 103
0.6
1.1
42
2.6 x 104
1.2
0.5
72
7.3 x 103
1.9
1.4
11
1.3 x 105
5.8
1.0
55
1.9 x 104
0.9
©
8
2.6 x 103
< 103
P2 11
RQER-W GG
12
RQLR-W GG
0.5
124
4.0 x 103
< 103 0.3
i.s.
1.5
68
< 103 2.4 x 104
6.1
0.8
28
< 103 2.8 x 104
1.2
13
RQRR-W GG
26
50
5.2 x 105
36
i.s.
1.4
70
2.0 x 104
5.3
3.6
31
1.2 x 105
5.2
14
RQYR-WGG
0.7
50
1.3 x 104
0.9
i.s.
1.1
109
1.0 x 104
2.7
0.8
58
1.3 x 104
0.6
5.5
128
4.3 x 104
3.0
0.5
191
2.7 x 103
0.7
3.2
76
4.3 x 104
1.9
< 103
PI' 15
RQAR-AVGG
16
RQAR-EVGG
17
RQAR-QVGG
0.8
65
1.2 x 104
0.8
< 103
18
RQAR-YVGG
2.0
869
2.3 x 104
1.6
i.s.
< 103
0.3
18
1.6 x 104
2
< 103
< 103
< 103
< 103 0.5
175
2.6 x 103
0.7
1.2
53
2.1 x 104
1.0
0.7
46
1.5 x 104
0.7
4* 4*.
45
significant substrate in h ib itio n an d we did n o t assign k cat/ K m values to th e m (s.i. in Table 2.3). Hepsin was the m ost permissive at P2, with Leu and Tyr (substrates 12 and 14) resulting in a three- to sixfold increase in k cat/ K m values. Cleavage o f su b strate 13 w as also efficient (2.0 x 104 M ' 1 • s '1) b u t lower than for m atriptase (5.2 x 105 M ' 1 • s '1). A basic am ino acid (Arg, su b strate 9) at P3 resulted in a tw ofold increase in k cat/ K m. P I ’ was n o t perm issive for Gin (substrate 17), b u t th e Ala an d Tyr su b stitu tio n s (su b strates 15 an d 18) resu lted in k cat / K m values com parable to th a t of th e reference substrate. Interestingly, DESCl was the only enzyme that was quite permissive for the P3 position. In fact, the m ost suitable su b strate for DESCl h ad a basic am ino acid (Arg) (su b strate 9) at this position (sixfold increase in k catIK m). The presence of a pair of basic residues (substrate 13) led to a fivefold increase in k cat/ K m value. Overall, th e perm issiveness of DESCl for P3, P2 an d P I ’ w as higher th a n for m a trip tase a n d h ep sin . Ala, Leu or Tyr at P3 (substrates 6 , 8 a n d 10) w as tolerated an d yielded k catI K m values th a t w ere sim ilar to th a t of th e reference (substrate 1). Leu a n d Tyr (substrates 12 and 14) at P2, and Ala, Gin and Tyr (substrates 15,17 an d 18) at P I ’ also gave the sam e kcatIK m as th e reference substrate.
TTSP cleavage o f IQF peptides w ith physiological substrate-processing sites To further analyze the capacity o f TTSPs to recognize a n d cleave p o ten tial substrates, w e u sed th e know n cleavage-site seq u en ces of th e m a trip tase su b strates filaggrin [AbzRKRRGSRG-Y(3-N02 )1, protease-activ ated re c ep to r - 2 [PAR-2 ; Abz-SKGRSLIG-Y(3 -N 0 2 )], Trask [Abz-KQSRKFVP-Y(3-N02)] an d proMSP-1 [Abz-SKLRWGG-Y(3-N02)[ (Table 2.4). Because o u r results show ed th a t Abz-RQRRW GG-Y(3-N02) was efficiently cleaved, w e searched th e Protein Inform atio n Resource d atab a se for p o ten tial su b strates w ith this particular sequence a n d fo u n d th a t th e o, 460 nm ) from 50 pM Boc-Gln-Ala-Arg-AMC over tim e using a FLX-800 TBE m icroplate re a d er (Bio-Tek In stru m en ts, W inooski, VT, USA). TTSPs w ere in cu b ated at 37 °C w ith th e p e p tid e in 100 m M MES co n tain in g 500 pg • m l'1 BSA (pH 5-7), 100 mM Tris/HCl containing 500 pg • m l'1 BSA (pH 7-9) and 100 m M CAPS co n tain in g 500 pg •m l'1 BSA (pH 9-11). The rate of AMC released at the different pH values was calculated by com paring the m axim um velocity observed for th e specific buffer u sed (relative activity).
Inhibition assays Purified an d active site-titered (2nM ) m atrip tase, m atriptase-2, h e p sin an d DESCl w ere in cu b ated w ith various in h ib ito rs (EDTA, p ep statin , bestatin, E-64, try p sin inhibitor, o-phenanthroline, AEBSF, aprotinin an d leupeptin) in 100 mM Tris/HCl (pH 8.5) containing 500 pg • m l'1 BSA at 37 °C. Residual enzym e activities w ere m easu red u sin g 50 pM Boc-GlnAla-Arg-AMC. To evaluate the inhibitory potencies of serpins, 2.5 nM m atriptase, m atriptase2, hepsin and DESCl were p rein cu b ated for 10 m in in 100 mM Tris/HCl (pH 7.4) containing 500 pg -ml"1 BSA w ith 250 nM ai-AT, ai-ACT, AT III (p reincubated w ith 50 pg - m l'1 hep arin ), PAI-1 an d oc2 -AP. TTSP inhibition efficiencies w ere evaluated by m easu rin g residual activity using 50 pM Boc-Gln-Ala-Arg-AMC.
TTSP substrate relative activities and cleavage site determ ination The su b strate preferences of trypsin, m atrip tase, m atrip tase-2 , h e p sin an d DESCl (2 nM each) w ere analyzed using 50 pM of each of th e 18 IQF p ep tid es in 100 m M Tris/HCl, pH 8.5, containing 500 pg • m l'1 BSA. The rate of release of fluorescence from the IQF peptides is reported as the m axim um velocities observed (relative activity).
53
To determ ine the site at which cleavage of IQF peptides occurred, 400 pM IQF peptides w ere digested for 3 h at 37 : C in p resen ce of 4 nM m atrip tase. P ro d u cts o f reactio n w ere diluted to a final concentration of 1 pM in 1 % acetic acid and analyzed by ESI-MS on a Synapt MS system (Waters, Milford, MA, USA).
IQF peptide substrates studies Hydrolysis of th e IQF p ep tid e su b strate s w as m easu red at 37 °C usin g a FLX-800 TBE m icroplate reader. Fluorescence w as m o n ito red (Exx 320 nm ; Emx 420 nm ) an d th e initial velocity w as calculated from th e lin ear p o rtio n of th e progress curve. Enzym atic assays w ere perfo rm ed in a final volum e o f 100 pL in 100 m M Tris/HCl (pH 8.5) co n tain in g 500 pg • m l'1 BSA. Enzyme concentrations ranged from 1 to 5 nM, d ep en d in g on th e enzym e used. Increasing co n cen tratio n s of p ep tid e s (0-200 pM) w ere in c u b ated w ith a c o n sta n t c o n cen tratio n o f enzym e, an d th e release o f fluorescence was m e a su re d for 30 m in to d eterm in e th e K m, Vmax an d fccat values. T he in n e r filter effect cau sed by th e IQF p ep tid e s w as corrected, as previously described (Liu et al., 1999). S tandard curves w ere o b ta in e d using th e signal from the N -term inal A b z-co n tain in g cleavage frag m en t co rresp o n d in g to th e reference su b strate (Abz-RQAR) an d w ere co n v erted to m o lar c o n ce n tra tio n s o f hydrolyzed product. The data were fitted to th e hyperbolic M ichaelis-M enten rate equation =
V m a x [S } /{ K m +
[5 1 )
using
g r a p h p a d p r ism
5 softw are (G raphPad Software, San Diego,
CA, USA), and kinetic constants were calculated by nonlinear regression. The initial reaction rates (u0) at a single enzyme concentration ([2£o]) are a function of the substrate concentration ([5]), th e lim iting velocity of th e reactio n {Vmax)> a n d th e co n ce n tra tio n of su b strate th a t results in half-m axim al velocity (Kro). In this case, kcat — VniaJ:/{F{:i\. IQF pep tid es did n o t show sim ple M ichaelis-M enten kinetics u n d e r satu ratio n c o n ditions for m atriptase-2. At high su b strate co n cen tratio n s, th e initial velocity decreased as a function of increasing su bstrate co n cen tratio n , indicating th a t th ere w as so m e su b strate inhibition. Initial reaction velocities for m atrip tase-2 w ere fitted to a n e q u a tio n (Eqn 2.1) describing substrate inhibition (Fersht, 1985) (a m odified form of M ichaelis-M enten equation in which K's is the binding con stan t for th e second su b strate m olecule):
kkat[Eo][S}
_
Vl
[S ] +
K m +
[SŸ/K
(2 . 1)
54
However, this m odel did n o t provide reliable kcat an d K m values for this enzym e. Only three fccai/K m values w ere d e term in e d w ith IQF p e p tid e s th at did n o t exhibit su b strate inhibition for m atriptase-2.
2.6 Acknowledgements We w ould like to th a n k Jean-B ernard D en au lt for reading the m a n u sc rip t a n d for his valuable com m ents. RL is a C hercheur N ational o f th e F onds de la R echerche e n Santé d u Q uébec (FRSQ). This work was su p p o rted by a g ran t from th e C anadian In stitu tes of H ealth Research (CIHR).
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A r t i c l e II
Essential Role o f Endocytosis o f the Type II Transmembrane Serine Protease TMPRSS6 in Regulating Its Functionality Auteurs de l’article : François Béliveau, Cédric Brûlé, A ntoine Désilets, B randon Zim m erm an, Stéphane A. Laporte, C hristine L. Lavoie and Richard Leduc. Statut de l’article : Publié dans The Journal o f Biological Chemistry (2011), vol. 286, no 33, p. 29035-29043. Avant-propos : L’article « Essential Role o f Endocytosis o f the Type II Transmembrane Serine Protease TMPRSS6 in Regulating Its Functionality » p a ru d an s The Journal o f Biological Chem istry d ém o n tre que la m atriptase-2 (TMPRSS6) possède u n m o tif au niveau de son d o m ain e cytoplasm ique responsable de son intern alisatio n à p a rtir de la surface cellulaire. C ette p ro p riété p e rm e t de contrôler son action protéolytique sur l’hém ojuvéline et ainsi réguler l'ex p ressio n de l’hepcidine, u n e horm one essentielle à l’hom éostasie du fer. Pour cet article, j’ai co n trib u é à l’élaboration et à l’exécution du travail expérim ental ainsi q u ’à l’écriture du m anuscrit. Résum é : La sérine protéase transm em branaire de type IITMPRSS6 (matriptase-2) p erm et de contrôler l’h om éostasie du fer en exerçant u n e actio n négative sur l’expression de l’h ep cid in e, u n e h o rm o n e im p o rtan te au m étabolism e d u fer. À la m e m b ra n e plasm ique, TMPRSS6 clive son su b strat cible, l’hém ojuvéline (HJV), p e rm e tta n t ainsi de réguler e n a m o n t la voie de signalisation responsable de l’expression de l’hep cid in e. À ce jour, la d y n am iq u e de l’expression à la surface cellulaire de la protéase n’a jam ais été adressée. N ous rap p o rto n s dans cette étude q u e TMPRSS6 subit u n e in tern alisatio n constitutive d an s des cellules HEK293 transfectées ainsi que dans deux lignées cellulaires h é p atiq u es hum aines, soit les HepG2 et les hépathocytes prim aires, toute deux exprim ant TMPRSS6 de façon endogène. TMPRSS6 m arq u é à la surface cellulaire est in tern alisé via u n e voie d é p e n d a n te d e la d y n am in e puis détecté au niveau de vésicules positives p o u r la clathrine et p o u r AP-2. TMPRSS6 tran site ensuite par des endosom es précoces avant de se retrouver aux lysosomes. L’internalisation de TMPRSS6 est dépendante de résidus spécifiques situés dans la région am ino-term inale de son dom aine cytoplasmique, car la m utagénèse dirigée de ces résidues bloque son internalisation et m aintient l’enzyme à la surface cellulaire. Les cellules qui co-exprim ent l’u n de ces m utants avec HJV p ro d u ise n t des niveaux sig n ativ em en t dim in u és d ’h ep cid in e e n c o m p araiso n à celles qui exprim ent TMPRSS6 de type sauvage. Cette dim inution est due à une augm entation du clivage de HJV à la surface cellulaire provoquée p ar l’accu m u latio n des m u ta n ts de TMPRSS6, incapable d ’internaliser, à la surface. Nos résu ltats soulignent p o u r la p rem ière fois l’im p o rtan ce d u trafic de TMPRSS6 à la m e m b ra n e p lasm iq u e d a n s la rég u latio n de l'expression de l’hepcidine, u n é vénem ent qui est essentiel à l’hom éostasie d u fer.
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ESSENTIAL ROLE OF ENDOCYTOSIS OF THE TYPE II TRANSMEMBRANE SERINE PROTEASE TMPRSS6 IN REGULATING ITS FUNCTIONALITY François Béliveau1, Cédric Brûlé1, A ntoine D ésilets1, Brandon Zim m erm an2, Stéphane A. Laporte2, Christine L. Lavoie1 and Richard Leduc1* 1D epartm ent of Pharmacology, Faculty of M edicine and Health Sciences, U niversité de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, CANADA, J1H 5N4 and d e p a r t m e n t o f M edicine and Pharm acology an d Therapeutics, McGill University H ealth C enter Research Institute, McGill University, M ontreal, CANADA, H3A 1A1 Running title: Internalization of TMPRSS6 *Corresponding author: Richard Leduc, Ph.D.; e-m ail: Richard.Leduc@ USherbrooke.ca
3.1 Abstract The type II tra n sm em b ran e serine p ro tease TMPRSS6 (also k now n as m atriptase-2) controls iron h om eostasis thro u g h its negative regulation o f expression of h ep cid in , a key horm one involved in iron metabolism . U pstream of the hepcidin regulated signaling pathway, TMPRSS6 cleaves its target sub strate hem o ju v elin (HJV) at th e p lasm a m e m b ra n e b u t th e dynam ics of th e protease's cell surface expression have no t b een addressed. Here we rep o rt th at TMPRSS6 undergoes constitutive internalization in transfected HEK293 cells and in two h u m an hepatic cell lines, HepG2 and prim ary hepatocytes, b o th of w hich express TMPRSS6 endogenously. C ell-surface labeled TMPRSS6 in tern alized and was d e tec te d in clathrin an d AP-2 positive vesicles via a d y n a m in -d e p e n d e n t pathw ay. The en d o cy to sed TMPRSS6 next transited in early endosom es an d th e n to lysosom es. In tern alizatio n of TMPRSS6 is d e p en d e n t on specific residues w ithin it’s N -term inal, cytoplasm ic d o m a in as site-directed m utagenesis of these residues abrogated internalization an d m ain tain ed th e enzym e at the cell surface. Cells co-expressing th ese m u ta n ts a n d HJV p ro d u ced significantly d ecreased levels of hepcidin com pared to wild-type TMPRSS6 due to the sustained cleavage of HJV at the cell-surface by TMPRSS6 m utants. Our results underscore for the first tim e the im portance of TMPRSS6 trafficking at the p lasm a m em b ran e in th e regulation of h e p cid in expression, an event th a t is essential for iron hom eostasis.
3.2 Introduction The serine p ro tease superfam ily of hydrolytic enzym es is c o m p rised of over 200 m em bers (MEROPS database (Rawlings, Barrett and Bateman, 2010)), m ost o f them secreted, soluble proteins. TMPRSS6 (m atriptase-2), a m em b er of a novel family o f type II transm em -
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b ran e serine proteases (TTSPs) th a t fu n ctio n at th e cell-surface (Bugge, A ntalis an d Wu, 2009) was originally characterized as a p ro tease m ostly expressed in th e liver (Ramsay etal., 2008) and capable of processing proteins such as type I collagen, fibronectin an d fibrinogen (H ooper et al., 2003; Velasco et al., 2002). T he p ro tease is a m osaic p ro te in co m p rised of m ultiple dom ains, including a 52-residue N -term inal cytoplasm ic dom ain (Prasad etal., 2009), a transm em brane dom ain th a t anchors th e enzym e w ithin m em branes an d an extracellular dom ain itself c o n stitu ted of m ultiple regions in clu d in g th e catalytic region. U ntil now, no function h a d b een associated to th e enzym e’s cytoplasm ic tail. TMPRSS6 is synthesized as a n inactive zym ogen w ith th e catalytic region b ein g disulfide linked to th e m a in ch ain following activation. Moreover, the enzym e u n d erg o es cell-surface sh ed d in g , releasing a soluble and active form in the extracellular m ilieu (Stirnberg etal., 2010). It exhibits m any of the enzym atic specificities of other m em bers of the TTSP family preferring Arginine residues in P4, P3 and PI positions relative to the cleaved pep tid e b o n d (Velasco etal., 2002; Béliveau, Désilets a nd Leduc, 2009). A lthough TMPRSS6 has b een associated w ith b reast an d p ro sta te can cer (Parr et al., 2007; Sanders et al., 2008), recen t rep o rts have d e m o n stra te d its d irect involvem ent in iron hom eostasis. Indeed, genetic analysis o f k in d red suffering from iro n -refracto ry iron deficiency an em ia (IRIDA) identified seq u en ce variants in th e TMPRSS6 gene conclusively dem onstrating th a t its loss is causative for this disease (Finberg etal., 2008). Concom itantly, another group using chemically induced m ouse m odels that showed progressive loss of body h air an d m icrocytic an em ia (Du e ta l, 2008) fo u n d th a t th e p h en o ty p e w as cau sed by high levels of hepcidin, th e m ajor h o rm o n al regulator of iron in m am m als, this itself d u e to a splicing defect in the TMPRSS6 gene. O ther n o n sen se m u tatio n s w ithin th e TMPRSS6 gene were also found in patien ts suffering from m icrocytic an em ia and iron deficiency (Guillem etal., 2008; Melis etal., 2008). The involvem ent of TMPRSS6 in hepcidin regulation a n d iron h o m eostatis was initially discovered in a m ouse m u ta n t (mask), th e p h e n o ty p e of w hich resulted from a reduced absorp tio n of d ietary iron cau sed by high levels o f h e p cid in due to a splicing defect of TMPRSS6 (Du e ta l., 2008). M echanistically, TMPRSS6 co n tro ls iron hom eostasis by repressing the expression of th e HAMP gene, w hich en co d es h ep cid in , the m ajor horm onal regulator of iron m etabolism (N em eth an d Ganz, 2009). The link betw een TMPRSS6 an d h ep cid in involves th e cleavage by TMPRSS6 of hem ojuvelin (HJV) (Silvestri eta l., 2008), w hich acts as a b o n e m o rp h o g en etic p ro te in (BMP) co recep to r (B abitt eta l.,
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2006), thereby affecting the BMP/SMAD signalling pathw ay and activation of the HAMP gene. M utations p resen t in IRIDA patien ts w ithin specific TMPRSS6 extracellular d o m ain s affect either 1) translocation of the enzyme to the cell surface, which leads to increased intracellular reten tio n resulting in the im p a irm e n t of efficient HJV cleavage at th e cell surface, o r 2) th e enzym e’s capacity at being activated (Silvestri e ta l, 2009). Here we show th a t TMPRSS6 is constitutively in ternalized a n d th a t its endocytosis is d e p e n d e n t on m otifs found w ith in its cytoplasm ic tail. O ur results d e m o n stra te th a t a m e m b e r of the TTSP family u n d erg o es d y n am ic trafficking at th e cell surface th ereb y suggesting a way by w hich accessibility to its su b strate can b e controlled.
3.3 Experimental procedures Cells, antibodies and reagents HepG2 an d HEK293 w ere p u rc h a se d from ATCC (M anassas, VA, USA) a n d p rim ary hum an hepatocytes were from Zen-Bio (Chapel Hill, NC, USA). Cells were cultured in DMEM containing 10 % fetal bovine seru m (FBS), penicillin, a n d streptom ycin (W isent, St-Bruno, CAN). Serum-free 293 SFMII m edium was from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) an d prim ary hepatocyte plating an d m a in te n an c e m ed iu m w ere from Zen-Bio. Cells w ere tran sfected using polyethyleneim ine (PEI) (Polysciences, W arrington, PA, USA) as previously described (E hrhardt eta l., 2006). Anti-V5 mAb w as from Invitrogen, anti-HA (H A .ll) mAb a n d pAb from Covance (Emeryville, CA, USA), N a+/K+-ATPase pAb, clathrin heavy ch ain (D3C6) an d caveolin-1 (D46G3) rabbit mAb from Cell Signaling Technology (D anvers, MA, USA), Early E ndosom al A ntigen 1 (EEA1) mAb from BD T ransduction L aboratories (San Diego, CA, USA) an d pAb (PA1-063A) from T herm o Scientific (Rockford, IL, USA), LAMP-2 mAb (H4B4) was from the University of Iowa (Iowa City, LA, USA) an d pAb (ab37024) from A beam (Cam bridge, MA, USA), anti-actin mAb (A3853) a n d anti-HJV (HPA014472) from SigmaA ldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-TMPRSS6 pAb w as developed in co llab o ratio n w ith 21st Century Biochemicals (Marlboro, MA, USA). The Tyramide signal am plification (TSA) kit with HRP-goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyram ide was from Invitrogen. Boc-Gln-Ala-ArgAMC was from Bachem Bioscience, Inc. (King of Prussia, PA, USA). A m icon U ltra Centrifugal Filters (Ultracel 3K) w ith 3,000 MW cu t off were from Millipore (Cork, Ireland). Poly-L-Lysine an d Collagen I coated glass coverslips (BD BioCoat) w ere from BD B iosciences (Bedford, MA, USA). Lysosomal inhibitors (leupeptin, p e p sta tin , E-64) were from Roche D iagnostics
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(M annheim , G erm any) an d E-64d from Sigm a-Aldrich. siRNA pools targ etin g TMPRSS6 (TMPRSS6 ON-TARGETplus SMARTpool) an d n o n -targ etin g siRNA pool (ON-TARGETplus N on-targeting pool) were from T herm o Scientific D harm acon (Lafayette, CO, USA).
Plasmid Constructions and Site-directed M utagenesis H u m an TMPRSS6 cDNA w as o b ta in e d from C. Lopez-O tin (U niversidad de Oviedo, Spain) an d inserted in pcDNA6/V5 (Invitrogen). HA-tagged dom inant-negative dynam in-1 (K44A) (HA-dynamin-1 K44A/pcDNA3.1) w as o b tain ed fro m Dr. S andra Schm id (Scripps Research Institute, CA). TMPRSS6 m u ta n ts w ere g en erated using th e Q uikC hange II XL m utagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) as described by the m anufacturer. YFP-tagged P2 -ad ap tin (pEYFP-Nl) w as describ ed elsew here (Fessart e t al., 2007). Plasm id en co d in g h u m an HJV variant A was from OriGene Technologies, Inc. (Rockville, MD, USA). Expression of all proteins was u n d er th e control of th e h u m a n cytomegalovirus (CMV) im m ediate-early prom oter.
Biotinyiation Assays HEK293 cells were transfected with 1 pg of TMPRSS6-V5 plasm id using 4 pg PEI in 6-cm plates. After a 24-h transfection, biotinyiation of HEK293 surface proteins was perform ed with Pierce Cell Surface Protein Isolation Kit (Therm o Fisher Scientific). Cells w ere in cu b ated a t 37 °C in com plete DMEM for various time, washed, th e n left u n treated or treated w ith biotin cleavage solution (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 50 mM so d iu m 2 -m ercap to eth an esu lfo n ate (MesNa) (pH 8.6)) for 2.5 h prior to lysis. Biotinylated proteins were p recip itated w ith avidin and resulting sam ples were loaded on a 10 % SDS-PAGE gel th en analyzed by im m unoblotting using anti-V5 antibodies (TMPRSS6) an d Na+/K+-ATPase antibodies.
Im m unofluorescence Cells were seeded on 12 m m or 22 m m coverslips (poly-lysine co ated for HepG2 cells an d Collagen I for prim ary h u m a n hepatocytes) p laced in 6-well plates. W hen indicated, cells w ere transfected w ith 1 pg of p lasm id using 4 pg PEL After a 24-h tran sfectio n , cell surface TMPRSS6 was labeled w ith anti-V5 or anti-TMPRSS6 an tib o d ies for 1 h at 4 °C in serum -free DMEM. Cells were th e n w ashed an d in cu b ated in com plete DMEM at 37 °C for
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various period of time. Protocol for cell preparation was described elsew here (Brodeur et al., 2009). D etection signal of endogenous TMPRSS6 in HepG2 an d prim ary h u m an hepatocytes was am plified with TSA kit.
Treatment w ith lysosom al inhibitors Cells w ere in cu b ated for 6 h a t 37 °C in com plete DMEM c o n tain in g 1 m g - m l'1 of leupeptin, 10 pg ■m l'1 of E64 (HEK293 cells) or E-64d (hepatocytes) and 70 pg • m l'1 pepstatin as previously published (Brodeur et a l, 2009).
Expression o f TMPRSS6 m utants HEK293 cells were tran sfected w ith 1 pg plasm id u sin g 4 pg PEI in 6-wells plates. Plasm ids u sed w ere WT TMPRSS6-V5, catalytically dead m u ta n t (S762A), p e n ta -a la n in e m u ta n ts or single alanine m u ta n ts of th e 2-11 region of th e cytoplasm ic tail of TMPRSS6. After 24-h transfection, cell m edia w ere replaced by serum -free 293 SFM II for a n o th e r 24-h. Cells w ere th e n lysed an d cell m ed ia collected an d c o n ce n tra te d w ith 3,000 MWCO centrifugal filters (Amicon). Resulting sam ples were loaded on a 10 % SDS-PAGE and analyzed by im m unoblotting w ith anti-V5 antibody.
Proteolytic activity m easurem ents HEK293 cells were transfected w ith 1 pg plasm id using 4 pg PEI in 6-well plates. After 24-h transfection, the m ed iu m was rep laced by serum -free 293 SFM II for 72 h. Enzym atic assays were th e n perform ed w ith serum -free m ed iu m in 100 m M Tris-HCl, pH 9, containing 500 pg • ml"1 bovine serum album in. Enzyme activity was m onitored by m easuring the release of fluorescence (excitation, 360 nm; em ission, 441 nm ) from Boc-Gln-Ala-Arg-AMC (50 pM) for 20 m in at 37 °C in a FLX-800 TBE m icroplate read er (Bio-Tek Instrum ents, W inooski, VT, USA). Activity was norm alized by cell lysate total p ro te in (jig) and p re se n te d as fold over w ild-type (WT).
Hemojuvelin processing by TMPRSS6 HEK293 cells w ere cotransfected w ith 1 pg HJV an d 1 pg TMPRSS6-V5 plasm ids using 8 pg PEI in 6-well plates. Plasm ids u sed w ere WT TMPRSS6-V5 or single alan in e m u ta n ts
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of 2-11 region of th e cytoplasm ic tail. After 24-h tran sfectio n , cell m ed ia were replaced by serum -free 293 SFM II for an o th er 24-h. Cells w ere th e n lysed an d m ed ia collected an d concentrated w ith 3,000 MWCO centrifugal filters (Amicon). Resulting sam ples were loaded on a 10 % SDS-PAGE and analyzed by im m unoblotting w ith anti-V5 and anti-HJV antibodies.
siRNA transfection siRNAs were transfected using DharmaFECT 4 Transfection Reagents according to th e m anufacturer’s instructions (D harm acon).
Hepcidin quantification H epcidin-25 was assessed in co n cen trated cell m edia by a com petitive ELISA m ethod, using Hepcidin-25 - EAI com m ercial kit (Bachem, San Carlos, CA, USA).
3.4 Results Cell-surface TMPRSS6 is internalized Since regulation of HAMP involves cleavage o f HJV by TMPRSS6, w e re a so n e d th a t there could be a regulatory step n ecessary for controlling th e levels of HJV, th e p resen ce of w hich is p a ra m o u n t to th e dow nstream signaling a n d tran scrip tio n al activation o f HAMP. To determ in e the dynam ics o f TMPRSS6 cell-surface expression a n d its trafficking path, we exam ined the e n d o cy tic/in tern alizatio n capacity of b o th an e p ito p e tagged form of TMPRSS6 heterologously expressed in HEK293 cells an d th e endogenous p ro tein in HepG2 cells an d in h u m a n prim ary hepatocytes. To exam ine w h e th er TMPRSS6 is p re se n t at th e plasm a m em b ran e an d is internalized, w e u sed a cell-surface biotinyiation assay. HEK293 cells transiently transfected w ith a carboxy-term inal, extracellular V 5-tagged TMPRSS6 (TMPRSS6-V5) co n stru ct w ere labeled w ith m e m b ra n e im p erm eab le b io tin (sulfo-NHSSS-biotin) and kept at 4 °C (0 min) to prevent internalization or incubated at 37 °C for various tim es (5, 10, 20, 30 an d 60 min) to allow in tern alizatio n (Fig. 3.1A). Cells w ere th e n kept at 4 °C to prevent further internalization, cell-surface bio tin was cleaved w ith so d iu m 2m ercaptoethanesulfonate (MesNa), a m em b ran e im p erm ean t reducing agent, an d to tal cell lysates were analyzed by SDS-PAGE an d im m unoblotting. Figure 3.1 A shows th a t TMPRSS6 migrates as a 125 kDa band, corresponding to the predicted m olecular weight of the N-linked
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glycosylated protease. We com p ared th e biotinyiation o f th e TMPRSS6 p o p u latio n to th at of N a+/K+-ATPase, a p ro tein th a t does n o t intern alize in o u r co n d itio n s (Na+/K+-ATPase undergoes internalization only w h en HEK293 cells are stim ulated, see Pierre, Belliard and Sottejeau (2011). As expected, biotinylated Na+/K+-ATPase w as no t p ro te c ted from MesNa cleavage indicating th a t this p ro tein w as n o t internalized. However, we fo u n d th a t after 5 m inutes of incubation, a subset of biotinylated TMPRSS6 was protected from cleavage, which suggested internalization within intracellular com partm ents; further tim e points (10-60 min) led to the detection of increased levels of p ro tected TMPRSS6.
A Internalization C le a v ag e
(mm)
0 -
0 5 + +
10 +
20 +
30 +
60 + T M PR SS6 (Biotinylated) Na*/K*-ATPase (Biotinylated) T M PR SS6 (Cell lysate)
Figure 3.1 TMPRSS6 undergoes internalization (A) HEK293 cells transfected with TMPRSS6-V5 were surface-biotinylated with sulfo-NHS-SS-biotin and incubated at 37 °C for the indicated time (internalization). Cells were left untreated (-) or treated (+) with MesNa (cleavage) for 2.5 h on ice. Biotinylated proteins were precipitated with avidin and samples were analyzed by immunoblotting with antibodies against V5 (upper panel) and Na+/K+ATPase (middle panel). Total cell lysate was also analyzed to assess TMPRSS6 expression levels (lower panel) {n = 3). HEK293 cells transfected with TMPRSS6-V5 (n =3) (B), untransfected HepG2 cells (n = 3) (C) and primary hum an hepatocytes (D) were cell-surface labeled with anti-V5 or antiTMPRSS6 antibodies and incubated for different times (0-60 min) at 37 °C prior to processing for confocal fluorescence microscopy analysis. Anti-V5 and anti-TMPRSS6 immunofluorescence are displayed in green and Hoechst-stained nucleus in blue. Scale bar: 50 pm. We next exam ined intern alizatio n of TMPRSS6 in transiently tran sfected HEK293 cells, in HepG2 cells an d in h u m a n p rim ary h ep ato cy tes u sin g confocal m icroscopy. To directly observe the internalization p h en o m en o n , we first labeled TMPRSS6-V5 transiently expressed in HEK293 cells w ith a specific V5 m o n o clo n al antib o d y at 4 °C to prev en t any internalization. The antibody-tagged TMPRSS6-V5 expressing cells w ere th e n in cu b ated
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at 37 °C to allow internalizatio n (Fig. 3 .IB). At initial tim e p oints a n d for a 5 m in p erio d at 4°C (Fig. 3 .IB), TMPRSS6-V5 w as p re sen t at th e p la sm a m e m b ra n e of tran sfected cells consistent w ith th e accessibility to cleavage w ith M esN a after b io tin y iatio n (Fig. 3.1A). After 10 a n d 20 m in at 37 °C, labeling w as fo u n d in vesicular stru ctu res n e ar th e p lasm a m em brane, w ith som e fluorescence retain ed at th e p la sm a m em b ran e. B eginning at 30 m in and especially at 60 m in, th e m ajority of th e enzym e w as found in large vesicles in th e juxtanuclear region further dem onstrating tran sp o rt of th e p rotein in to th e cytoplasm . This observed internalization could explain th e p artial p ro te c tio n from b io tin cleavage startin g at 10 m in u tes of in cu b atio n tim e an d th ro u g h to 60 m in u te s (Fig. 3.1A). To exam ine this phenom enon in cells endogenously expressing TMPRSS6, we first raised an antibody against a peptide sequence found within the enzym e’s catalytic region (see supplem ental Fig. 3.SF1A, which shows specificity of the antibody using blocking peptides) and used it to observe similar internalization dynam ics in HepG2 cells an d in p rim ary h u m a n hepatocytes endogenously expressing TMPRSS6 (Fig. 3.1C an d 3 .ID). Collectively, th e se results d e m o n strate th a t cellsurface TMPRSS6 undergoes internalization.
Characterization o f TMPRSS6 internalization pathway O ur observations on the in tern alizatio n of TMPRSS6 p ro m p te d u s to investigate th e endocytic pathw ay by which this is m ediated. Since dynam in-m ediated endocytosis is a m ajor form of endocytosis involved in in tern alizatio n of cell-surface p ro tein s su ch as recep to rs (Damke etal., 1994), we first exam ined w hether TMPRSS6 endocytosis was dynam in m ediated. As show n in Figure 3.2A, th e expression of a d o m inant-negative m u ta n t form o f d y n a m in -1 (K44A), w hich inhibits clathrin- an d caveolin-m ediated endocytosis (C onner an d Schm id, 2003), abrogated internalizatio n and m ain ta in ed TMPRSS6 at th e p lasm a m e m b ra n e in HEK293 cells transiently expressing TMPRSS6-V5. Sim ilar results w ere o b ta in e d in HepG2 cells. Indeed, Figure 3.2A clearly shows th a t in HepG2 cells n o t expressing d y n a m in -1 K44A, TMPRSS6 was internalized (box 1) w hereas TMPRSS6 was m ain tain ed at th e cell surface in dynam in-1 K44A expressing cells (box 2). To m ore precisely define th e co m p artm e n ts w here cell-surface labeled TMPRSS6 is internalized, we carried out d ouble labeling for TMPRSS6 and endocytic m arkers in HEK293 cells transiently expressing TMPRSS6-V5. After short internalization periods (5 min), TMPRSS6 partially colocalized with the clathrin-coated vesicle (CCV) m arkers p2 -adaptin and
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Figure 3.2 C haracterization of TMPRSS6 internalization pathw ay (A) HepG2 and HEK293 cells were transfected with HA-tagged dominant-negative dynamin-1 K44A in the presence (HEK293) or absence (HepG2) of TMPRSS6-V5. Cell-surface TMPRSS6 was labeled on ice with anti-V5 (HEK293) or anti-TMPRSS6 (HepG2) and incubated at 37 °C for lh . Cells were fixed, permeabilized and immunostained using anti-HA followed by fluorescent secondary antibodies. Box 1: dynamin-1 K44A untransfected cell; box 2, transfected cell [n = 3) (B) HEK293 cells transfected with TMPRSS6-V5 in the absence or presence of YFP-tagged (32-adaptin and primary human hepatocytes were co-stained for TMPRSS6 and different endocytosis markers. Cell-surface TMPRSS6 was labeled on ice with anti-V5 (HEK293) or anti-TMPRSS6 (hepatocytes) and incubated at 37 °C for 5 or 10 min. TMPRSS6 immunofluorescence is displayed in green and YFP, anti-clathrin or anti-EEAl in red {n = 3). (C) Cell-surface TMPRSS6 of HEK293 cells transfected with TMPRSS6-V5 and primary human hepatocytes were labeled on ice with anti-V5 (HEK293) or anti-TMPRSS6 (hepatocytes) and incubated at 37 °C for 6 h in presence of lysosome protease inhibitors leupeptin (1 mg • ml"1), pepstatin (70 pg •ml'1) and E-64 (HEK293 cells) or E-64d (hepatocytes) (10 pg • m l'1) [n = 3). TMPRSS6 immunofluorescence is displayed in green, LAMP-2 in red and Hoechst-stained nucleus in blue. Yellow color and white arrowheads indicate colocalization. Scale bar: 50 pm. clathrin in p u n c tate structures along the p lasm a m em b ran e (Fig. 3.2B). No colocalization was observed w ith caveolin-1 (su p p lem en tal Fig. 3.SF2). To d eterm in e th e n atu re o f the com partm ents to w hich TMPRSS6 next traffics, we carried ou t double labeling of TMPRSS6 an d EEA1, a m arker for early endosom es (Mu et a i, 1995). TMPRSS6 colocalized w ith EEA1 after a 10 m in internalization p erio d in tran sfected HEK293 cells an d in p rim ary h u m an hepatocytes suggesting its transp o rt to early endosom es (Fig. 3.2B). In order to determ ine w h eth er TMPRSS6 fu rth er transits to lysosom es, w e next com pared its localization with LAMP-2, a lysosom al marker. Figure 3.2C shows th at after 6 hours
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of internalization an d in presence o f lysosom al inhibitors, TMPRSS6 partially colocalized w ith LAM P-2-labeled structures b o th in tran sfected HEK293 cells a n d in p rim ary h u m a n hepatocytes. Taken together, o u r results suggest th a t TMPRSS6 traffics to early en d o so m es via clathrin-coated vesicles in a d y n a m in -d e p en d e n t m anner, w here it is th e n so rted to th e lysosomes.
The cytoplasm ic tail o f TMPRSS6 is involved in its internalization In o rd er to b etter u n d e rsta n d th e m o lecu lar d e term in a n ts involved in TMPRSS6 internalization, we initially A lanine-scanned th e 52-residue N -term inus by constructing ten penta-Ala m utants that cover the entire cytoplasm ic tail and expressing them in HEK293 cells (Fig. 3.3A). We also constructed a TMPRSS6 catalytically inactive m u tan t (S762A) whereby the catalytic serine of the protease was replaced w ith Ala to exam ine w hether proteolytic activity plays a role in the internalization process. C onstructs for all eleven m u ta n ts w ere tran sfected in HEK293 cells a n d cells w ere labeled w ith V5 antibody. Cells were further in cubated in com plete DMEM for 30 m inutes at 37 °C to allow internalization. Interestingly, tw o ou t of the eleven m u ta n ts (2-6A a n d 7 -1 1A) failed to undergo intracellular sequestration and rem ained mostly at the cell surface w hereas all other m u tan ts behaved similarly to w ild-type in their internalization capacity (Fig. 3.3B). Furtherm ore, the S762A m utant exhibited sim ilar internalization properties to WT suggesting th at enzyme’s proteolytic activity is n o t involved in internalization. Im m unoblotting analysis o f cell lysates of th ese m u tan ts reveals th a t th ey are equally expressed (Fig. 3.3C, u p p e r panels). C ell-surface TMPRSS6 is know n to u n d erg o a com plex m a tu ra tio n p ro cess th a t includes activation an d su b seq u en t sh ed d in g from th e p lasm a m em b ran e (Stirnberg et al., 2010; Silvestri et al., 2008, 2009; A ltam ura e t al., 2010; Ram say et al., 2009). H ence, m ultiple form s are generated, m ost of th e m th e result o f autocatalysis. Im m u n o b lo ttin g analysis of m edia originating from cells expressing w ild-type a n d m u ta n t TMPRSS6 (Fig. 3.3C, m iddle panels) reveals different shed form s d etectab le as fragm ents m igrating at 90, 85, 75,32 an d 30 kDa. First, the larger 90 kDa form c an originate from a cleavage w ith in th e enzym e’s SEA dom ain, sim ilar to th at observed for m atrip tase (Oberst etal., 2003) w hile th e 75 an d 85 kDa fragm ents w ould be the co n seq u en ce of proteolysis at Arg413 and Arg446 w ith in th e stem region leading to cell surface release (Stirnberg etal., 2010). All these larger form s w ould n ot carry proteolytic activity because no cleavage has occurred at the activation peptide, an event
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3). **** PcO.OOl. observed in transiently transfected HEK293 cells b u t also in th e physiologically relevant HepG2 cells an d in p rim ary h u m a n h ep ato cy tes th a t en d o g en o u sly express TMPRSS6. At later tim e points, TMPRSS6 was d e tected in LAMP-2 labeled vesicles suggesting th a t th e protease eventually transits to lysosom es w here it m ay be degraded. Internalization of cell-surface proteins is frequently m ed iated by m otifs fo u n d w ithin their cytoplasm ic tail (Kozik eta l., 2010). Initially, we screened for im p o rtan t regions w ithin the cytoplasm ic tail of TMPRSS6 by usin g p e n ta-ala n in e m u ta n ts a n d identified a m in o term inal region 2-11 as essential for internalization. Interestingly, th is region co n tain s a
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dileucine m otif (L2 an d L3), a d e te rm in a n t th a t is o ften fo u n d in cell-surface p ro tein s th a t undergo internalization. These motifs found in m em b ran e proteins have b een show n to act as endocytic a n d /o r constitutive sorting signals th ro u g h in teractio n w ith th e AP-2 ad ap to r pro tein (Bonifacino an d Traub, 2003). Interestingly, however, the d ileu cin e m o tif fo u n d in TMPRSS6 seem s atypical from th e can o n ical [D/E]XXXL[L/I] seq u en ce observed in m ost trafficking proteins, as it lacks an upstream acidic residue. Our data are nonetheless consistent w ith th e recent findings th a t dileucine m otifs o n th e ir ow n can still act as in tern alizatio n signals (Kozik et a l, 2010) and th at m any other trafficking proteins w ith such motifs also lack acidic residue at position -4 , b u t in stead rely on o th er hydrophilic residues dow nstream of the dileucines {e.g., LLXXXS in TMPRSS6) (Bonifacino and Traub, 2003). Using single alanine m u tatio n of the am ino acids of th e 2-11 region, we fo u n d th a t the L2 an d L3 residues play a role in internalization but th a t three oth er determ in an ts (F5, S7 and K8) are also involved in this process. Internalization is a w ell-know n regulatory process for G p rotein co u p led receptors as well as for grow th factor receptors su ch as tyrosine kinase recep to rs w here it plays a role in desensitization a n d signaling (Posner an d Laporte, 2010). However, in tern alizatio n of m em brane proteases and th e co n seq u en ces th ereo f h as n o t b een extensively studied. An example of a serine protease th a t undergoes internalization is furin, a type I transm em brane p ro tein w here routing is a dynam ic event show n to b e d e p e n d e n t o n th e p h o sp h o ry latio n state of its cytoplasm ic tail (Jones et al., 1995). R eports have also show n th a t MT1-MMP, an integral type I tra n sm em b ran e m etallo p ro tein ase involved in cleaving ECM proteins, undergoes dynam in-dependent endocytosis using both clathrin-m ediated and in d ep en d en t pathw ays (R em ade, M urphy an d Roghi, 2003). Finally, very recent d a ta reveal how a n o th er m em ber of th e TTSP family, m atriptase, accum ulates in intracellular stru ctu res (Friis etal., 2011) bringing su p p o rt to the n o tio n th a t these proteins undergo dynam ic trafficking. Recently, it was determ ined that cell-surface shedding was the only know n m echanism by which TMPRSS6 activity could be regulated (Silvestri etal., 2009). Our results reveal that, in addition to shedding, internalization of TMPRSS6 can also act as a cellular m ode of TMPRSS6 regulation w ith direct consequ en ces o n th e p ro cessin g of specific cell-surface su b strates such as HJV. Identifying an d u n d e rstan d in g th e m o lecu lar d eterm in a n ts a n d m ech an ism s controlling this event can lead to the potential m odulation of internalization rates and hence, cell-surface levels of TMPRSS6. M odulation of the levels of TMPRSS6 at the cell surface could
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conceivably lead to the eventual control of system ic iron levels. Interestingly, use of p ep tid e aptam ers that can bind the LLY internalization m otif located in M Tl-M M P’s cytoplasm ic tail has prevented its internalization causing accum ulation at th e cell surface (W ickramasinghe, Ferrigno and Roghi, 2010). Thus, one could envisage th e m odulation of TMPRSS6 cell-surface localization and proteolytic activity by targeting its cytoplasm ic tail. In this study, we reveal a novel m ech an ism for TMPRSS6 regulation th ro u g h p lasm a m em b ran e in tern alizatio n an d identified key residues w ith in its cytoplasm ic tail th a t are im portant in sequestering the enzym e w ithin th e cell. Further studies will be n eed ed to fully u n d e rstan d the underlying m ech an ism s regulating TMPRSS6 trafficking a n d th e ex ten t to w hich such regulation has on iron hom eostasis and in situations of iron im balance.
3.6 Acknowledgements B.Z. holds a B anting a n d Best CIHR stu d en tsh ip aw ard. SA.L. is a C an ad a R esearch Chair in Molecular Endocrinology and C.L.L. is a C anada Research Chair in Cellular Pharmacology. This work was supported by a grant to R.L. and C.L.L. from th e C anadian Institutes of H ealth Research (CIHR).
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3.8 Supplem ental figures blocking peptide
+ blocking peptide
siRNA
Figure 3.SF1 Specificity of TMPRSS6 antibody and siRNA pools (A) HepG2 cells were grown on coverslips and surface-labeled on ice with anti-TMPRSS6 (- blocking peptide) or with anti-TMPRSS6 preincubated with blocking peptide (+ blocking peptide) prior to fixation. Anti-TMPRSS6 immunofluorescence is displayed in green and Hoechst-stained nucleus in blue. Scale bar: 50 pM. (B) HepG2 cells were co-transfected with WT TMPRSS6-V5 and non-targeting siRNA (scrambled) or TMPRSS6 siRNA pools. Expression was detected by Western blotting with an anti-V5 antibody. Equal amount of cell lysate (CL) was loaded on a 10 % SDS-PAGE gel. Cell lysate actin was blotted as loading control.
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TMPRSS6
Caveolin-1
Figure 3.SF2 TMPRSS6 does n o t colocalize w ith caveolin-1 HEK293 were grown on coverslips and transfected with WT TMPRSS6-V5. Cell-surface TMPRSS6 was labeled 1 h on ice with anti-V5 and cells were immediately fixed (0 min) or fixed after an incubation of 5, 10, 20, 30 or 60 min at 37 °C in complete medium. Cells were permeabilized and caveolin-1 was labeled with a specific antibody (n = 2). TMPRSS6-V5 was labeled with Alexa 488-coupled secondary antibody {green) and caveolin-1 with Alexa 594 (red). Scale bar: 50 pM.
D isc u ssio n
Le fer est im pliqué dans u n e m u ltitu d e de fonctions com m e le tra n sp o rt d ’oxygène et la catalyse des réactions de transfert d ’électrons, d e fixation d ’azote o u d e synthèse d ’ADN. Sa régulation est essentielle, car il p e u t être égalem ent toxique en raiso n de sa cap acité à réagir avec l’oxygène et à catalyser la p ro d u ctio n d e form es radicalaires. Pour cette raison, l’organism e possède différents m écanism es nécessaires à sa régulation. L’un des principaux m écanism es assurant son contrôle im plique sa disponibilité dans la circulation sanguine. La présen ce d u fer d an s le systèm e vasculaire est p rin c ip a le m en t contrôlée par le tran sp o rteu r ferroportine (FPN), qui régule son entrée en provenance de la digestion au niveau de l’intestin, son recyclage à partir de la dégradation des érythrocytes au niveau des m acrophages et sa sortie des réserves co n ten u es dans les hép ato cy tes (Andrews et Schm idt, 2007). Le contrôle de ces tra n sp o rte u rs est assuré p a r u n e h o rm o n e p e p tid iq u e p ro d u ite p a r les hépatocytes, l’hepcidine. C ette h o rm o n e, en se lia n t aux ferroportines, provoque leur internalisation puis leur dégradation. La dim in u tio n d e la qu an tité de ferroportine p ar l’hepcidine fait de ce dernier un régulateur négatif de la q u an tité de fer en circulation. C ette h o rm o n e est, elle aussi, soum ise à u n p ro cessu s de régulation. R écem m ent, la m atrip tase-2 a été identifiée co m m e é ta n t u n rég u lateu r d e son expression au n iv eau des hépatocytes. Cette protéase à sérine tran sm em b ran aire p erm et de contrôler l’expression d u gène de l’hepcidine en clivant l’hém ojuvéline à la surface cellulaire. É tant d o n n é le rôle im p o rtan t d e cet enzym e d an s le processus d 'h o m éo stasie d u fer e t son im plication dans de nom b reu x cas d ’aném ie réfractaire au fer (IRIDA), sa spécificité enzym atique a été étudiée ainsi que sa régulation fonctionnelle.
4.1 Spécificité enzym atique de la m atriptase-2 par rapport à d’autres TTSP La m atriptase-2 ainsi que les au tres m em b res de la fam ille des TTSP p o ssè d e n t des caractéristiques c o m m u n es d o n t u n d o m ain e cytoplasm ique, u n d o m a in e tra n sm e m b ra naire ainsi q u ’u n e région extracellulaire p o sséd an t différents d o m ain es d o n t u n d o m ain e catalytique dans sa portion carboxyterm inale. D ans le cas de la m atriptase-2, l’étu d e d e son d o m ain e catalytique est in té re ssa n t car une meilleure connaissance de sa spécificité pourrait perm ettre de développer des inhibiteurs contre elle. Le développem ent de tels inhibiteurs pourrait avoir des utilités dans le traitem ent de m aladie com m e l’hém ochrom atose qui provoque une surcharge en fer (Pietrangelo, 2010).
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L’inhibition de la m atriptase-2 pourrait dim inuer le clivage de l’hém ojuvéline et ainsi favoriser l’expression de l’hepcidine, ce qui p erm ettrait de dim in u er les quantités de fer d an s le sang. É tant d o n n é que les différentes TTSP p o ssè d e n t u n e forte id e n tité d e séq u en ce au niveau de leur dom aine catalytique (~40 %), la spécificité de la m atriptase-2 a été com parée avec celle de son plus proche hom ologue, la m atriptase, ainsi q u ’à deux au tres TTSP de sous-fam illes différentes, l’hepsin e et DESC1.
4.1.1 Spécificité envers les substrats Afin de com parer la spécificité enzym atique des différentes TTSP, des form es recom bi nantes de celles-ci ont été exprim ées et purifiées (voir figure 2.1). Les propriétés enzym atiques de la m atriptase, de la m atriptase-2, de l’hepsine et de DESC1 ont été com parées en utilisant u n e série d ’o ctap ep tid e-su b strats à fluorescence séq u estrée, aussi n o m m é « internally quenched fluorogenic peptides» (IQF). Pour ces différents substrats, la fluorescence est attribuable au g ro u p em en t o-am inobenzoyle (Abz) situé e n p o sitio n a m in o te rm in a le et la séquestration de ce signal est attribuable à la 3-nitro-tyrosine en p o sitio n carboxyterm inale. Le clivage de ce peptide perm et la séparation d u fluorophore de la partie séquestrante, ce qui p erm et la détection de la fluorescence. La séquence des 18 peptides IQF utilisés est basée sur la région P4 à P4’ de la séquence d ’activation de la m atriptase (RQAR-WGG). Chez ces peptides, la position PI a été fixée à Arg alors que les positions P4, P3, P2 et P I ’ o n t été substituées p a r des acides am in és ayant des propriétés physico-chim iques différentes : n o n -p o laire (Ala, Leu), a ro m a tiq u e (Tyr), acide (Glu) et basique (Arg). L’analyse de l’actitivé relative des différents enzym es à une c o n ce n tra tio n fixée d e substrat (50 pM) a perm is d ’obtenir u n portrait d ’ensem ble de leur spécificité (figure 2.3). Ces résultats p erm etten t d ’observer q ue la m atriptase-2 sem ble la m oins perm isive alors que la m atriptase est la plus restrictive, l’hepsine et DESC1 se situant entre les deux. Pour confirm er que les clivages se p ro d u isen t aux p o sitio n s p réd ites (entre P I et P I ’), le site de clivage de tous les peptides clivés a été confirm é p a r spectrom étrie de m asse (résultats n o n publiés). Afin de mieux évaluer la spécificité des TTSP, les param ètres cinétiques de la m atriptase, m atriptase-2, hepsine et DESC1 o n t été d éterm in és en u tilisan t le m odèle cin étiq u e de M ichaelis-M enten (tableau 2.3). Une prem ière analyse p erm et d ’observer que la m atriptase2, à la différence des autres, ne p ré sen te pas p o u r to u s les su b strats utilisés u n e cin étiq u e de M ichaelis-M enten, mais présente u n e inhibition p ar le su b strat lorsque la co n cen tratio n en substrat augm ente (figure 2.4). L’inhibition p ar le substrat est un p h é n o m èn e observable chez environ 20 % des enzymes. Au niveau des protéases, elle touche en tre autres la trypsine et la carboxypeptidase (Reed, Lieb et N ijhout, 2010). D ans ce type d ’inh ib itio n , l’enzym e
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possède deux sites de liaison p o u r son su b strat : u n site catalytique qui p e rm e t d ’o b te n ir le p ro d u it et un site n o n-cataly tiq u e (allostérique) qui p e rm e t de d im in u e r sa vitesse de form ation (Reed, Lieb et Nijhout, 2010). L’in h ib itio n p ar le su sb strat p e u t parfois p o sséd er u n e fonction biologiques im p o rtan te. À titre d ’exem ple, l’in h ib itio n p a r le su b strat de la tyrosine hydroxylase résulte en une synthèse stable de la dopam ine en dépit des im portantes fluctuations e n tyrosine proven an t de l’alim en tatio n et celle de l’acétylcholinestérase a m é liore le signal n eu ro n al et p e rm e t u n e term in aiso n rap id e d u signal (Reed, Lieb et N ijhout, 2010). D ans le cas de la m atriptase-2, il serait in téressan t d ’observer si u n e co n ce n tra tio n élevée en hém ojuvéline p e u t provoquer u n e inhibition par le substrat, ce qui perm ettrait de réguler le clivage de l’hém ojuvéline p ar la m atriptase-2. Pour la m atriptase, des résu ltats an térieu rs u tilisan t l’ap p ro ch e PS-SCL (Positional scanning synthetic com binatorial peptide libraries) (Harris e t a l , 2000) o n t d é m o n tré u n e préférence p o u r Arg/Lys e n P4, u n acide am in é n o n -b a siq u e en P3, u n e Ser en P2, u n e Arg en PI et u n e Ala en P I ’. Nos résu ltats d é m o n tre n t q u ’u n acide am in é b asiq u e est favorisé en position P3, m ais aussi q u ’u n e paire d ’arginines e n P2 e t PI re n d le su b stra t fo rtem e n t accessible au clivage. De plus, la séq u en ce d ’activation (RQAR-WGG) de la m a trip ta se n e constitue p as l’u n e de ses séqu en ces d e clivage optim ales. É tant d o n n é q u e l’activation de la m atriptase est u n processus autocatalytique, u n e telle séquence, n o n optim ale, p o u rrait perm ettre de restreindre so n activation. Pour l’hepsine, les résultats o b te n u s d é m o n tre n t q u ’elle p o ssè d e u n e préféren ce distincte p o u r u n e Leu/Tyr en P2 et u n e Arg en P3 et P4. En p o sitio n P I ’, le p e tit acide am iné Val est favorisé. Ces résultats sont com parables à ceux publiés au p arav an t p a r H erter et a l (2005). L’étude de la spécificité de DESC1 a révélé une préférence pour une Leu en position P2, u n e Arg/Ala/Leu en P3, u n e Arg en P4 et u n e Ala en P I ’. Ces résultats so n t différents de ceux publiés par H obson e t a l (2004), qui, en utilisant des substrats p-nitroanilides, o n t dém ontré q u e DESC1 est plus active sur des su b strats c o n te n a n t Ala e n P4 et P3, Pro en P2, suivi p a r des substrats co n ten an t Phe et Gly en P3 et P2 respectivem ent. Ces différences p eu v en t être causés par l’encom brem ent du groupe p-nitroanilide en position carboxyterm inal du site de clivage dans ces substrats, ce qui p o u rrait influencer l’efficacité de clivage.
4.1.2 Profils d’inhibition Afin de m ieux analyser les propriétés enzym atiques des TTSP, leur profil d ’inhibition a été déterm iné. Pour ce faire, le p ouvoir d ’in h ib itio n de divers in h ib iteu rs de p ro téase a été évalué sur les TTSP purifiées. Le pouvoir d ’inhibiteurs physiologiques de protéases à sérine, les serpines, a aussi été évalué. Ces inhibiteurs sont p our la m ajorité sécrétés et exercent leur action d an s la région extracellulaire. Les serp in es extracellulaires rég u len t en tre autres la
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cascade protéolytique responsable de la coagulation d u sang (antithrom bine III), la rép o n se inflam m atoire (ai-antitrypsine et ai-antichym otrypsine) et le rem odelage tissulaire (PAI-1). Des com plexes de la m atrip tase avec l'a n tith ro m b in e III (ATIII), l'a i-an titry p sin e (ai-AT) et l’a2 -antiplasm ine (a2-AP) o n t été observés d an s le lait h u m a in (Tseng e ta l., 2008) et la localisation de la m atriptase-2 et de l’h ep sin e au niveau des hépatocytes, lieu de synthèse principal de l’ai -antichym otrypsine (ax-ACT), l’ai -AT, l’a2-AP, d ’ATIII et de PAI-1 (plasm inogen activator inhibitor-1) (Lomas etal., 1992; Morgan etal., 2001; Stephens, Siddiqui et Hirs, 1987; Serrano etal., 2009; Williams, 1989), e n font des c an d id ats susceptibles d ’être in h ib és p a r ces inhibiteurs. De plus, DESC1 form e des com plexes d ’inhibition avec les serpines PAI-1 et PCI (protein C inhibitor) (H obson eta l., 2004). L’en sem b le d e ces d o n n é es suggère que les protéases de la famille des TTSP p euvent être des cibles physiologiques p o u r les serpines. Les profils d ’inhibition des TTSP étudiées co rresp o n d en t à ceux des protéases à sérine en général (tableau 2.1). C ependant, il est à rem arq u er que d an s les co n d itio n s utilisées, la m atriptase-2 ainsi q u e DESC1 p ré se n te n t u n e faible sensibilité envers la leu p ep tin e alors que la m atriptase et l’hepsine so n t plus fo rtem en t inhibés. Des études o n t d ém o n tré que la m atriptase-2 (Velasco e ta l, 2002) et DESC1 (H obson etal., 2004) peuvent être inhibés p ar la leupeptine, mais à des concentrations beaucoup plus fortes (80 pM et 50 pM respectivem ent) que celle utilisé dans nos essais (1 pM). Ces différences p euvent être expliquées p a r un e affi nité plus grande de la leupeptine pour la m atriptase et l’hepsine par rapport à la m atriptase-2 et DESC1. En p résence d ’inhibiteurs de la fam ille des serpines (tableau 2.2), seu le m e n t ATIII a dém ontré u n e activité d ’inhibition robuste. C ependant, la m atriptase-2 ainsi q u e l’h ep sin e et DESC1 sont aussi fortem ent inhibées en p résen ce de PAI-1 et de a 2 -AE Ces trois serpines p o ssèd en t u n e Arg en positio n P I de leur boucle réactive, ce qu i suggère q u e cet acide am iné à cette position est essentiel à u n e in h ib itio n forte des TTSP. L'absence d ’in h ib itio n des TTSP par ai-AT et a i-ACT est conform e à la spécificité Pl-A rg. C ependant, les résultats d ’inhibition de la m atrip tase p a r l’ai-AT et a2-AP diffèrent de ceux observés d a n s le lait h u m a in (Tseng et al., 2008). En effet, d an s le lait h u m ain , la m a trip tase a été retrouvée à l’intérieur de com plexes avec l’ai-AT e t l’a 2 -AP alors q u e n o s résultats p ré se n te n t au cu n e inhibition p o u r l’ai-AT et u n e très faible p o u r l’a 2 -AP. L’utilisation d a n s nos essais d ’u n e forme recom binante de la m atriptase com prenant seulem ent le dom aine catalytique pourrait expliquer cette différence, car les autres d om aines de l’enzym e p o u rraien t avoir u n im pact sur la reconnaissance de la serpine p o u r la m atriptase. L’ensem ble de ces résultats sont aussi en accord avec les publications qui suggèrent u n rôle d ’inhibition de l’activité des TTSP p ar les serpines (Szabo etal., 2005) e t su p p o rte n t aussi les d o n n ées qui d é m o n tre n t que DESC1 est dans la possibilité de form er des com plexes stables avec PAI-1 (H obson et al., 2004).
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4.2 Régulation fonctionnelle de la m atriptase-2 La m atriptase-2 est u n e p ro téase à sérin e p ré sen te à la surface cellulaire q u i jo u e u n rôle critique dans l’hom éostasie du fer par sa capacité à cliver l’hém ojuvéline à la m em brane plasm ique (Maxson etal., 2010). N orm alem ent, l’hém ojuvéline intacte s’associe avec le BMP pour contrôler l’expression d’hepcidine via u ne signalisation passant p ar les récepteurs BMPR couplés aux SMADs. Étant donné l’im portance de la m atriptase-2 à la surface cellulaire, des m écanism es de contrôle sont susceptibles d ’exister afin de réguler efficacem ent sa présence à cet endroit. Un p rem ier m écanism e a p réalab lem en t é té identifié, soit celui de son relargage à p a rtir de la surface cellulaire. Ce relargage sem ble être au to cataly tiq u e, car la p ré sen c e d ’u n d o m a in e catalytique fonctionnel est nécessaire pour son clivage au niveau du deuxièm e dom aine CUB, ce qui perm et de la libérer de la surface cellulaire (Stirnberg et a i, 2010). Dans cette étude, nous avons exploré la possibilité que le dom aine cytoplasm ique de la m atriptase-2 soit im pliqué dans u n nouveau m écanism e qui régule sa p résen ce à la surface cellulaire p ar l’internalisation.
4.2.1 Internalisation de la m atriptase-2 à partir de la surface cellulaire En utilisant u n e a p p ro ch e de biotinyiation des p ro téin es d e surface su r d es cel lules HEK293 su rexprim ant la m atriptase-2, n o u s avons observé q u ’u n e p ro p o rtio n de la m atriptase-2 biotinylée à la surface était protégée contre le clivage de la biotine p ar u n agent réducteur, le so d iu m 2-m ercap to éth an esu lfo n ate (MesNa) (figure 3.1A). C ette ob serv atio n suggère que la protection de la m atriptase-2 p o u rrait être causée p ar son entrée à l’in térieu r de la cellule, ce qui lui p erm ettrait de n e pas être exposée au MesNa. C ette hypothèse a été vérifiée e n reg ard an t d a n s différents m o d èles cellulaires si la m atriptase-2 m arquée à la surface cellulaire pouvait se retrouver à l’intérieur de la cellule. En utilisant un m odèle de surexpression dans des cellules HEK293 et deux m odèles d ’expression endogène de la m atriptase-2 ; les cellules d ’origines hépatiques, les HepG2 et les hépatocytes prim aires h um ains ; nous avons observé la fo rm atio n de vésicules c o n te n a n t la m atrip tase2 à l’in térieur de la cellule (figure 3.1B-D). C ette o b serv atio n p erm et d e co n firm er q u e la m atriptase-2 est internalisée à partir de la surface cellulaire. Nous d ém o n tro n s donc, p o u r la prem ière fois, que la m atrip tase-2 est in tern alisée à partir de la surface cellulaire. L’internalisation est u n m écanism e bien co nnu de régulation des récepteurs couplés aux protéines G en jo u a n t u n rôle im p o rtan t dans leur désensibilisation et dans leur signalisation (Posner et Laporte, 2010). C ependant, l’internalisation de protéases ancrées à la m em brane et ses conséquences n’ont pas été étudiées en profondeur. Un exemple
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de ce type de p ro téase est la M T1-M MP (M em brane type 1 m atrix m etalloproteinase), u n e m étalloprotéase transm em branaire de type I qui est im pliquée dans la clivage de protéines de la m atrice extracellulaire (Osenkowski, Toth et Fridm an, 2004). Finalem ent, il a été d ém ontré ré c em m e n t q u ’u n autre m em b re d es p ro téases à sérine tra n sm em b ran a ire s de type II, la m atriptase, s'accum ule dans des structures intracellulaires (Friis etal., 2011), renforçant ainsi la notion que ces protéines subissent u n trafic dynam ique.
4.2.2 Caractérisation de la voie d’internalisation de la m atriptase-2 Il existe u n e m ultitu d e de voies d ’en d o cy to se possibles (figure 4.1). É tan t d o n n é que l’endocytose m édiée par la dynam ine est fréq u em m en t im pliquée d a n s l’in tern alisatio n de pro téin es de surface (Kumari, Mg et Mayor, 2010), n o u s avons vérifié la possibilité d e son im plication dans l’endocytose de la m atriptase-2. En utilisant u n m u ta n t d o m in an t-n ég atif de la dynamine-1 (dynamine-1 K44A) qui abroge son activité (Damke etal., 1994), nous avons d é m o n tré q u ’e n c otran sfectan t ce m u ta n t avec la m atrip tase-2 d a n s des cellules HEK293, l’internalisation de la protéase est bloquée (figure 3.2A). En utilisant u n m odèle cellulaire qui exprim e de façon endogène la m atriptase-2 (HepG2), lorsque le m u tan t K44A de la dynam ine est exprimé, l’internalisation de la m atriptase-2 est aussi bloquée. Ces résultats d ém o n tren t que la dynam ine-1 est im pliquée d an s l’internalisation de la m atriptase-2. L’endocytose m édiée p ar la dynam ine-1 p e u t se faire p ar la fo rm atio n de vésicules recouvertes de clathrines, de cavéolines o u d e façon in d é p en d a n te de ces d eu x p ro téin es (Kumari, Mg et Mayor, 2010). Afin d ’identifier lequel de ces types de vésicules était im pliqué dans l’endocytose de la m atriptase-2, n o u s avons étudié sa localisation en m icroscopie confocale avec des m arqueurs identifiant la clathrine ou la cavéoline. Ces résultats o n t perm is d ’observer une colocalisation de la m atriptase-2 avec la clathrine (figure 3.2B) m ais p as avec la cavéoline (figure 3.SF2). La fo rm atio n des vésicules de clathrines n écessite la p résen ce de p rotéine adaptatrice com m e la /32-adaptine. Les résu ltats de m icroscopie confocale o n t perm is d ’observer u n e colocalisation de la m atriptase-2 avec cette p ro téin e (figure 3.2B). La figure 4.2 représente la form ation des vésicules d ’internalisation de la m atriptase-2. Afin de déterm iner la nature des com partim ents cellulaires dans lesquels la m atriptase2 transite p a r la suite, n o u s avons fait u n d o u b le m arq u ag e de la m a trip ta se-2 avec u n m a rq u e u r d ’en d o so m e précoce, la p ro té in e EEA1 {Early endosom e antigen 1) (figure 3.2B). Les résultats obten u s nous ont perm is de colocaliser la m atriptase-2 avec EEA1 a u ta n t chez les cellules HEK293 transfectées que chez les hépatocytes prim aires hum ains, ce qui suggère que la m atriptase-2 transite p ar les en d o so m es précoces. Pour te rm in e r l'étu d e de la voie d ’in tern alisatio n de la m atrip tase-2 , n o u s avons observé en utilisant un m arqueur des lysosomes, la protéine lysosomale LAMP-2 (Lysosomalassociated m em brane protein 2), q u e la m atrip tase-2 colocalise avec ce m a rq u e u r après 6
90
Endocytose dépendante de la clathrine
Endocytose dépendante de la cavéoline
Endocytose indépendante de la dathrine et de la cavéoline
Cavéosome
O • ■ ■■
Endosome précoce
Dynamine-1 Cavéoline p 2 -adaptine Clathrine
F ig u r e 4.1
Principales voies d ’endocytose Plusieurs voies existent afin d’assurer l’internalisation de protéines à partir de la membrane plasmique. heures d ’internalisation a u ta n t chez des cellules HEK293 transfectées que chez les h é p a to cytes prim aires h um ains (figure 3.2C). Pris ensem ble, nos résultats suggèrent que la m atriptase-2 transite p ar les endosom es précoces via des vésicules de clathrines d ’une façon d ép en d an te de la dynam ine-1. Au final, la m atriptase-2 se retrouve auxlysosom es où elle est dégradée (figure 4.3). D ’autres protéases u tilisan t des voies d ’in tern alisatio n com parables à celle de la m atriptase-2 ont aussi été identifiées. Par exemple, MT1-MMP subit u n e endocytose d ép en d an te de la dynam ine qui utilise des voies n écessitan t la clathrine et la cavéoline (Remacle, M urphy et Roghi, 2003).
4 .2 .3 D é te r m in a n ts im p liq u é s d a n s l’in te r n a lis a tio n
Afin d ’identifier les d é term in a n ts m oléculaires im pliqués dans l’in tern alisatio n de la m atriptase-2, nous avons construit des m u tan ts p en ta-alan in es couvrant la qu eu e cytoplas-
O Dynamine-1 ■ (32-adaptine ■ ■ Clathrine
F ig u r e 4 .2
Form ation des vésicules d ’internalisation de la m atriptase-2 L’internalisation de la matriptase-2 s’effectue à l’intérieur de vésicules à clathrine et nécessite la dynamine-1 ainsi que la protéine adaptatrice ^-adaptine. m ique entière (52 acides aminés) (figure 3.3A). En exprim ant ces différents m utants dans des cellules HEK293 et en observant leur internalisation p ar m icroscopie confocale (figure 3.3B), nous observons que deux m u ta n ts (2-6 et 7-11) e m p êc h e n t la m atrip tase-2 d ’internaliser. De plus, ces m êm es m utants sont davantage relargués de la surface cellulaire, ce qui perm et d ’observer une recrudescence d ’activité catalytique associée à cet enzym e d an s le m ilieu (figure 3.3C-D). Ces m utants laissent suggérer que la région 2-11 contient des d éterm inants essentiels à l’internalisation et lorsque ceux-ci ne sont pas présent, l'enzym e s’accum ule à la surface cellulaire, ce qui favorise son relargage. L’analyse de la région 2-11 à l’aide de m utants alanines pour chacun des acides am inés a perm is d ’identifier ceux indisp en sab les à l’in tern alisatio n de la m atrip tase-2 (figure 3.4). En p re n a n t la m êm e ap p ro ch e q u e celle utilisée p o u r les m u ta n ts p e n ta -alanines, cinq des dix acides am inés (L2A, L3A, F5A, S7A et K8A) de cette région so n t im pliqués dans l’internalisation, car lorsqu’ils sont m utés, l’internalisation est bloquée. Chez la m atriptase-2 m urine, l’absence de trois de ces acides am inés essentiels (Leu2, Leu3 e t Phe5) (Annexe A, figure A.1A) font en sorte q u ’elle est in cap ab le d ’in tern aliser (Annexe A, figure A.1B). Cette différence m ajeure laisse croire que la capacité d ’internalisation de la m atriptase-2 n’est pas présente chez toutes les espèces.
92
O Endocytose
O Lysosome
0 Vésicule à clathrine 0 Endosome précoce
F ig u r e 4.3
Différentes étapes du processus d 'in tern alisatio n de la m atriptase-2 La matriptase-2 est internalisée à partir de la surface cellulaire (1) et se retrouve à l’intérieur de vésicules à clathrine (2). La matriptase-2 transite ensuite par des endosomes précoces (3) avant de se retrouver au niveau des lysosomes où elle sera dégradée (4). Il est in téressant d ’observer que la q u eu e cytoplasm ique de la m atrip tase-2 possède u n m otif dileucine (Leu2 et Leu3). Ces m otifs so n t so u v en t des d éterm in an ts trouvés chez les protéines p résen tes à la surface cellulaire e t qui so n t internalisées. Ils o n t été identifiés com m e signal d ’endocytose en p a ssa n t p ar l’in teractio n avec la p ro téin e ad ap tatrice AP-2 (Bonifacino et Traub, 2003). C ependant, le m otif dileucine trouvé chez la m atriptase-2 semble atypique par rapport à la séquence canonique (D/E)XXXL(L/I) par l’absence du résidu acide. C ependant, nos résultats sont com patibles avec les découvertes récen tes qui d é m o n tre n t q u e les m otifs dileucines seuls p eu v en t agir co m m e signal d ’in tern alisatio n (Kozik e t al., 2010). Plusieurs protéines avec u n tel m otif p résen ten t aussi tone absence du résidu acide en position -4, mais utilise un autre résidu hydrophile en aval du m otif dileucine (LLXXXS pour la m atriptase-2) (Bonifacino et Traub, 2003). Parmi les acides am inés nécessaires à l’internalisation, Ser7 possède le potentiel d ’être phosphorylée. D ans ce cas, son état de p h o sp h o ry latio n p o u rrait in fluencer sa capacité d’internalisation. Par exemple, la furine, une protéase à sérine transm em branaire de type I, possède une queue cytoplasm ique dont l’état de phosphorylation joue u n rôle im portant dans sa localisation cellulaire (Jones etal., 1995). Ser7 fait p artie d ’u n m otif de p h o sphorylation
93
potentiel par la protéine kinase C (figure 1.14} et la m atriptase-2 possède au m oins une sérine phosphorylée (Annexe A, figure A.2), ce qui laisse croire que cet acide am iné a de forte chance d ’être phosphorylé. Il serait in téressan t d e vérifier so n état d e p h o sp h o ry latio n et, d a n s ce cas, si cet état p e u t influencer sa capacité d ’internalisation.
4.2.4 Impact de la perte d’internalisation de la m atriptase-2 sur sa fonction La p résen ce de la m atriptase-2 à la surface cellulaire est essentielle à sa fo n ctio n catalytique sur rhém ojuvéline, ce qui p e rm e t d ’assu rer la régulation de l’expression de l’hepcidine. N ous avons m o n tré, e n c o tra n sfec ta n t des cellules HEK293 avec les m u ta n ts alanines individuels et l’hém ojuvéline, que la m atriptase-2 n on-internalisée clive davantage l’hém ojuvéline à la surface cellulaire (figure 3.5A). C ette a u g m en tatio n d e clivage a aussi p o u r effet d ’abaisser la q u a n tité d ’h ep cid in e exprim ée (figure 3.5B). Les m êm es effets sur l'hep cid in e sont aussi observables lo rsq u e l’in te rn a lisatio n de la m atrip tase-2 est b lo q u ée dans un m odèle celllulaire d ’expression endogène (figure 3.5C).
4.3 Spécificité enzym atique et internalisation de la m atriptase-2 dans la régulation de sa fonction L’identification des différences q u i d istin g u e n t la spécificité d e la m a trip ta se-2 des autres TTSP p e rm e t u n m eilleur ciblage p o u r le d év elo p p em en t d ’in h ib iteu rs spécifiques p o u r cet enzym e. L’utilisation de tels in h ib iteu rs p e rm e ttra it de restrein d re le clivage de l’hém ojuvéline et ainsi favoriser l’expression de l’hepcidine, ce qui au ra p o u r co n séq u en ce de d im in u er les qu an tités de fer en circulation d a n s l’organism e (figure 4.4). U ne telle dim inution serait favorable au traitem en t de surcharge en fer causée p ar certaines m aladies com m e l’hém ochrom atose. D ans cette m aladie, u n e m u ta tio n du gène HFE e m p êc h e la protéine p o u r laquelle il code de s’associer à TfR2, u n e action nécessaire au d éclen ch em en t de l’expression de l’hepcidine (figure 4.4) (Babitt et Lin, 2011). En in h ib a n t la m a trip ta se2, la h ausse d ’expression occasionnée p e rm e ttra it d e co m p en ser la p e rte p ro v e n a n t de la m u tation de HFE p o u r ainsi rétablir les niveaux no rm au x de fer. La possibilité de m oduler la p résen ce de la m atrip tase-2 à la surface cellulaire co n sti tuerait u n e seconde alternative p o u r rétablir les niveaux de fer à la n o rm ale (figure 4.4). En effet, la possibilité de stim uler l’in tern alisatio n de la m atriptase-2 favoriserait l’expression de l’hepcidine en d im in u a n t le clivage de l’hém ojuvéline à la surface cellulaire. De plus, la capacité à dim inuer la vitesse d ’in tern alisatio n favoriserait u n e d im in u tio n de l’expression de l’hepcidine et p o u rrait ainsi servir au tra ite m e n t d e p a tie n ts souffrant d ’u n e an ém ie de type IRIDA possédant u n e m u tatio n de la m atriptase-2 la re n d a n t m oins active.
BMPR-II
GPif
mm y ic « o tO f t > . -»-'• •
4
/Matriptase-2\
ff
BMPR-I
V
8MAD4
Hepcidine
F ig u r e 4 .4
M odulation de la m atriptase-2 d an s le contrôle des niveaux d ’hepcidine La transcription de BMP6 est activée par une augmentation du fer intracellulaire au niveau des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques. Le co-récepteur du BMP spécifique aux hépatocytes, l’hémojuvéline (HJV), se lie aux récepteurs I et II du BMP (BMPRI-II) en présence du ligand BMP6. La formation de ce complexe à la membrane plasmique des hépatocytes active la phosphorylation de SMAD1/5/8 et favorise son interaction avec SMAD4. Le complexe SMAD est transloqué vers le noyau et active la transcription du gène HAMP qui code pour l’hepcidine. La matriptase-2, à la surface cellulaire, peut cliver HJV et ainsi prévenir la formation du complexe HJV/BMP6/BMPR, agissant ainsi comme régulateur négatif de la voie d’expression de l’hepcidine. La présence de la matriptase-2 à la surface cellulaire peut être régulée par un relargage de la surface cellulaire ou par l’internalisation. La transcription de l’hepcidine peut aussi être activée par l’interaction de HFE avec TfR2 par un mécanisme non encore totalement élucidé. Les complexes HFE-TfRl présents à la surface cellulaire perm ettent de monitorer la saturation en fer de la transferrine (Fe-Tf), À une faible saturation en fer de la transferrine, HFE est séquestré par TfRl et lorsque qu’elle augmente, HFE est délogé de TfRl et peut alors interagir avec TfR2. Afin de contrôler les niveaux d’hepcidine, la modulation de l’action catalytique de la matriptase-2 à la surface cellulaire constitue une approche thérapeutique potentielle (régions en évidence). L’utilisation d’inhibiteurs de la matriptase-2 ainsi que la capacité à favoriser son internalisation permettraient de favoriser l’expression de l’hepcidine alors que son blocage favoriserait une réduction. (+) représente les actions favorisant l’expression de l’hepcidine et (-) celles avec des effets régulateurs négatifs.
C o n c l u s io n
Les résultats présentés dans cette thèse ont m is en évidence la spécificité enzym atique de la m atriptase-2 ainsi q u ’un nouveau m écanism e p e rm e tta n t sa régulation fonctionnelle. En prem ier lieu, nous avons établi la spécificité de la m atriptase-2 à l’aide de substrats IQF to u t en la co m p aran t à trois autres p ro téases à sérine tran sm em b ran aires de type II, la m atriptase, l’h ep sin e et DESC1. Les résu ltats o b te n u s d é m o n tre n t q u e la m atrip tase-2 est celle qui présen te la spécificité la plus large et est aussi la seule qui p ré sen te une inhibition par le substrat p our certains d ’entre eux. N ous avons aussi d é m o n tré q ue la m atrip tase-2 p résen te à la surface cellulaire subit u n e in ternalisation constitutive. Elle est in tern alisée d an s des vésicules c o n te n a n t de la clathrine et AP-2 via u n processus d é p e n d a n t de la dynam ine. La m atrip tase-2 en docytée transite p ar la suite dans les endosom es précoces puis les lysosom es. L’in tern alisatio n de la m atriptase-2 est dépendante de certains résidus spécifiques co n ten u s dans la région am inoterm inale de son dom aine cytoplasm ique, car la m utagénèse dirigée de ces résidus em pêche l’in tern alisatio n et retient l’enzym e à la surface cellulaire. Les cellules qui coex p rim en t ces m u ta n ts et l’hém ojuvéline p ro d u ise n t des niveaux d ’h ep cid in e fo rtem e n t d im inués com paré à la m atriptase-2 de type sauvage, car l’hém ojuvéline est d av an tag e clivée à la surface cellulaire p a r les m u ta n ts de la m atriptase-2. Nos résultats d é m o n tre n t q u e la m atrip tase-2 po ssèd e u n e p référen ce de su b strats distincte des trois autres m em bres de la famille des TTSP et soulignent p o u r la prem ière fois l'im p o rtan ce du trafic de la m atrip tase-2 à la m e m b ra n e p lasm iq u e d a n s la régulation de l’expression de l’hepcidine, u n év én em en t essentiel à l'hom éostasie d u fer.
R e m e r c ie m e n t s De nom b reu ses p erso n n es o n t c o n trib u é à l’a b o u tisse m e n t de ce travail et d o n t l’im plication et le soutien m ériten t d ’être soulignés. Je tiens tout d ’abord à rem ercier m on directeur de thèse, Dr. Richard Leduc, de m ’avoir accueilli d an s son laboratoire. R ichard a to u jo u rs a p p o rté so n so u tien à la réalisation de ce travail ta n t en p ro p o sa n t de n o m b re u ses idées q u ’en p o u ssa n t ses é tu d ia n ts à devenir de m eilleur chercheur. M erci d ’avoir m is à m a d isp o sitio n to u t le m eilleu r nécessaire à l’accom plissem ent de ce travail ainsi que p o u r tes conseils e t to n souci de la rigueur dans le travail. Je tiens aussi à rem ercier m o n collègue A ntoine D ésilets p o u r l’a p p o rt de ces idées et sa collaboration précieuse à la réalisation de ce travail. M erci p o u r to u s tes conseils et to n amitié. Je rem ercie aussi tous m es collègues p ré sen ts et passés p o u r leu r co llab o ratio n dans m es d ém arches scientifiques ainsi q u e p o u r leur am itié. M erci Jean-M ichel, Brian, Philip, Nicolas, Cédric, Xavier, Élie, Éloic, C hristophe, Hajar, Kelly e t Patrice p o u r avoir agrém enté ces années de travail. Je tiens aussi à rem ercier la Dre. M anuela Santos d u d é p a rte m e n t de m éd ecin e de l’U niversité de M ontréal, le Dr. Sim on Labbé d u d é p a rte m e n t de b io ch im ie ainsi q u e le Dr. Jean-Bernard D enault du départem ent de pharm acologie de l’Université de Sherbrooke pour avoir accepté de participer à la correction de cette thèse. Je rem ercie aussi m on frère, Éric, sans qui je n'aurais p ro b a b le m en t jam ais découvert Sherbrooke, pour son soutient et son am itié au cours de ces années.
B iblio g r a ph ie
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Annexe A
A. 1 Internalisation de la m atriptase-2 hum aine et m urine
A Humain — m £ £ e £ h I k £ > ' f v a e a ? q v a g g q 3 e G 3 d g e e - a e p e 3 k e k a c e d s k r : < a e g e l e SOUriS
M P R C F Q : P C S T ?.y .?T T E V P ;A A D 3 Q G E A C -D G E E A A E ? E G K F K P P K N T K R K N F D Y V ?
B Ç fG
E 3
Figure A.1 La m atriptase-2 m urine n ’est pas internalisée (A) Alignement des séquences humaine et murine de la matriptase-2. Les flèches indiquent les acides aminés impliqués dans l’intemalisation de la forme hum aine et les caractères rouges, les acides aminés conservés. (B) Microscopie confocale de cellules HEK293 transfectées avec la matriptase-2/V5 humaine ou murine. La matriptase-2 a été marquée à la surface sur glace avec un anticorps contre V5 et fixée immédiatement (0 min) ou après 30 minutes d ’incubation à 37 °C. L’immunofluorescence correspondant à l’anti-V5 est représentée en vert alors que les noyaux colorés au Hoechst sont représentés en bleu. Échelle : 50 pm.
110
A.2 Phosphorylation de la m atriptase-2 _______ IP Matriptase-2
V5
-
V5___________ Extrait brut + +
kDa
150100-
75150100-
75Figure A.2 La m atriptase-2 est co nstitutivem ent phosphorylée Des cellules HEK293 ont été transitoirement transfectées avec pcDNA6/V5 (-) ou avec un plasmide codant pour la matriptse-2/V5 (+). 24 heures après la transfection, les cellules ont été lysées et la matriptase-2 a été immunoprécipitée en utilisant un anticorps contre V5 (IP V5). Les protéines immunoprécipitées ont été chargées sur gel SDS-PAGE 10 % puis la présence de la matriptase-2 a été vérifiée par immunobuvardage en utilisant un anticorps contre V5 (panneau du haut) et sa forme phosphorylée a été détectée en utilisant un anticorps contre les phosphosérines (panneau du bas). L’extrait brut a été chargé sur gel afin de vérifier l’efficacité de transfection.
A nnexe B
B .l Liste des publications BÉLIVEAU, F., BRÛLÉ, C., DÉSILETS, A., ZIMMERMAN, B., LAPORTE, S. A., LAVOIE, C. L., LEDUC, R. (2011) Essential role of endocytosis of the type II transm em brane serine pro tease TMPRSS6 in regulating its functionality, J. Biol. Chem 286 : 29035-43-26. BÉLIVEAU, F., DÉSILETS, A., LEDUC, R. (2009) Probing the substrate specificity of m atriptase, m atriptase-2, h epsin a n d DESC1 w ith internally q u e n c h e d fluorescent peptides. FEBS J. 276:2213-26. DÉSILETS, A., BÉLIVEAU, F., VANDAL, G„ McDUFF, F-O., LAVIGNE, P., LEDUC, R. (2008) M utation G827R in m atriptase causing au to so m al recessive ichtyosis w ith hypotrichosis yields an inactive protease. J. Biol. Chem 283 :10535-42.
B.2 Liste des com m unications BÉLIVEAU, F., BRÛLÉ, C., DÉSILETS, A., ZIMMERMAN, B., LAPORTE, S. A., LAVOIE, C. L„ LEDUC, R. Essential role of endocytosis o f th e type II tra n sm e m b ra n e serin e p ro tease TMPRSS6 in regulating its functionality, 7e congrès général de l’In tern atio n al Proteolysis Society (IPS), 16-20 octobre 2011, San Diego, Californie, États-Unis. BÉLIVEAU, E, BRÛLÉ, C., DÉSILETS, A., ZIMMERMAN, B., LAPORTE, S. A., LAVOIE, C. L., LEDUC, R. TMPRSS6 : Cible th érap eu tiq u e p otentielle p o u r les tra ite m e n ts de désordres en fer? l ere journée scientifique d u Réseau Q uébécois de Recherche su r les M édicam ents (RQRM), 3 juin 2011, Université de M ontréal, M ontréal, Q uébec, C anada. BÉLIVEAU, F., DÉSILETS, A., LEDUC, R. B iosynthetic regulation o f m atrip tase-2 by its cytoplasmic dom ain, 6e congrès général de l’International Proteolysis Society (IPS), 26-30 octobre 2009, Surfers Paradise, Q ueensland, Australie. BÉLIVEAU, F., DÉSILETS, A., FRAPPIER, V., LEDUC, R. C aractérisatio n b io ch im iq u e des m u tan ts de la m atriptase-2 associées à l’aném ie de type IRIDA, l ère édition de la Journée Phare, 29 janvier 2009, Sherbrooke, Québec, Canada. BÉLIVEAU, F., DÉSILETS, A., LEDUC, R. Purification an d enzym atic ch aracterizatio n of m atriptase, hepsin an d DESC1 reveals significant differences in su b strate specificity, 5e congrès général de l’In tern atio n al Proteolysis Society (IPS), 20-24 octo b re 2007, Patras, Grèce DÉSILETS, A., BÉLIVEAU, F., VANDAL, G., McDUFF, F-O., LAVIGNE, P., LEDUC, R. M utation G827R in m atriptase causing au to so m al recessive ichtyosis w ith h y p o trich o sis yields an inactive protease, 5e congrès général de l’In tern atio n al Proteolysis Society (IPS), 20-24 octobre 2004, Patras, Grèce.